蓬蘽懸鉤子組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)

陳曉丹　李愛(ài)民　張正海

摘要：以蓬蘽懸鉤子的帶腋芽嫩莖段為外植體，建立組織培養(yǎng)再生體系。結(jié)果表明：適宜腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，誘導(dǎo)率可達(dá)86.7%；適宜增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；適宜生根培養(yǎng)基為改良的1/2MS+0.1 mg/L NAA；適宜煉苗時(shí)間為7 d，移栽成活率可達(dá)98%；以6月中旬移栽到大田的當(dāng)年苗木生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)最佳。

關(guān)鍵詞：蓬蘽懸鉤子；初代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)；根誘導(dǎo)；移栽

中圖分類號(hào)： S663.204+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0074-02

蓬蘽懸鉤子（Rubus crataegifolius Bunge）為薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）植物，別稱托盤(pán)兒、覆盆子等，是我國(guó)長(zhǎng)白山區(qū)分布量較大的野生樹(shù)莓種質(zhì)資源。蓬蘽懸鉤子抗寒性強(qiáng)，果實(shí)品質(zhì)好、營(yíng)養(yǎng)豐富[1]，且根、莖、葉、果均可入藥[2-3]，開(kāi)發(fā)利用前景廣闊。2013年以來(lái)，筆者在系統(tǒng)開(kāi)展蓬蘽懸鉤子野生馴化研究的同時(shí)，進(jìn)行組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，以期為優(yōu)良種質(zhì)資源快速高效利用、建立我國(guó)寒地特色樹(shù)莓產(chǎn)區(qū)、實(shí)現(xiàn)栽培良種化和生產(chǎn)規(guī)范化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料（嫩莖）取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)基地（吉林市昌邑區(qū)左家鎮(zhèn)）蓬蘽懸鉤子栽培試驗(yàn)園。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 啟動(dòng)培養(yǎng) 在5月中下旬，選擇生長(zhǎng)健壯且無(wú)病蟲(chóng)害的蓬蘽懸鉤子單株，剪取嫩梢。在室內(nèi)剪去嫩梢葉片，剪成 2 cm 左右的帶芽莖段。莖段用適當(dāng)濃度洗衣粉液浸泡 20 min，自來(lái)水沖洗12 h后接種。接種前先用75%乙醇消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3次，再以0.1% HgCl2溶液處理10 min，用無(wú)菌水沖洗4～5次。將消毒莖段上下部切去少許，分別接種于B5、MS、改良的1/2MS（大量元素、微量元素、鐵鹽和肌醇均減半）和改良的1/4MS（大量元素、微量元素、鐵鹽和肌醇均減為正常量的1/4）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（以上培養(yǎng)基均附加0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA），每個(gè)處理接種20瓶，每瓶3個(gè)莖段。接種后，每周觀察外植體生長(zhǎng)狀況，2周后統(tǒng)計(jì)側(cè)芽萌動(dòng)情況，計(jì)算萌發(fā)率。

萌芽率=萌芽數(shù)/接種數(shù)×100%

；

平均萌芽數(shù)=萌芽總數(shù)/接種數(shù)

。

1.2.2 繼代培養(yǎng) 將啟動(dòng)培養(yǎng)中獲得的無(wú)菌芽苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)。以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)處理接種10瓶（每瓶4個(gè)外植體），50 d后觀察芽的分化和生長(zhǎng)狀況，并統(tǒng)計(jì)分析各處理芽的增殖倍數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng) 將繼代培養(yǎng)得到的大量增殖苗分離后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)以改良的1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 mg/L），每種培養(yǎng)基接種15瓶（每瓶3株無(wú)根苗），接種30 d后，觀察試管苗生根和苗木生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)生根率、平均生根數(shù)和平均根長(zhǎng)。 相關(guān)公式為：生根率=生根苗數(shù)/接種數(shù)×100%；平均生根數(shù)=總根數(shù)/生根苗數(shù)；平均根長(zhǎng)=根的總長(zhǎng)度/總生根數(shù)。

1.2.4 煉苗移栽 當(dāng)根長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，將通過(guò)生根培養(yǎng)得到的生根苗分別進(jìn)行3、7、10 d煉苗，然后以細(xì)河沙與腐殖土按1 ∶ 3的比例混合作為移栽基質(zhì)，在移栽前1 d用0.2%高錳酸鉀溶液消毒基質(zhì)并覆膜24 h，并加強(qiáng)移栽后的環(huán)境調(diào)控，以期獲得較高的移栽成活率。

1.2.5 當(dāng)年苗木生長(zhǎng)發(fā)育狀況調(diào)查 分別于5月中旬、6月中旬和7月中旬將移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中的小苗進(jìn)行圃地栽培，并于5個(gè)月后，即生長(zhǎng)期結(jié)束后，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育情況進(jìn)行調(diào)查分析。相關(guān)公式為：平均分蘗數(shù)=總分蘗數(shù)/總苗數(shù)；平均莖粗=總莖粗/總苗數(shù)；平均生長(zhǎng)高度=生長(zhǎng)高度總和/總苗數(shù)；平均成熟高度=主干的平均生長(zhǎng)高度-主干梢部枯死的平均長(zhǎng)度。

1.3 培養(yǎng)條件

在以上培養(yǎng)基中加3%蔗糖、0.5%瓊脂，調(diào)節(jié)pH值為58～6.0。培養(yǎng)條件：溫度為（25±3）℃，光照度為1 000～2 000 lx，光—暗周期為14 h—10 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)

表1試驗(yàn)結(jié)果表明，不同的基本培養(yǎng)基中外植體的萌芽率差異顯著，其中基本培養(yǎng)基以MS對(duì)蓬蘽懸鉤子嫩莖的誘導(dǎo)效果最好，接種3 d后就開(kāi)始啟動(dòng)萌發(fā)，培養(yǎng) 20 d 時(shí)萌芽率達(dá)到86.7%，外植體在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，葉大嫩綠，芽體較高；其次是改良的1/2MS、1/4MS，培養(yǎng)20 d時(shí)萌芽率分別達(dá)到66.7%、60.0%，外植體生長(zhǎng)一般，葉梢小且偏黃綠色，芽體略矮小。而在B5培養(yǎng)基上，一方面外植體發(fā)生的褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，另一方面接種5 d后才開(kāi)始緩慢萌發(fā)且萌芽率很低，只有28.5%，此外芽體很小，呈黃綠色。綜合以上分析可知，蓬蘽懸鉤子初代培養(yǎng)以MS作為基本培養(yǎng)基為宜。

2.2 增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)得到的萌發(fā)芽體接種到增殖培養(yǎng)基中后，圍繞芽體這一中心，都能分化出一定數(shù)量的不定芽。6-BA、NAA不同濃度組合的增殖倍數(shù)之間存在顯著性差異，因?yàn)?-BA、NAA 2種激素與芽體增殖密切相關(guān)，激素的絕對(duì)濃度和搭配比例對(duì)組培苗的增殖有很大的影響。當(dāng)6-BA濃度為 1.0 mg/L、NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)最高，可達(dá) 33.14；當(dāng)6-BA濃度為1.5 mg/L、NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)次之，為32.85。這2個(gè)處理（即處理5、處理7）的增殖倍數(shù)沒(méi)有顯著差異（表2）。因此，適宜蓬蘽懸鉤子的增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

2.3 根的誘導(dǎo)

不同濃度的NAA與蓬蘽懸鉤子無(wú)根苗生根率均有密切關(guān)系，在9種培養(yǎng)基中都能誘導(dǎo)生根，即在生根培養(yǎng)基中不添加生長(zhǎng)素也可生根。當(dāng)NAA濃度為0.05、0.10 mg/L時(shí)，平均生根數(shù)之間差異不顯著，但平均根長(zhǎng)差異顯著。當(dāng)NAA濃度大于0.15 mg/L時(shí)，組培苗基部膨大產(chǎn)生愈傷組織塊，植株矮小，葉片黃化，不適于移栽。根數(shù)越多，根長(zhǎng)適宜且粗壯的，移栽成活率高（表3）。因此綜合考慮，在改良的1/2MS培養(yǎng)基中，NAA濃度在0～0.10 mg/L范圍內(nèi)，幼苗生根數(shù)隨著NAA濃度升高而增加；當(dāng)NAA濃度大于0.10 mg/L時(shí)，生根數(shù)反而隨著NAA濃度的升高而減少；蓬蘽懸鉤子適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.10～0.15 mg/L。

2.4 煉苗移栽

組培苗長(zhǎng)期生長(zhǎng)在光照、溫度和濕度等相對(duì)適宜和穩(wěn)定的環(huán)境中，體表幾乎沒(méi)有什么保護(hù)組織，如果直接移栽到外界環(huán)境中，因其本身適應(yīng)性差，再加上環(huán)境變化較大，很難成活。因此需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)摹盁捗纭?，使其能逐步適應(yīng)外界的環(huán)境變化，提高成活率。不同的煉苗時(shí)間處理下組培苗的移栽成活率差異顯著。當(dāng)煉苗時(shí)間為3 d時(shí)，可能由于組培苗木質(zhì)化程度低，仍處于“異養(yǎng)”狀態(tài)，因此較難適應(yīng)瓶外的環(huán)境，從而使成活率大大降低；當(dāng)煉苗時(shí)間為10 d時(shí)，組培苗雖然已經(jīng)達(dá)到“異養(yǎng)”狀態(tài)，但是培養(yǎng)基已受到外界有菌環(huán)境的污染，且根部培養(yǎng)基干燥，較難清洗干凈，殘留的營(yíng)養(yǎng)容易引起移栽苗爛根死亡，使成活率降低；而煉苗時(shí)間為7 d時(shí)，組培苗已經(jīng)完成馴化且培養(yǎng)基較易清洗干凈，移栽苗的成活率最高，可達(dá)98%（表4）。

2.5 當(dāng)年苗木生長(zhǎng)發(fā)育狀況調(diào)查

只有將組培苗進(jìn)行圃地栽培，才能達(dá)到苗木繁育的最終目的。5月中旬將苗移栽到大地，此時(shí)氣溫和地溫等均較低，不利于根系的生長(zhǎng)；6月中旬氣溫和地溫都有所上升，苗木生長(zhǎng)較好；而7月中旬移栽苗木時(shí)，苗的整體生長(zhǎng)期大大縮減。因此從平均分蘗數(shù)、平均莖粗、平均成熟高度、平均生長(zhǎng)高度等幾個(gè)方面綜合考慮，組培苗進(jìn)行圃地栽培時(shí)，以6月中旬移栽入大地較為適宜（表5）。

3 結(jié)論與討論

本研究以蓬蘽懸鉤子嫩梢為試驗(yàn)材料，將帶腋芽莖段用75%乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒10 min，最后，接種到MS培養(yǎng)基上。最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，其次為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；進(jìn)行壯苗培養(yǎng)時(shí)，最適宜的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA或者M(jìn)S+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；瓶?jī)?nèi)生根最適培養(yǎng)基為改良的1/2MS+010～0.15 mg/L NAA，生根率為100%，平均根數(shù)最多可達(dá)11.21條/株，平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)可達(dá)4.86 cm，根粗健壯。對(duì)組培苗當(dāng)年植株生長(zhǎng)發(fā)育情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，以6月中旬移栽到大田的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)最佳。

蓬蘽懸鉤子因其具有較高營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，日益受到人們的青睞，對(duì)其進(jìn)行組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，可實(shí)現(xiàn)野生資源的最大化利用。本研究以蓬蘽懸鉤子帶腋芽莖段為試材，采用不同培養(yǎng)基、植物激素及其濃度組合，建立了穩(wěn)定的離體快繁體系，為今后組培苗的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)指導(dǎo)，更重要的是可對(duì)優(yōu)質(zhì)品種的推廣利用提供經(jīng)驗(yàn)借鑒。

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