劉君　李東　曾林

摘要：運(yùn)用ISSR標(biāo)記對(duì)8種辣椒進(jìn)行了遺傳多樣性的研究。用30條ISSR引物進(jìn)行篩選，有21條可擴(kuò)增出清晰可辨條帶，而這21條引物在8種材料中共擴(kuò)增出382個(gè)條帶，其中270個(gè)條帶（70.6%）表現(xiàn)出多態(tài)性；根據(jù)Nei和Li等的遺傳相似系數(shù)（GS）和遺傳距離（GD）對(duì)8種材料進(jìn)行分析，結(jié)合SPSS 16.0分析軟件進(jìn)行聚類，構(gòu)建其遺傳相關(guān)聚類圖譜。

關(guān)鍵詞：辣椒；ISSR；分子標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： S641.303.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0080-03

辣椒（Capsicum annuum）別名番椒，于明末清初傳入我國(guó)，至今已有300多年的栽培歷史[1]。我國(guó)辣椒種植面積有33萬(wàn)～40萬(wàn)hm2，主要分布為福建的小米椒、四川的朝天椒、江南的羊角椒、河南的櫻椒、山東的大紅椒等。作為在食品烹飪加工中不可缺少的佐料佳品，其味辛香，性溫?zé)?，有刺激性，同時(shí)兼具很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是人們喜愛(ài)的蔬菜和調(diào)味品，每年產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益穩(wěn)居蔬菜作物之首[2-3]。

在真核生物基因組中散步著大量的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）[4]。SSR通常為1～4個(gè)堿基組成的4～10個(gè)或者更多個(gè)串聯(lián)重復(fù)單元。簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（inter-simple sequence repeat，ISSR）[5]是在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是在SSR序列的5′或3′端加1～4個(gè)錨定堿基，并以此為引物對(duì)兩側(cè)具有反向排列SSR的一段基因組DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。ISSR 是一種快速、可靠的標(biāo)記技術(shù)，具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，在植物領(lǐng)域中已經(jīng)廣泛用于重要的農(nóng)作物如水稻[6]、小麥[7]和棉花[8]等的品系鑒定、遺傳作圖、基因定位及遺傳多樣性分析等研究中。當(dāng)前，ISSR標(biāo)記亦存在一些缺點(diǎn)，限制了其在某些方面的應(yīng)用，目前ISSR標(biāo)記技術(shù)主要應(yīng)用在植物方面，而在動(dòng)物方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道。辣椒以其獨(dú)特的蔬菜和調(diào)味品地位越來(lái)越受到人們的關(guān)注，本研究采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)不同來(lái)源的8個(gè)辣椒種子的遺傳多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。

1 材料和方法

1.1 材料處理

1.1.1 材料 本試驗(yàn)8種辣椒材料及編號(hào)見(jiàn)表1。脫氧核苷三磷酸（dNTP，2.5 mmol/L）、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）；PCR引物序列見(jiàn)表2。

1.1.2 儀器與設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀：Eppendorf AG22331 Hamburg；電泳儀：nYY-12型電腦三恒多用電泳儀；凝膠成像系統(tǒng)：TANON-200。

1.1.3 材料處理 8種辣椒種子在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)成幼苗，取其幼苗在-80 ℃的冰箱中冷凍24 h后，取出研磨成粉末后立即裝入1.5 mL離心管中。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè) 使用改良的CTAB法提取辣椒基因組DNA；采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)辣椒DNA的完整性。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增體系 PCR反應(yīng)在基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)體系如表3。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火（溫度由引物決定）30 s，72 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.3 ISSR產(chǎn)物的檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物在3%的瓊脂糖凝膠中電泳，然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)條帶的有無(wú)，強(qiáng)帶和可重復(fù)出現(xiàn)的弱帶記為有，否則為無(wú)。采用Nei和Li等的計(jì)算法GS=2Nij/（Ni+Nj）和GD=-lnGS，來(lái)計(jì)算兩兩材料間的相似性系數(shù)（GS）和相似距離（GD），其中Nij為材料i和j共有的條帶數(shù)，Ni和Nj分別為材料i和j各自的條帶數(shù)。利用SPSS 16.0分析軟件進(jìn)行聚類，構(gòu)建遺傳相關(guān)聚類圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒DNA質(zhì)量和完整性

通過(guò)改良的CTAB法提取8種辣椒幼苗的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，提取的DNA條帶明亮完整，無(wú)拖尾現(xiàn)象。說(shuō)明提取出的DNA中蛋白質(zhì)和多糖的污染少，提取的基因組DNA質(zhì)量可以滿足ISSR分析的要求。

2.2 引物的擴(kuò)增效果

如表4所示，30個(gè)ISSR引物對(duì)8個(gè)辣椒的多態(tài)性分析結(jié)果表明：除ISSR-01、ISSR-02、ISSR-03、ISSR-23、ISSR-25、ISSR-26、ISSR-27、ISSR-29外，有21個(gè)ISSR引物可獲得穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。21個(gè)引物共擴(kuò)增出382個(gè)條帶（圖2），片段大小為250～2 000 bp，各個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為1～8個(gè)，多態(tài)性條帶為270個(gè)，平均多態(tài)率為70.7%。

2.3 不同試驗(yàn)材料間的遺傳相似系數(shù)

以引物ISSR-15為代表，說(shuō)明不同材料之間的遺傳相似系數(shù)。表5是引物ISSR-15的擴(kuò)增條帶數(shù)，表6是辣椒分子標(biāo)記遺傳多樣性條帶數(shù)。通過(guò)表5和表6可得出兩兩辣椒品種之間的遺傳相似系數(shù)以及遺傳距離。表7為兩兩辣椒品種之間的遺傳相似系數(shù)比較。表8為兩兩辣椒間的遺傳距離比較。

用引物ISSR-15進(jìn)行擴(kuò)增，得出8種材料在引物 ISSR-15中的擴(kuò)增條帶數(shù)為40條。而8種材料兩兩之間進(jìn)行成對(duì)比較共得到29個(gè)GS值，并且兩者之間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.55～0.91，平均遺傳相似系數(shù)為0.806，平均遺傳距離為0.227。ISSR-15引物對(duì)2個(gè)辣椒品種間遺傳相似系數(shù)之間的差異不大，利用兩兩品種遺傳相似系數(shù)越大、品種親緣關(guān)系越近的原理，8個(gè)辣椒品種間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.55～0.91。

2.4 聚類分析

根據(jù)8個(gè)辣椒DNA在引物ISSR-15的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類，結(jié)果如圖3所示。再根據(jù)表5可將8個(gè)辣椒品種分為3類：第1類為2011-4、新9A、細(xì)線，3個(gè)辣椒兩兩遺傳相似系數(shù)為0.91，因此三者之間的親緣關(guān)系最近；第2類為郭228、261A、色2011-2，親緣關(guān)系較近；第3類為豐三A、萬(wàn)一，遺傳相似系數(shù)為0.55，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論

利用ISSR分子標(biāo)記分析辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，

用30條ISSR引物進(jìn)行篩選，有21條可擴(kuò)增出清晰可辨條帶，而這21條引物在8種材料中共擴(kuò)增出382個(gè)條帶，其中270個(gè)條帶（70.6%）表現(xiàn)出多態(tài)性；另外，以引物ISSR-15為例，分析8個(gè)辣椒品種間的親緣關(guān)系，可將8個(gè)辣椒品種分為3類：第1類為2011-4、新9A、細(xì)線，3個(gè)辣椒兩兩遺傳相似系數(shù)為0.91，三者之間的親緣關(guān)系最近；第2類為郭228、261A、色2011-2，親緣關(guān)系較近；第3類為豐三A、萬(wàn)一，遺傳相似系數(shù)為0.55，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，根據(jù)Nei和Li等的遺傳相似系數(shù)（GS）和遺傳距離（GD）公式，再利用SPSS16.0分析軟件進(jìn)行聚類，構(gòu)建了遺傳相關(guān)聚類圖譜，為辣椒抗病育種以及綜合防治提供了重要的理論參考。ISSR標(biāo)記技術(shù)以其多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)勢(shì)在未來(lái)必將在更多物種、更多領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用。

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