利用PCR技術(shù)檢測波雜肉山羊中的綿羊肺炎支原體

胡新崗　黃銀云　郭廣富

摘要：在江蘇省泰州市某波雜肉山羊場開展了疑似山羊傳染性胸膜肺炎（contagious caprine pleuropneumonia，CCPP）感染的流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢，并以疑似病例肺病變組織、胸腔滲出液、心包液為病料，采用PCR技術(shù)檢測，證實(shí)泰州地區(qū)山羊傳染性胸膜肺炎病原中存在綿羊肺炎支原體，同時(shí)為當(dāng)?shù)嘏R床診斷該病提供了分子生物學(xué)方法。

關(guān)鍵詞：波雜肉山羊；傳染性胸膜肺炎；綿羊肺炎支原體；PCR；病理剖檢

中圖分類號(hào)： S858.26 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0271-03

山羊傳染性胸膜肺炎（contagious caprine pleuropneumonia，CCPP）俗稱“爛肺病”，是山羊的主要傳染病，對(duì)山羊養(yǎng)殖業(yè)危害十分嚴(yán)重，部分地區(qū)的發(fā)病率、死亡率分別可達(dá)80%、60%[1]。該病病原較為復(fù)雜，由多種支原體組成，主要有綿羊肺炎支原體（Movi）、絲狀支原體山羊亞種（Mmc）、山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）等，這些病原體在一個(gè)羊群中可單一感染，也可混合感染，主要臨床癥狀為高熱、咳嗽、肺臟及胸膜發(fā)生漿液性、纖維素性炎癥[2-3]。長期以來，由于山羊傳染性胸膜肺炎病原支原體具有多樣性，加上支原體難以分離與培養(yǎng)，導(dǎo)致生產(chǎn)中對(duì)該病的診斷大多以臨床癥狀及病理剖檢為主要手段，部分有條件的地方采取血清學(xué)方法進(jìn)行輔助診斷，但效果不佳。由于支原體病原的特殊性，臨床上發(fā)生該病很難確診到底是何種支原體感染。江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院相關(guān)課題組針對(duì)江蘇省泰州地區(qū)山羊養(yǎng)殖業(yè)較為發(fā)達(dá)、常受疑似山羊傳染性胸膜肺炎侵?jǐn)_而難以確診的情況，采用分子生物學(xué)對(duì)該病進(jìn)行診斷。筆者在對(duì)泰州市高港區(qū)某波爾雜交肉山羊場的調(diào)研中，發(fā)現(xiàn)疑似山羊傳染性胸膜肺炎病例，通過流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢，初步確診；后采集病料采用PCR方法檢測出綿羊肺炎支原體（Movi），為該地區(qū)的“爛肺病”確診提供了分子生物學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

PCR儀（PTC-200rev）、Mikro200R冷凍高速離心機(jī)、DYCP-31DN 瓊脂糖水平電泳槽、JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀、DYY-7C型電泳儀、微量移液器、恒溫箱等。根據(jù)前人的研究方法[2，4-5]，分別合成Movi、Mccp、Mmc引物各1對(duì)[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]，詳見表1。基因組DNA快速抽提試劑盒（動(dòng)物）、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2、10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、100 bp DNA Ladder、6× DNA 凝膠載入染料（Loading Dye）均為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。病料來源于泰州市高港區(qū)某波爾雜交肉山羊場，初診疑似山羊傳染性胸膜肺炎感染病羊的病變肺組織、胸腔滲出液、心包積液等。

1.2 方法

1.2.1 疫情調(diào)查 通過詢問座談、現(xiàn)場調(diào)查、個(gè)體檢查等方法開展疫情調(diào)查，掌握關(guān)于本次疫情的流行資料，為臨床診斷及疫情防控奠定流行病學(xué)基礎(chǔ)。

1.2.2 病理剖檢 剖檢明顯具有咳嗽、呼吸困難癥狀的瀕死羊及新鮮病死羊各2只，重點(diǎn)剖檢呼吸系統(tǒng)。

1.2.3 病料采集及處理 采用無菌操作，在病變明顯肺組織病健交界處取樣，將其研碎，按1 ∶ 4（體積比）加入無菌含雙抗的PBS溶液，混勻后分裝到EP管；胸腔滲出液和心包積液取上清，分裝到EP管。將處理好的病料置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 組織病料DNA的提取 用基因組DNA快速抽提試劑盒，按說明書上的操作方法提取組織病料DNA。具體步驟如下：（1）3 000 r/min 10 min，取200 μL上清轉(zhuǎn)移至新的EP管；（2）加入400 μL Buffer Digestion，振蕩混勻，65 ℃水浴 60 min；（3）加入200 μL buffer PA，充分顛倒混勻，-20 ℃ 5 min；（4）室溫、10 000 r/min 5 min，取500 μL上清轉(zhuǎn)移至新的EP管；（5）加500 μL異丙醇，顛倒5～8次混勻，室溫放置2 min，室溫、10 000 r/min 5 min，棄上清；（6）加1 000 μL 75%乙醇，顛倒漂洗2 min，10 000 r/min 2 min，棄上清；（7）重復(fù)（6）1次；（8）開蓋，于室溫倒置5～10 min左右；（9）加入 100～200 μL TE Buffer溶解；（10）-20 ℃保存或立即進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.5 PCR檢測Movi 以提取的組織病料DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用50 μL反應(yīng)體系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、各1 μL上下游引物、3 μL cDNA、1 μL Taq DNA聚合酶，用滅菌超純水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用 15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)調(diào)查

該羊場自2013年6 月中旬購進(jìn)約500只波爾雜交肉山羊，進(jìn)欄后，由于沒有采取措施，從第2天開始陸續(xù)有羊死亡；直至9月中旬筆者所在課題組去羊場調(diào)研，依然不斷有羊死亡，發(fā)病率超過60%，病死率達(dá)40%。病死羊臨床上有發(fā)熱、咳嗽、喘氣、流淚、流鼻液、拉稀、漸進(jìn)性消瘦現(xiàn)象，用泰樂菌素、青霉素、氨基比林、恩諾沙星等予以治療，效果不佳。整個(gè)羊場呈持續(xù)慢性感染，羊感染潛伏期長短不一，一般在 20 d 左右。隨著病程延長，病情加重，病羊呼吸困難，腹式呼吸，呼吸次數(shù)增加，頻繁干咳或痙攣性咳嗽，頭頸伸直，腰背拱起，呈痛苦狀。叩診肺部有濁音、實(shí)音區(qū)，對(duì)胸壁觸壓反應(yīng)敏感。瀕死病羊的體溫可降至常溫。

2.2 病理剖檢結(jié)果

剖檢?。ㄋ溃┭颍▓D1）可見病變主要在胸部，胸腔內(nèi)有大量淡黃色積液，肺胸膜因有大量的纖維素性滲出而增厚，心包積液，肺組織肝樣變（圖2、圖3、圖4），有的在一側(cè)，有的兩側(cè)均有，病變嚴(yán)重程度不一。嚴(yán)重者肺胸膜多與肋膜、心包膜粘連（圖4、圖5），需用手或刀剪才能將其分離。嚴(yán)重者肺肝變區(qū)機(jī)化，結(jié)締組織增生，形成黃色較硬的壞死性包囊（圖6、圖7）。病變肺組織硬化部位切面呈大理石狀（圖8）。有的病例肝臟腫大，膽囊腫大多汁，腎臟腫大，嚴(yán)重病例腸系膜淋巴結(jié)充血、出血、壞死（圖9）。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)病料進(jìn)行PCR檢測，僅得到Movi目的基因片段，片段大小為361 bp（圖10），與預(yù)期的結(jié)果相符。

3 結(jié)論與討論

本病例采用PCR技術(shù)檢測時(shí)，雖然針對(duì)山羊傳染性胸膜肺炎的3種主要支原體病原分別設(shè)計(jì)了綿羊肺炎支原體（Movi）、山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）、絲狀支原體山羊亞種（Mmc）引物各1對(duì)，但在實(shí)際檢測中，僅檢測到綿羊肺炎支原體（Movi），說明綿羊肺炎支原體（Movi）在臨床上是可以單獨(dú)對(duì)山羊致病的，而且會(huì)呈現(xiàn)山羊傳染性胸膜肺炎的典型臨床癥狀和病理變化，這與前人研究結(jié)果[2-3，6]一致。支原體的分離與培養(yǎng)均較為困難，各種支原體引起的山羊臨床癥狀和病理變化僅憑肉眼難以區(qū)分，基層獸醫(yī)力量薄弱、技術(shù)不夠完善，這些都是造成山羊傳染性胸膜肺炎臨床上難以及時(shí)有效診治的原因，PCR技術(shù)可以在臨床上快速檢測支原體，避免因分離不到病原而錯(cuò)失對(duì)山羊傳染性胸膜肺炎的準(zhǔn)確診斷，非常適合應(yīng)用于山羊養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)際。

本研究結(jié)果表明，該羊群發(fā)生傳染性胸膜肺炎的主要原因有幾個(gè)方面：一是發(fā)病羊群進(jìn)場未經(jīng)引入檢疫和隔離觀察即進(jìn)欄飼養(yǎng)，如果羊攜帶山羊傳染性胸膜肺炎病原，就造成了人為引入病原，實(shí)際上引進(jìn)隱性感染羊或發(fā)病羊是不少羊場發(fā)生該病的主要原因。二是進(jìn)場后未采取積極的防控措施，這是許多羊場引進(jìn)羊1周內(nèi)大量發(fā)病的重要因素。正確的做法是：利用1周時(shí)間循序漸進(jìn)地更換飼料，給予一定的抗菌藥物，讓羊在新環(huán)境下逐漸適應(yīng)，避免因水土不服而拉稀、腹瀉，降低抗病能力；了解羊在原場的免疫程序，在羊健康的情況下，適時(shí)接種疫苗，做到科學(xué)免疫。羊場一旦發(fā)病，應(yīng)及時(shí)求

助獸醫(yī)部門或相關(guān)科研機(jī)構(gòu)，爭取及早確診，科學(xué)合理治療，避免誤診誤治、延誤病情而導(dǎo)致慘重?fù)p失。

由于山羊傳染性胸膜肺炎的病原支原體具有多樣性，不同地區(qū)分離的優(yōu)勢病原菌株也各有不同，這給該病的預(yù)防、控制增加了困難。綿羊肺炎支原體多呈慢性感染，病程長且不易發(fā)覺，病情嚴(yán)重后往往難以取得理想療效，因此應(yīng)重視該病的多舉措預(yù)防。目前的山羊傳染性胸膜肺炎疫苗，主要以Mmc制備，尚沒有采用Movi制備的專用疫苗，因此用傳統(tǒng)疫苗免疫該病尚不理想，需要盡快研制具有地方針對(duì)性的優(yōu)質(zhì)疫苗用于生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)該病的高效預(yù)防[7]。規(guī)?；驁鲆部稍诎l(fā)病后聯(lián)合有條件的科研院所制備針對(duì)該場的自家苗用于緊急預(yù)防。

參考文獻(xiàn)：

[1] MacMartin D A，MacOwan K J，Swift L L.A century of classical contagious caprine pleuropneum onia：From original deseription to aetiology[J]. Br Vet J，1980，136（5）：507-515.

[2]王 華，楊發(fā)龍，王 永，等. 山羊支原體性肺炎流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（1）：210-214.

[3]杜永鳳，文心田，曹三杰，等. 山羊傳染性胸膜肺炎病原分離與鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（6）：618-621.

[4]儲(chǔ)岳峰. 我國山羊（接觸）傳染性胸膜肺炎病原學(xué)、流行病學(xué)研究及滅活疫苗的研制[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

[5]趙萍，郭 晗，儲(chǔ)岳峰，等. 山羊傳染性胸膜肺炎病原的檢測[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（2）：340-341.

[6]畢丁仁，王桂枝. 動(dòng)物霉形體及研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：83-91.

[7]趙 萍，儲(chǔ)岳峰，高鵬程，等. 羊霉形體病的疫苗預(yù)防及藥物治療[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī)，2008，38（4）：44-46.