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      二硫蘇糖醇還原—高效液相色譜法測(cè)定蔬菜中的還原型維生素C和總維生素C含量

      2016-10-20 15:29:01鄭小曼顧明華沈方科
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年7期
      關(guān)鍵詞:高效液相色譜法蔬菜

      鄭小曼 顧明華 沈方科

      摘要:研究建立高效液相色譜法(HPLC)快速檢測(cè)蔬菜中還原型維生素C含量的方法,并通過(guò)二流蘇糖醇(DDT)還原脫氫型維生素C,從而得到總維生素C、脫氫型維生素C含量。以3%偏磷酸為提取液,乙腈-0.015 mol/L磷酸二氫銨溶液(體積比85 ∶ 15)為流動(dòng)相,流速為1.5 mL/min,采用Waters C-18(150 mm×3.9 mm,5 μm)反相色譜分離,用紫外檢測(cè)器于254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。結(jié)果表明:在1~500 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好(r=0.999 6),所有蔬菜樣品檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%~1.83%,平均加標(biāo)回收率為99.89%。用該方法測(cè)定蔬菜中維生素C含量,結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好,適用于維生素C含量范圍較大及顏色各異的多種蔬菜。

      關(guān)鍵詞:高效液相色譜法(HPLC);二流蘇糖醇(DDT);蔬菜;總維生素C;還原型維生素C

      中圖分類號(hào): S132;O652.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2016)07-0304-03

      維生素C是一種人類必需的營(yíng)養(yǎng)素[1],其主要形式為L(zhǎng)-還原型、L-脫氫型,最主要的功能是參與膠原蛋白質(zhì)的合成,動(dòng)物缺乏維生素C會(huì)造成壞血病[2]。作為一種抗氧化劑和高活性物質(zhì),維生素C參與許多新陳代謝過(guò)程,可以保護(hù)人體免于自由基的威脅,具有提高免疫力,預(yù)防癌癥、心臟病、中風(fēng),保護(hù)牙齒和牙齦,抗衰老等許多生理作用[2-4]。有研究表明:一定劑量的維生素C可抗細(xì)胞DNA損傷[5];在老鼠鉛中毒的同時(shí)及其后,補(bǔ)充維生素C可降低血鉛濃度[6];此外,維生素C還具有預(yù)防乙醇對(duì)腦、肝損傷的作用[7]。人類自身不能夠制造維生素C,其廣泛的食物來(lái)源為各類新鮮果蔬,并且蔬菜中的總維生素C含量相比還原型維生素C更能夠表征蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此,建立能夠快速檢測(cè)蔬菜中總維生素C含量的方法十分重要,能為人們的膳食營(yíng)養(yǎng)提供更為確切的參考,從而有效預(yù)防和抵制因體內(nèi)缺少維生素C而帶來(lái)的不利影響,提高人們的工作效率和生活質(zhì)量。

      維生素C的測(cè)定方法有多種,各有優(yōu)缺點(diǎn)。如《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的碘量法因其試驗(yàn)操作時(shí)不易把握酸度、碘易揮發(fā)等,使得測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度降低,不適于微量分析;而大多數(shù)水果、蔬菜的提取液具有一定色澤,又使得以顏色變化來(lái)辨別其滴定終點(diǎn)的國(guó)標(biāo)法2,6-二氯靛酚滴定法(GB/T 6195—1986《水果、蔬菜維生素C含量測(cè)定法(2,6-二氯靛酚滴定法)》)具有一定的局限性;此外,還包括容量法、苯肼比色法、熒光光度法、電位法、紫外分光光度法等,但是這些方法或存在所需試劑較多、試劑不穩(wěn)定、操作繁瑣等缺點(diǎn)[8-10],或只能測(cè)定還原型維生素C含量,不能測(cè)定具有同樣生理功能的脫氫型維生素C含量,如熒光法、苯肼比色法[11]。

      高效液相色譜(HPLC)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速高效且穩(wěn)定可靠、發(fā)展較快的分離技術(shù),因其處理樣品簡(jiǎn)單快速,且能同時(shí)測(cè)定幾種維生素而被廣泛應(yīng)用于食品藥品中維生素含量的測(cè)定[8-17]。但是,該方法目前主要測(cè)定的是還原型維生素C[11],而對(duì)蔬菜中同樣具有生理功能的脫氫型維生素C含量的檢測(cè)報(bào)道較少。本研究通過(guò)利用二硫蘇糖醇(DTT)能夠?qū)⒚摎湫途S生素C還原而不具有生理活性的二酮古洛糖酸則不會(huì)被還原[17-18],并且與高效液相色譜法結(jié)合,可測(cè)定出還原型維生素C、總維生素C含量,從而得出脫氫型維生素C含量,以總維生素C含量表征蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更為準(zhǔn)確。

      1 材料與方法

      1.1 試劑與材料

      乙腈,色譜純;磷酸二氫銨,分析純;維生素C標(biāo)準(zhǔn)品,分析純,維生素C含量≥99.7%,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;偏磷酸,分析純;二硫蘇糖醇(DTT);超純水,筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制;0.45 μm濾膜,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。小白菜、番茄,市購(gòu)。

      1.2 儀器與設(shè)備

      Waters e2695型高效液相色譜,美國(guó);Waters DELTA-PAK C18色譜柱,日本;Waters 2998 PAD紫外檢測(cè)器;DP-01隔膜真空泵,天津市東康科技有限公司;KQ2200型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;MILLI-Q型超純水裝置。

      1.3 試驗(yàn)方法

      1.3.1 色譜條件 Waters DELTA-PAK C18色譜柱,柱長(zhǎng)150 mm,內(nèi)徑3.9 mm,顆粒大小5 μm;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。根據(jù)本試驗(yàn)高效液相色譜儀的性能特點(diǎn),選擇乙腈 -0.015 mol/L NH4H2PO4(體積比85 ∶ 15)作為流動(dòng)相;流速為1.5 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,柱溫25 ℃;以保留時(shí)間定性,待液相色譜穩(wěn)定后進(jìn)樣分析,以峰面積定量。

      1.3.2 樣品制備 稱取新鮮小白菜、番茄樣品各4.00 g,迅速剪碎后加入少量3%偏磷酸研磨制成勻漿,用3%偏磷酸定容至100 mL棕色容量瓶中,過(guò)濾,再吸取一部分濾液過(guò) 0.45 μm 微孔濾膜,然后按“1.3.1”節(jié)色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定,所得數(shù)值為還原型維生素C含量。脫氫型維生素C含量=維生素C總量-還原型維生素C含量,前提是將樣品中脫氫型維生素C還原為還原型維生素C。因此,另吸取 0.5 mL 濾液,加入1.00 mL 1%二硫蘇糖醇溶液(DTT),反應(yīng)還原 0.5 h 后,過(guò)0.45 μm 濾膜進(jìn)樣,同樣按“1.3.1”節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,所測(cè)數(shù)值為樣品溶液中的總維生素C量。

      1.3.3 線性關(guān)系分析 準(zhǔn)確稱取50 mg維生素C,用1.5%偏磷酸溶液定容至100 mL棕色容量瓶中,得到500 mg/L維生素C標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;將其逐級(jí)稀釋得到50、10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液,過(guò)0.45 μm濾膜,調(diào)整進(jìn)樣量,稀釋得到1、5、10、20、30、50、100、200、300、400、500 mg/L系列濃度對(duì)應(yīng)的峰面積,以峰面積的積分值對(duì)進(jìn)樣濃度(mg/L)進(jìn)行直線回歸。

      1.3.4 精密度試驗(yàn) 取所制得樣品4個(gè),重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定維生素C含量的精密度。

      1.3.5 回收率試驗(yàn) 采用加標(biāo)回收法,取2.00 mL勻漿樣品,分別加入2.00 mL濃度為50、100、500 mg/L的維生素C標(biāo)準(zhǔn)品,重復(fù)進(jìn)樣3次,取3次測(cè)定的平均值作為測(cè)定結(jié)果。將測(cè)定結(jié)果扣除樣品溶液的測(cè)定值,從而得到加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率,其計(jì)算公式為:

      回收率=(加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值)/加標(biāo)量×100%。

      1.3.6 最低檢測(cè)限的計(jì)算 以產(chǎn)生3倍儀器噪聲水平的進(jìn)樣量為檢出限。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 維生素C提取劑的選擇

      考察不同提取劑(3%草酸、3%偏磷酸)對(duì)維生素C峰型的影響,結(jié)果表明:當(dāng)選擇3%草酸作為本研究蔬菜樣品提取劑時(shí),出現(xiàn)維生素C峰尖圓滑不尖銳、基線不平等現(xiàn)象;而以3%偏磷酸作為提取劑能夠得到更好的峰形(圖1),因此選擇3%偏磷酸作為蔬菜樣品提取劑。

      2.2 流動(dòng)相的選擇

      考察乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4不同比例(體積比 50 ∶ 50、75 ∶ 25、85 ∶ 15)對(duì)檢測(cè)時(shí)維生素C的峰形、保留時(shí)間等出峰情況的影響。結(jié)果表明:當(dāng)選擇乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4(體積比85 ∶ 15)作為流動(dòng)相時(shí),不僅出峰時(shí)間提前,峰形也更好,也不存在峰形重疊等問(wèn)題,因此選擇乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4(體積比85 ∶ 15)作為流動(dòng)相。

      2.3 色譜條件的選擇

      用Waters 2998 PAD紫外檢測(cè)器檢測(cè)發(fā)現(xiàn),維生素C在245~255 nm波長(zhǎng)下吸光度較高,在254 nm吸光度最大,因此選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在超過(guò)樣品的檢測(cè)時(shí)間(4 min)后的6 min內(nèi),沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有明顯的信號(hào)強(qiáng)度,因此確定樣品檢測(cè)時(shí)間為4 min。由圖2可以看出,所有樣品均能實(shí)現(xiàn)基線分離,而且峰形能滿足測(cè)定要求,維生素C的保留時(shí)間為0.866~0.929 min,檢測(cè)限為0.86 μg/L。

      2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

      以1、5、10、20、30、50、100、200、300、400、500 mg/L系列濃度對(duì)應(yīng)峰面積的積分值對(duì)進(jìn)樣濃度(mg/L)進(jìn)行直線回歸。以濃度(x,mg/L)為自變量、峰面積(y)為因變量,方程式:y=167 33x-262 03,r=0.999 6,說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線在1~500 mg/L范圍內(nèi)線性良好,維生素C標(biāo)準(zhǔn)品的色譜結(jié)果見(jiàn)圖2,標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。

      2.5 蔬菜中維生素C含量的測(cè)定

      由圖4、圖5可以看出,經(jīng)過(guò)DTT的還原,總維生素C的峰高高于還原型維生素C。由表1小白菜、番茄中還原型維生素C、總維生素C、氧化型維生素C的檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn),各提取液中維生素C的保留時(shí)間在0.898~ 0.995 min。

      2.6 精密度試驗(yàn)

      對(duì)同一小白菜、番茄提取液分別連續(xù)進(jìn)樣5次,由表2可見(jiàn),精密度試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差為0.49~3.29,變異系數(shù)為0.63%~1.83%,表明該方法重現(xiàn)性較好。

      2.7 回收率試驗(yàn)

      各取3份2 mL維生素C含量為25.106 mg/kg的小白菜提取液、維生素C含量為18.248 mg/kg的番茄提取液,分別加入2 mL不同濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液,測(cè)定混合液中維生素C含量,每種混合液測(cè)定3次,取其平均值。由表3可見(jiàn),回收率范圍為96.58%~103.59%,平均回收率為99.89%。

      3 討論與結(jié)論

      維生素C在pH值>7.6以上的溶液中非常不穩(wěn)定,但是在pH值<4的酸性溶液中較穩(wěn)定,3%草酸、3%偏磷酸皆滿足pH值

      磷酸與維生素C的這些特點(diǎn),本研究采用3%偏磷酸提取番茄、小白菜中的維生素C后,其峰形更為尖銳、基線相對(duì)平穩(wěn),可見(jiàn)以3%偏磷酸作為提取劑能夠得到更好的峰形。但是,由于偏磷酸不穩(wěn)定,需要現(xiàn)配現(xiàn)用才能保證提取效果。

      利用高效液相色譜與二硫蘇糖醇還原維生素C相結(jié)合,對(duì)小白菜、番茄的還原型維生素C、總維生素C含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,新鮮小白菜中含有還原型維生素C含量為 62.297 mg/100 g,總維生素C含量為273.390 mg/100 g;新鮮番茄中還原型維生素C含量為45.888 mg/100 g,總維生素C含量為197.406 mg/100 g。總維生素C、還原型維生素C二者之差為脫氫型維生素C,本研究中小白菜、番茄的脫氫型維生素C含量分別為211.092、151.518 mg/100 g??梢钥闯?,在本研究的小白菜、番茄中,脫氫型維生素C含量在總維生素C含量中占很大的比重,而脫氫型維生素C與還原型維生素C同樣具有生理功能,對(duì)人體健康的貢獻(xiàn)不可忽視。本研究認(rèn)為,只利用高效液相色譜法測(cè)定的還原型維生素C不足以說(shuō)明蔬菜中維生素C的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài),應(yīng)利用二硫蘇糖醇的還原作用,得到的總維生素C含量更能表征蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

      本研究標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.999 6,曲線在1~500 mg/L范圍內(nèi)線性良好,說(shuō)明曲線的線性關(guān)系較好,且測(cè)定濃度范圍較廣,分析中受樣品中其他雜質(zhì)的影響較小。測(cè)定小白菜、番茄中維生素C的含量,回收率為96.58%~10359%,說(shuō)明該方法具有所需試劑少、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。從本研究還可以看出,精密度試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%,說(shuō)明該方法重復(fù)性、再現(xiàn)性都是比較高的;而且從樣品色譜圖中看出,該方法分析維生素C的含量大約需要3 min,具有靈敏、快速的特點(diǎn)。本研究所用的這個(gè)分析方法是可靠的,它適用于維生素C含量范圍較大及顏色各異的廣泛蔬菜中還原型維生素C、總維生素C含量的測(cè)定。

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