吳蓓琦 劉暢 李萍
摘要:通過優(yōu)化提取方式、提取溶液、濃縮條件、檢測(cè)條件等,建立高效液相色譜熒光法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量的方法。樣品經(jīng)硼氫化鉀溶液、乙腈提取,二氯甲烷萃取,用45 ℃氮?dú)獯蹈桑撬彡栯x子(PRS)固相萃取柱凈化,采用Agilent XDB C18色譜柱(1.8 μm),以乙腈-乙酸銨緩沖液(0.125 mol/L,pH值4.5,體積比80 ∶ 20)為流動(dòng)相,用超高效液相色譜熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。方法的檢測(cè)限為0.2 μg/kg,定量限為0.5 μg/kg,4個(gè)加標(biāo)水平(1.0、2.5、5.0、10.0 μg/kg)的回收率為86.4%~95.3%(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%~5.6%。該方法簡便快捷、準(zhǔn)確度高,易于推廣應(yīng)用,能滿足水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留的檢測(cè)要求。
關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;水產(chǎn)品;孔雀石綠;殘留檢測(cè);優(yōu)化
中圖分類號(hào): TS207.3;O652.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2016)07-0333-03
孔雀石綠(malachite green,MG)是一種三苯甲烷類染料,它在生物體內(nèi)快速代謝為無色孔雀石綠(leuco-malachite green,LMG),具有致癌、致畸、致突變等毒性[1-2],因此美國、歐盟等禁止將孔雀石綠用于食品用水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖,我國也在2002年將其列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》。但是,由于孔雀石綠對(duì)魚類水霉病等疾病具有特效,且價(jià)格低廉,目前在魚苗繁育、長途運(yùn)輸?shù)冗^程中非法使用的問題屢有發(fā)生[3]。
目前,水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法等[4-7]。目前農(nóng)業(yè)部開展全國水產(chǎn)品產(chǎn)地監(jiān)督抽檢、城市例行監(jiān)測(cè)等任務(wù)時(shí),以GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》[8]作為水產(chǎn)品中孔雀石綠的定量檢測(cè)方法,但該方法前處理過程繁瑣、操作步驟多。本試驗(yàn)通過對(duì)GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》前處理過程進(jìn)行優(yōu)化與改進(jìn),主要包括提取方式、提取溶液、濃縮條件等因素,以期建立1種前處理簡單快捷、結(jié)果準(zhǔn)確度高并且穩(wěn)定的孔雀石綠及其代謝物殘留的測(cè)定方法。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
Agilent 1200超高效液相色譜儀,配熒光檢測(cè)器; TurboVap LV濃縮工作站。
孔雀石綠、無色孔雀石綠,購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,純度>99%;乙腈、二氯甲烷,色譜純,購自美國TEDIA公司;其余試劑均為分析純。丙基磺酸陽離子固相萃取柱(PRS,500 mg/3 mL),購自美國Agilent公司。
提取液:稱取0.54 g硼氫化鉀,加入25 mL水溶解,再加入75 mL乙腈混勻。
洗脫液:稱取1.54 g無水乙酸銨,溶解于200 mL水中,用濃氨水(25%~28%)將pH值調(diào)至10.0,再與乙腈按體積比1 ∶ 1進(jìn)行混合。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 樣品前處理 稱取5.00 g樣品,加入15 mL提取液,渦旋2 min,4 000 r/min離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗中;在離心管中加入10 mL乙腈,渦旋2 min,8 000 r/min 離心10 min,合并上清液于分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL二氯甲烷,劇烈振搖2 min,靜置分層1 h,將下層溶液轉(zhuǎn)移至50 mL濃縮管中。用45 ℃氮?dú)獯抵?.5~1.0 mL,加入5 mL乙腈溶解殘?jiān)?。PRS柱用5 mL乙腈活化,轉(zhuǎn)移提取液到柱上,再分別用3 mL乙腈潤洗濃縮管2次,依次過柱。最后將PRS柱吹至近干,加入3 mL洗脫液,收集洗脫液并定容至3 mL,供液相色譜測(cè)定。
1.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent XDB-C18柱,4.6 mm×50 mm(內(nèi)徑),粒度1.8 μm;柱溫為35 ℃,進(jìn)樣體積為5 μL;流動(dòng)相為乙腈-乙酸銨緩沖液(0.125 mol/L,pH值4.5,體積比80 ∶ 20),流速為0.15 mL/min;檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器,激發(fā)波長為265 nm,發(fā)射波長為360 nm。
2 結(jié)果與分析
2.1 樣品提取方式優(yōu)化
GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》的基本原理是通過乙酸銨乙腈溶液提取,用硼氫化鉀將提取液中的孔雀石綠還原成無色孔雀石綠,采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。本方法中需要加入鹽酸羥胺溶液、乙酸銨緩沖液、乙腈等多種試劑,同時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行4次提取,提取過程繁瑣。本方法采用硼氫化鉀-乙腈混合溶液進(jìn)行提取,直接在樣品渦旋過程中將孔雀石綠還原成無色孔雀石綠,避免在提取溶液中加入硼氫化鉀溶液,減少操作步驟;同時(shí),硼氫化鉀作為強(qiáng)還原劑,能有效替代GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》中鹽酸羥胺的作用,避免無色孔雀石綠被氧化。通過2次提取的比較發(fā)現(xiàn),本方法既具有操作過程簡單、節(jié)約時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)(表1),又能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性(表2)。
2.2 硼氫化鉀用量的確定
在實(shí)際樣品前處理過程中,水相與有機(jī)相的比例影響二者的分層效果,比例不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致2相倒置、2層界面模糊、乳化等現(xiàn)象。通過考察硼氫化鉀溶液與乙腈不同的體積比例,結(jié)果表明:當(dāng)硼氫化鉀溶液與乙腈的體積比為1 ∶ 2或更高時(shí),對(duì)于鰻鱺、中華絨螯蟹等脂肪含量較高的樣品,加入二氯甲烷并劇烈振搖后較易乳化。當(dāng)硼氫化鉀溶液與乙腈的體積比為1 ∶ 3或更低時(shí),劇烈振搖后也不會(huì)乳化,有機(jī)相與水相分層明顯,有利于下一步的濃縮與凈化。但是試驗(yàn)中水相的存在有助于去除樣品中水溶性雜質(zhì),因此水相的比例也不能過低。經(jīng)綜合考慮,本試驗(yàn)選擇硼氫化鉀溶液與乙腈的體積比為1 ∶ 3。
硼氫化鉀在本方法及GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》中的作用均是將樣品中的孔雀石綠還原成無色孔雀石綠,硼氫化鉀的用量直接關(guān)系到孔雀石綠的還原效果。為了確定硼氫化鉀濃度對(duì)孔雀石綠的還原效果,在空白基質(zhì)中添加10 μg/kg孔雀石綠,分別加入硼氫化鉀濃度為0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的提取液,按“1.2”“1.3”節(jié)中相應(yīng)方法進(jìn)行前處理與檢測(cè)。在前處理過程中樣品經(jīng)渦旋后,原本呈肉紅色的樣品顏色逐漸變淺,直至變成灰白色。同時(shí)測(cè)定結(jié)果表明,樣品中孔雀石綠的回收率無顯著差異,均在90%左右??紤]到水產(chǎn)品基質(zhì)的多樣性以及孔雀石綠殘留水平的不同,本試驗(yàn)選擇硼氫化鉀溶液濃度為0.4 mol/L,以保證孔雀石綠的還原效果。
2.3 濃縮條件的優(yōu)化
本試驗(yàn)應(yīng)用TurboVap LV濃縮工作站進(jìn)行濃縮,其主要原理是在一定的溫度下利用氮?dú)獯祾哌M(jìn)行濃縮,相對(duì)于傳統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)而言,具有溶劑揮發(fā)平穩(wěn)、能同時(shí)濃縮24個(gè)樣品、濃縮效率高等特點(diǎn)。本試驗(yàn)在6.9×104 Pa氮?dú)鈮毫ο?,濃縮管中溶劑不會(huì)劇烈翻騰,同時(shí)又保證了一定的溶劑揮發(fā)速度。同時(shí),本試驗(yàn)對(duì)濃縮溫度進(jìn)行了優(yōu)化,考察了35、40、45、50、55 ℃ 條件下濃縮時(shí)間及結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明,在45 ℃的濃縮溫度下,濃縮時(shí)間約為40 min,回收率約為90%。50、55 ℃條件下濃縮時(shí)間較短,約為30 min,但樣品回收率較低,均在80%以下,有的甚至低于70%,結(jié)果不穩(wěn)定。這可能是由于在較高的溫度下,溶劑揮發(fā)速率過快,將目標(biāo)物質(zhì)連同溶劑一起帶出,造成回收率降低。在35、40 ℃條件下,濃縮時(shí)間較長,均超過1 h,但回收率與45 ℃無顯著差異。因此采用氮?dú)鈮毫?.9×104 Pa、濃縮溫度45 ℃作為本方法的濃縮條件。
2.4 固相萃取小柱的選擇
GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》中將酸性氧化鋁柱與PRS柱進(jìn)行串聯(lián),待樣液流完后,棄去酸性氧化鋁柱,再進(jìn)行洗脫,而本試驗(yàn)只采用PRS柱進(jìn)行凈化,結(jié)果顯示:色譜圖中雜峰干擾小,目標(biāo)峰與雜峰完全分離,且峰形尖銳對(duì)稱(圖1至圖4);此外只選用PRS柱,有利于降低檢測(cè)成本。
2.5 儀器方法的選擇
筆者所在研究團(tuán)隊(duì)曾建立了普通高效液相色譜熒光法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的方法[9],其分析時(shí)間為15 min,而本試驗(yàn)建立的超高效液相色譜法分析用時(shí)為8 min,分析時(shí)間大大縮短。同時(shí)本試驗(yàn)采用1.8 μm小顆粒填料進(jìn)行超高效液相色譜分析,結(jié)果表明:孔雀石綠在Agilent XDB C18色譜柱擁有理想的分離效果(圖1至圖4)。此外,本方法完成1次樣品分析消耗的流動(dòng)相僅為1.2 mL(流速為0.15 mL/min),而普通液相色譜方法[9]消耗的流動(dòng)相為15 mL(流速為 1 mL/min),可見采用超高效液相色譜方法可以在很大程度上減少分析時(shí)間、節(jié)省溶劑消耗,這既降低了分析成本,又減少了廢液的排放,具有重要的環(huán)保意義。
2.6 線性范圍、檢出限及定量限
采用逐級(jí)稀釋的方式,并加入0.4 mL 0.03 mol/L硼氫化鉀溶液,配制成質(zhì)量濃度分別為1.00、2.00、5.00、10.00、50.00、100.00、500.00 μg/L的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液,按質(zhì)量濃度從低到高的順序進(jìn)樣。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,結(jié)果表明:孔雀石綠在1~500 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,r>0.999。
檢出限(LOD)采用向空白、樣品中逐級(jí)降低孔雀石綠加標(biāo)濃度的方法來確定,以≥3倍信噪比(S/N≥3)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度為檢出限,以S/N≥10對(duì)應(yīng)的濃度為定量限(LOQ)。結(jié)果表明:該方法的檢出限為0.2 μg/kg,定量限為 0.5 μg/kg。
2.7 準(zhǔn)確度與精密度
在空白、鯉魚、對(duì)蝦、中華絨螯蟹樣品中加入孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液,加標(biāo)水平分別為1.0、2.5、5.0、10.0 μg/kg,加標(biāo)30 min后按“1.2”“1.3”節(jié)的相應(yīng)方法進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)水平測(cè)定6次,計(jì)算平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明:孔雀石綠的加標(biāo)回收率為86.4%~95.3%,在各個(gè)加標(biāo)水平下加標(biāo)回收率比較穩(wěn)定,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.8%~5.6%,能滿足水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留的檢測(cè)要求(表2、圖1至圖4)。
3 結(jié)論
本方法通過對(duì)GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》的提取方式、提取溶液、濃縮條件等前處理過程的優(yōu)化,建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物的高效液相色譜-熒光檢測(cè)法。試驗(yàn)
結(jié)果表明:該方法具有前處理步驟簡單快捷,結(jié)果準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的檢測(cè)。
參考文獻(xiàn):
[1]翟毓秀,郭瑩瑩,耿 霞,等. 孔雀石綠的代謝機(jī)理及生物毒性研究進(jìn)展[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,37(1):27-32.
[2]桂英愛,王洪軍,劉春林,等. 孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的殘留、危害及檢測(cè)研究進(jìn)展[J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,22(4):293-298.
[3]傅武勝,鄭奎城,邱文倩,等. 養(yǎng)殖魚孔雀石綠及其代謝物殘留量的調(diào)查與溯源[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2013,4(1):176-182.
[4]鄭 斌,趙紅萍,冷凱良,等. 高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定鰻鱺中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué),2007,14(6):1038-1041.
[5]Mitrowska K,Posyniak A,Zmudzki J. Determination of malachite green and leucomalachite green in carp muscle by liquid chromatography with visible and fluorescence detection[J]. Journal of Chromatography A,2005,1089(1/2):187-192.
[6]朱寬正,王 鵬,林雁飛,等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫以及它們的隱色代謝物殘留[J]. 色譜,2007,25(1):66-69.
[7]沈 麗,張麗君,譚 攀,等. 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠的應(yīng)用研究[J]. 食品工程,2012(2):58-61.
[8]中國水產(chǎn)科學(xué)研究院,農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,國家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心.GB/T 20361—2006 水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006.
[9]王 靜,楊洪生,張美琴,等. 高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠代謝物殘留量[J]. 理化檢驗(yàn):化學(xué)分冊(cè),2010,46(6):642-647.