魯守堂　吳穗芳　金美玲　王啟龍　甄亞男　石會(huì)勇　李成軍　徐忠法

RhoGDI2蛋白的高表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

魯守堂1，3吳穗芳2金美玲3王啟龍3甄亞男3石會(huì)勇3李成軍3徐忠法3

目的通過檢測RhoGTP酶解離抑制因子2（RhoGTPase dissociation inhibitor 2，RhoGDI2）在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá)并結(jié)合臨床病理特點(diǎn)進(jìn)行分析，探討RhoGDI2的蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。方法選取山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院2012年07月至2014年07月采取手術(shù)切除的153例結(jié)直腸癌病例，采用免疫組織化學(xué)檢測153例腫瘤組織標(biāo)本和癌旁標(biāo)本中RhoGDI2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果RhoGDI2蛋白在結(jié)腸癌組織中呈陽性表達(dá)，且主要在胞漿中表達(dá)；但在癌旁正常組織中無陽性表達(dá)（57.5% vs 0.00%）。結(jié)直腸癌組織中RhoGDI2蛋白的表達(dá)在低分化組顯著高于高中分化組（χ2=2.090，P＜0.05）。RhoGDI2的陽性表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤的大小呈正相關(guān)，腫瘤越大陽性表達(dá)率越高（χ2=4.293，P＜0.05），并隨著腫瘤浸潤深度陽性表達(dá)率增加（χ2=1.711，P＜0.05），其在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（χ2=5.925，P＜0.05）、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者顯著高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者（χ2=5.519，P＜0.05），并且與臨床分期密切相關(guān)，分期較晚的顯著高于分期較早的（χ2=5.683，P＜0.05）。RhoGDI2在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)與年齡（＜60 years vs ≥60 years）（χ2=0.054，P＞0.05），性別（χ2=0.037，P＞0.05）無相關(guān)性。結(jié)論RhoGDI2在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，并且與結(jié)直腸癌的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。RhoGDI2可能在結(jié)直腸的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。

結(jié)直腸腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移；侵襲；RHOGTP酶解離抑制因子2

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。據(jù)全國腫瘤登記中心披露的數(shù)據(jù)顯示2015年結(jié)直腸癌位于中國腫瘤發(fā)病率及癌癥死亡率的第五位［1］。隨著生活水平的提高及高脂肪低纖維素飲食的比例增加，結(jié)直腸癌的發(fā)生率在我國呈比例上升。2011年結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別為23.03/10萬和11.1/10萬。其中城市地區(qū)遠(yuǎn)高于農(nóng)村，且結(jié)直腸癌的發(fā)病率顯著上升，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于中晚期。25%的結(jié)直腸癌患者在確診時(shí)即合并肝轉(zhuǎn)移，另有30%～40%的患者在結(jié)直腸癌原發(fā)病灶根治術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［2］。其中腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是主要的影響因素，關(guān)于侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的研究如火如荼，在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子2（RhoGTPase dissociation inhibitor，RhoGDI2）在胃癌中呈高表達(dá)，并且與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。結(jié)直腸腫瘤與胃癌同屬于消化道腫瘤，推測該因子也許與結(jié)直腸腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，于是進(jìn)行了RhoGDI2在結(jié)直腸腫瘤中的表達(dá)及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究。

資料與方法

一、一般資料

石蠟切片：樣本選取山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院2012年07月至2014年07月采取手術(shù)切除的153例結(jié)直腸癌病例，所有病例均有完整的臨床資料，均病理證實(shí)，并未接受術(shù)前放化療（表1）。結(jié)直腸癌TNM分期依據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第七版分期標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)經(jīng)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會(huì)論證通過，并全部已與患者簽署知情同意書，標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、標(biāo)準(zhǔn)條件存放。所有病例標(biāo)本包含腫瘤組織及癌旁組織兩部分。兔抗人RhoGDI2抗體購自ABCAM公司；SP免疫染色試劑盒，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

表1　RhoGDI2蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系表

二、方法

（一）免疫組織化學(xué)染色

切片，70℃，30 min脫蠟，二甲苯浸泡5 min×2次，梯度乙醇脫水，水洗，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗1遍，枸櫞酸浸泡，熱修復(fù)，3% H2O2去離子水避光孵育10 min，PBS沖洗3次×3 min，滴加一抗（1：200），4℃過夜；PBS洗3次×3 min，滴加聚合物輔助劑（試劑A）室溫孵育20 min，PBS洗3次×3 min，滴加辣根素過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔/小鼠IgG多聚體（試劑B），37℃孵育20 min，PBS洗3次×3 min，新鮮配制DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，以PBS替代一抗作為陰性對照，用已知陽性胎盤切片作為陽性對照。

（二）免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評定

各用光學(xué)顯微鏡觀察免疫組織化學(xué)切片，進(jìn)行半定量評估，在高倍顯微鏡下對每張切片隨機(jī)選擇5視野，判斷結(jié)果依據(jù)Shimizu方法［6］。對每張切片陽性細(xì)胞的陽性強(qiáng)度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別打0、1、2、3分，著色陽性細(xì)胞比率按0%、0～10%；10%～50%；51%～80%；＞80%分別打0、1、2、3、4分，然后根據(jù)兩項(xiàng)打分之和判斷其結(jié)果，分?jǐn)?shù)≥3分為陽性。本試驗(yàn)所有切片均有兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生采取雙盲法評估。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析借助于SPSS 22.0軟件，將病例資料按照性別、年齡、原發(fā)灶直徑、原發(fā)灶浸潤深度、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、疾病分期分為兩組，分別將RhoGDI2陽性表達(dá)率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

在選取的153例結(jié)直腸癌組織中，RhoGDI2蛋白在結(jié)直腸腺癌的陽性率為57.5%。RhoGDI2蛋白在結(jié)直腸癌旁組織不表達(dá)，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

其中原發(fā)灶直徑（≥5 cm）陽性率64.4%，直徑（＜5 cm）陽性率47.4%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.293，P＜0.05）。高中分化陽性率52.7%，低分化陽性率64.5% （χ2=2.090，P＜0.05）。TNM分期Ⅰ、Ⅱ期組陽性率47.6%，Ⅲ、Ⅳ期組陽性率66.3%（χ2=5.683，P＜0.05），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率67.6%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率48.1%（χ2=5.925，P＜0.05）兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原發(fā)灶浸潤深度（T1-2）陽性率51.5%，T3-4陽性率66.7%（χ2=1.711，P＜0.05），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的陽性率67.6%，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的陽性率48.7%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.519，P＜0.05）。RhoGDI2蛋白陽性表達(dá)率與性別（χ2=0.037，P＞0.05）、年齡（＜60，≥60）（χ2=0.054，P＞0.05）無關(guān)。（表1，圖1）

討　論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤，據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2015年結(jié)直腸癌的發(fā)病率及癌癥相關(guān)死亡率均位于第五位，并呈逐年上升趨勢。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響預(yù)后的主要因素，關(guān)于相關(guān)的分子調(diào)節(jié)機(jī)制目前仍不明了。

惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的特性相關(guān)，其中包括改變細(xì)胞間粘連，獲得運(yùn)動(dòng)侵襲性，對微環(huán)境的適應(yīng)性生存，可以進(jìn)入血管和淋巴管循環(huán)。在這一過程中RhoGTP酶家族參與了許多關(guān)鍵步驟，是諸多關(guān)鍵步驟的關(guān)鍵因子，比如控制細(xì)胞傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)包括基因的表達(dá)，細(xì)胞生長過程，細(xì)胞骨架的重排，微管結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜內(nèi)外信號(hào)的傳導(dǎo)等許多生物過程。其主要因子包括Rho、Rac1和CDC42［3-4］。

RhoGDI2是Rho家族的一員，通過調(diào)節(jié)RhoGTP酶的活性而發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子［5］。其是由Lelias和Scherle P發(fā)現(xiàn)在造血組織和淋巴細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)。在以后的研究中發(fā)現(xiàn)它在惡性腫瘤中也表達(dá)，但是在腫瘤的作用卻不相同。這激起了許多醫(yī)學(xué)研究者的興趣，2002年研究者發(fā)現(xiàn)RhoGDI2在膀胱癌低侵襲性細(xì)胞中高表達(dá)，而在高侵襲性細(xì)胞株中不表達(dá)，并能抑制細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。是膀胱癌獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測因子［7］。RhoGDI2在體內(nèi)肺鱗癌和腺癌組織中表達(dá)較弱或基本不表達(dá)，并且與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)［8］。在霍奇金淋巴瘤中呈低表達(dá)［9］。在其后的研究中，發(fā)現(xiàn)RhoGDI2在乳腺癌中呈雙向表達(dá)，先升高后降低的兩階段模式，并且表達(dá)的降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。RhoGDI2在不同的腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)水平不同，并且在不同的腫瘤中呈現(xiàn)完全相反的作用，需要更加深入的研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)RhoGDI2在胃癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與胃癌分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。在低分化、T3-4期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期較晚的胃癌組織中顯著表達(dá)，與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要的作用［10］。與國外Cho等相關(guān)的研究獲得相同的結(jié)果［11］。

關(guān)于RhoGDI2在結(jié)直腸癌中的研究，XL Bsc等［12］發(fā)現(xiàn)RhoGDI2在結(jié)直腸癌中表達(dá)與腫瘤大小浸潤深度，Duke′s分期明確相關(guān)，并且可以作為結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測因子。國內(nèi)尚欠缺RhoGDI2在結(jié)直腸癌中蛋白表達(dá)及機(jī)制的研究。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)染色方法，檢測RhoGDI2在結(jié)直腸癌組織中蛋白表達(dá)。結(jié)果表明RhoGDI2在結(jié)直腸癌陽性率高達(dá)57.5%，在癌旁正常組織中表達(dá)陰性。在與病理結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)RhoGDI2的表達(dá)與結(jié)直腸癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。在低分化，T3-4期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Duke?s分期晚的結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著升高，大多數(shù)在細(xì)胞漿中表達(dá)，印戒細(xì)胞中細(xì)胞核中也有表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)表明RhoGDI2在結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用，但是RhoGDI2在結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中的相關(guān)因子及信號(hào)通路仍不明確，需要我們進(jìn)一步的研究?；仡櫹嚓P(guān)文獻(xiàn)RhoGDI2在不同的腫瘤組織中對腫瘤的作用不同，是其調(diào)控因子或者上游因子的作用不同？還是本身的作用機(jī)制和引起的信號(hào)傳導(dǎo)通路不同？目前尚不清楚，仍需要進(jìn)一步的研究。

圖1　RhoGDI2蛋白在正常組織和癌組織中的表達(dá)。A：正常組織表達(dá)陰性（×200）；B：高分化腺癌RhoGDI2表達(dá)陽性（×200）；C：中分化腺癌表達(dá)陽性（×200）；D：低分化腺癌表達(dá)陽性（×200）

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Overexpression of RhoGDI2 protein correlates with tumor invasion and metastasis in colorectal cancer

Lu Shoutang1，3， Wu Suifang2， Jin Meiling3， Wang Qilong3， Zhen Yanan3， Shi Huiyong3， Li Chengjun3， Xu Zhongfa3.1
School of Medicine and life Sciences， University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250200，China；2Department of Medical oncology， Shandong Tumor Hospital， Shandong 250117，China；3Department of Gastrointestinal Surgery， Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250031， China

Xu Zhongfa， Email: xzfa2216@126.com

ObjectiveTo detect the expression of Rho GDP dissociation inhibitor 2 （RhoGDI2）and analyze the function of RhoGDI2 in the colorectal cancer. To discuss the role of RhoGDI2 in the developmetal process of colorectal cancer. MethodsImmunohistochemistry was used to detect RhoGDI2 protein in 153 cases of colorectal cancer and adjacent tissue specimens. ResultsSpecimens from 153 cases of colorectal cancer were selected from Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences between July 2012 and July 2014. RhoGDI2 was expressed mainly in colorectal cancer， mainly in the cytoplasm. The positive rate of RhoGDI2 protien expression was significantly higher in cancer tissue than in normal colorectal tissue （57.5 % vs 0.00%）. RhoGDI2 expression in colorectal cancer tissue with thelow differentiation group was significantly higher than in the high and moderate differentiation group. The expression of RhoGDI2 protein in colorectal cancer was significantly correlated with tumor size （χ2=4.293，P＜0.05）， grade of differentiation （χ2=2.090， P＜0.05）， depth of invasion （χ2=1.711， P＜0.05）， lymph node metastasis （χ2=5.925， P＜0.05）， distant metastasis （χ2=5.519， P＜0.05）， and clinical stage （χ2=5.683，P＜0.05）. RhoGDI2 expression in colorectal cancer was no correlated with gender （χ2=0.037， P＞0.05）、age （＜60 years vs≥60 years） （χ2=0.054， P＞0.05）. ConclusionsRhoGDI2 expression was positively correlated with the invasion and metastasis of colorectal cancer， and RhoGDI2 may play an important role in the occurrence and development of colorectal cancer.

Colorectal neoplasms；Neoplasm metastasis；Invasion；RhoGDI2

2016-04-13）

（本文編輯：楊明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.04.010

山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院青年基金資助項(xiàng)目（No.2012-35）

250200濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院1；250117山東省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2；250031山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科3

徐忠法，Email：xzfa2216@126.com

魯守堂，吳穗芳，金美玲，等. RhoGDI2蛋白的高表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析［J/CD］.中華結(jié)直腸疾病電子雜志， 2016， 5（4）: 328-332.