多種分離方法分離臍血造血細(xì)胞效率的比較

王丹丹 林瑩 武文杰 李茜

摘 要：目的：比較多種分離方法分離臍血造血細(xì)胞的效率。方法：依據(jù)隨機(jī)方法將133例臍血標(biāo)本分為3組，A組選擇HES法，B組選擇Ficoll法，C組選擇明膠法。所有標(biāo)本均進(jìn)行CD34+細(xì)胞檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)。結(jié)果：A組CD34+細(xì)胞產(chǎn)率明顯高于B組，C組CD34+細(xì)胞產(chǎn)率明顯高于B組，A組CD34+細(xì)胞產(chǎn)率明顯C組，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；A組CFCs產(chǎn)率明顯高于B組，C組CFCs產(chǎn)率明顯高于B組，A組CFCs產(chǎn)率明顯C組，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：在分離臍血造血細(xì)胞過程中，HES法的分離效率高于HES法、明膠法。

關(guān)鍵詞：臍血造血細(xì)胞；HES法；Ficoll法；明膠法；效率

臍血造血細(xì)胞分離是臍血移植過程中的重要環(huán)節(jié)，也是臍血庫(kù)建立的關(guān)鍵性步驟，對(duì)血液病患者的疾病治療有著重要的作用。目前，最常見的臍血造血細(xì)胞分離方法為HES法、Ficoll法、明膠法，其中HES法的分離效率較高，其體積濃縮效果較好。本研究將133例臍血標(biāo)本分為3組，3組分別應(yīng)用HES法、Ficoll法及明膠法，比較3組的分離效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共133例臍血標(biāo)本，均由我市某醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，臍血標(biāo)本采集量50.2-140.5ml，平均81.7ml。標(biāo)本采集后保存于4℃的溫度條件下，保存時(shí)間控制在24h之內(nèi)。依據(jù)隨機(jī)方法，將133例臍血標(biāo)本分為3組，A組45例，B組44例，C組44例。

1.2 方法

1.2.1 HES法

A組45例標(biāo)本選擇HES法，即在整份臍血中加入25%的羥乙基淀粉60g/L，混合均勻后進(jìn)行500r/min離心處理，時(shí)間控制在5min，之后去掉紅細(xì)胞，再進(jìn)行1200r/min離心處理，時(shí)間控制在13min，將部分血漿去掉，確保體積濃縮至25ml左右，最后將白細(xì)胞重懸在剩余的血漿中。

1.2.2 Ficoll法

B組44例標(biāo)本選擇Ficoll法，即選擇Ficoll 10ml，相對(duì)密度為1.077，將其置于離心管（50ml）中。每例標(biāo)本取10ml臍血，并置于液面上，之后進(jìn)行1800r/min離心處理，時(shí)間控制在10min，選擇白細(xì)胞層重懸在RPMI 1640培養(yǎng)液10ml中。

1.2.3 明膠法

C組44例標(biāo)本選擇明膠法，即從44例標(biāo)本中順利取出20ml，并放置于離心管（50ml）與30g/L明膠（20ml）中，混合均勻后，進(jìn)行30min沉降處理，之后將上清液置于另一個(gè)離心管（50ml）中，添加50% 30g/L明膠，進(jìn)行30min沉淀處理，保留上清液。

1.2.4 CD34+細(xì)胞檢測(cè)

抗體主要選擇美國(guó)Pharmigen公司生產(chǎn)的抗人CD34抗體，同時(shí)選擇美國(guó)BectonDick-inshon公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。將抗體20μl置入臍血100μl中，混合均勻后在4℃溫度條件下進(jìn)行30min孵育，選擇氯化銨裂解紅細(xì)胞，時(shí)間控制在30min，之后進(jìn)行兩次PBS洗滌，選擇多聚甲醛進(jìn)行固定后再實(shí)施檢測(cè)，同時(shí)開淋巴細(xì)胞窗。

1.2.5 造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)

選擇體外培養(yǎng)方法，培養(yǎng)體系主要選擇甲基纖維素半固體培養(yǎng)基，其包括四個(gè)成分，即白細(xì)胞介素-3（10ng/ml）、粒細(xì)胞集落刺激因子（200ng/ml）、干細(xì)胞因子（50ng/ml）、紅細(xì)胞生成素（1U/ml）。選擇2×105個(gè)有核細(xì)胞，將其置于2ml培養(yǎng)體系中，并在體積分?jǐn)?shù)保持在5% CO2、溫度保持在37℃基礎(chǔ)上進(jìn)行14d的培養(yǎng)，之后分別計(jì)數(shù)BFU-E、CFU-GM以及CFU-Mix，同時(shí)準(zhǔn)確計(jì)算出三者之和，即CFCs[1]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選擇SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，選擇ANOVA與 Bonferroni 兩兩比較方法進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD34+細(xì)胞產(chǎn)率

A組分離前CD34+細(xì)胞為（8.81±1.90）×107，分離后CD34+細(xì)胞為（8.67±1.67）×107，產(chǎn)率為（98.15±5.68）%；B組分離前CD34+細(xì)胞為（1.08±0.40）×107，分離后CD34+細(xì)胞為（0.36±0.01）×107，產(chǎn)率為（32.85±4.77）%；C組分離前CD34+細(xì)胞為（2.17±0.69）×107，分離后CD34+細(xì)胞為（2.08±10.36）×107，產(chǎn)率為（81.46±5.93）%。A組CD34+細(xì)胞產(chǎn)率高于B組，C組CD34+細(xì)胞產(chǎn)率高于B組，A組CD34+細(xì)胞產(chǎn)率高于C組，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 CFCs產(chǎn)率

A組分離前 CFCs為（2.41±0.31）×106，分離后CFCs為（2.20±0.33）×106，產(chǎn)率為94.56%；B組分離前 CFCs為（3.07±0.40）×105，分離后CFCs為（9.57±0.86）×104，產(chǎn)率為30.87%；C組分離前 CFCs為（5.88±0.81）×105，分離后CFCs為（5.22±0.58）×105，產(chǎn)率為78.49%。A組CFCs產(chǎn)率高于B組，C組CFCs產(chǎn)率高于B組，A組CFCs產(chǎn)率高于C組，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

臍血是臨床醫(yī)學(xué)中重要的造血干細(xì)胞來源，其可以替代骨髓實(shí)施造血干細(xì)胞移植，在血液疾病治療中發(fā)揮重要的作用。在臍血移植及臍血庫(kù)建立中，臍血干細(xì)胞分離技術(shù)起著積極性的作用，科學(xué)、有效的分離技術(shù)可以快速分離臍血中的有核細(xì)胞，為臍血庫(kù)的建立奠定基礎(chǔ)[2]。

Ficoll法、明膠法、HES法是目前科研中廣泛應(yīng)用的臍血干細(xì)胞分離方法，不同的分離方法，其對(duì)造血細(xì)胞回收所產(chǎn)生的影響也有所不同，分離效率也不盡相同。運(yùn)用Ficoll法進(jìn)行分離，CD34+細(xì)胞損失超過60%以上，干細(xì)胞丟失嚴(yán)重，且每次僅可分離出較少的臍血量，在臍血庫(kù)建立中存在一定的局限性。應(yīng)用明膠法分離時(shí)，CD34+細(xì)胞損失率低于Ficoll法，CFCs損失率也比較低，對(duì)臍血庫(kù)建立非常有利，但經(jīng)明膠分離后，終體積所占的比率比較大，約為原體積的75%。HES法具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)少、分離效率高、體積濃縮效果好等多種優(yōu)點(diǎn)，其CD34+細(xì)胞損失率通常不超過5%，CFCs損失率通常不超過10%，且其分離后終體積所占的比率比較小，通常不超過原體積的25%。本研究將133例臍血標(biāo)本分為3組，A組應(yīng)用HES法，B組應(yīng)用Ficoll法，C組應(yīng)用明膠法，結(jié)果顯示，A組CD34+細(xì)胞產(chǎn)率及CFCs產(chǎn)率均高于B組、C組，證實(shí)HES法分離臍血造血細(xì)胞的效率高于Ficoll法、明膠法。

綜上所述，在分離臍血造血細(xì)胞中，HES法分離效率較高，其分離效果優(yōu)于Ficoll法與明膠法，有助于臍血庫(kù)建立，是分離臍血造血細(xì)胞首選的方法，值得推廣。

參考文獻(xiàn)

[1]王穎超，殷楚云，馮磊，等.三種不同方法分離臍血造血干細(xì)胞的效果比較[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2012，27（10）：766-768+794.

[2]陳林，張坤，邵文陶，等.臍帶血造血干細(xì)胞分離凍存方法優(yōu)化[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2014，28（12）：82-86.