錢(qián)卓真 羅冬蓮 羅方方 湯水粉

摘要建立了測(cè)定水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境沉積物中多肽類抗生素殘留量的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。沉積物經(jīng)10 mL甲醇檸檬酸Na2HPO4溶液（3∶4， V/V）超聲提取2次，0.5 g乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合除雜，5 mL甲基異丁基甲酮凈化，HLB固相萃取柱進(jìn)一步富集凈化，MGII C18色譜柱分離，0.1%甲酸與0.1%甲酸乙腈梯度洗脫，ESI+電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）監(jiān)測(cè)，外標(biāo)法定量。粘菌素和桿菌肽在10～10000 μg/L范圍內(nèi)，維吉尼霉素M1在4～4000 μg/L范圍內(nèi)，線性回歸系數(shù)均大于0.999，方法檢出限為2～5 μg/kg，方法定量限為4～10 μg/kg。在3個(gè)濃度添加水平下，多肽類抗生素回收率79.7%～91.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.9%～10.8%。本方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，靈敏度高，適用范圍廣。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法； 水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境； 沉積物； 多肽類藥物； 殘留

1引言

粘菌素（Colistin）、桿菌肽（Bacitracin）和維吉尼霉素M1（Virginiamycin M1）屬于多肽類抗生素。其中，桿菌肽具有一定腎毒性和神經(jīng)毒性； 粘菌素易引起耐藥菌的產(chǎn)生； 而維吉尼霉素M1對(duì)人體腸道菌群環(huán)境具有一定破壞作用，易引起腹瀉或維生素缺乏等癥狀[1，2]。歐盟委員會(huì)早在1999年就禁止在動(dòng)物源性食品生產(chǎn)和加工過(guò)程中使用桿菌肽、維吉尼霉素等4種抗生素 [3]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也在2002年《無(wú)公害食品 漁用藥物使用準(zhǔn)則（NY 50712002）》中將桿菌肽列為漁業(yè)禁用藥物。但由于多肽抗生素具有高效廉價(jià)的特點(diǎn)，仍常被作為飼料添加劑和藥物用于動(dòng)物養(yǎng)殖 [4]。這類藥物相對(duì)不易降解，會(huì)通過(guò)飼料及動(dòng)物排泄物進(jìn)入養(yǎng)殖環(huán)境并持續(xù)累積，進(jìn)而通過(guò)食物鏈蓄積作用進(jìn)入人體，對(duì)人體器官產(chǎn)生蓄積毒性作用，危害人體健康[5～7]。此類藥物會(huì)殺滅水環(huán)境中有益微生物，破壞水體微環(huán)境的生態(tài)平衡。

近年，有關(guān)多肽類抗生素殘留檢測(cè)的方法研究多集中在動(dòng)物組織、飼料、牛奶等方面[8～12]，有關(guān)養(yǎng)殖環(huán)境中多肽類抗生素測(cè)定研究較少。羅方方等[13]測(cè)定了海水中桿菌肽殘留量，但這些方法均不適用于養(yǎng)殖環(huán)境沉積物中多肽類抗生素的測(cè)定。沉積物類似一個(gè)大型的蓄積池[14，15]，相較于動(dòng)物組織、飼料、牛奶等樣品更為復(fù)雜，其含有不等量的重金屬和有機(jī)質(zhì)雜質(zhì)。該類雜質(zhì)不僅會(huì)損傷質(zhì)譜儀，而且會(huì)完全抑制多肽類抗生素在電噴霧質(zhì)譜上的響應(yīng)，從而影響靈敏度。針對(duì)上述難點(diǎn)，本研究以水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的沉積物為研究對(duì)象，建立沉積物中多肽類抗生素殘留量測(cè)定的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、試劑和樣品

TSQ Quantum Access高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司），配電噴霧離子源； AB204E型、PL203型電子分析天平（Mettler Toledo 公司）； 離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）； MS3型旋渦混合器（德國(guó)IKA公司）； KQ600DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； ZZDCH16水浴氮吹儀（廣州智真生物科技有限公司）。

硫酸粘菌素（CS，純度78.3%）、 桿菌肽（BTC，純度77.0%）、 維吉尼霉素M1（VGMM1，純度95.0%）均購(gòu)自德國(guó)Dr公司； 甲基異丁基甲酮（MIBK）、乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Tidea公司）； 乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、一水檸檬酸、十二水磷酸氫二鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 0.22 μm尼龍針式過(guò)濾器（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； Oasis HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL； 美國(guó)Waters公司）； 水為MilliQ制備的超純水（美國(guó)Millipore公司）。

沉積物采自漳州、莆田及泉州的水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，采樣深度0～20 cm； 共10個(gè)，包括泥質(zhì)、泥沙、沙質(zhì)3種類型沉積物，每個(gè)樣品重約500 g。沉積物樣品經(jīng)冷凍干燥機(jī)干燥24 h后研磨，過(guò)80目篩，4℃保存。其中沉積物樣品的含水率13.4%～49.5%，有機(jī)質(zhì)含量0.43%～2.02%。

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取硫酸粘菌素25.5 mg、桿菌肽26 mg，用0.1%甲酸溶液配制成200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液； 稱取維吉尼霉素M110.5 mg，用甲醇配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液； 4℃下避光保存（稱取標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量是按純度修正過(guò)的質(zhì)量）。配制0.1 mol/L檸檬酸0.2 mol/L Na2HPO4緩沖溶液（1000∶625， V/V）； 甲醇檸檬酸Na2HPO4混合溶液（3∶4， V/V）； 定容液： 0.1%甲酸乙腈混合溶液（8∶2， V/V）。

2.3樣品前處理

稱取 5 g±0.05 g 過(guò)篩后的沉積物樣品于50 mL離心管內(nèi)，依次加入Na2EDTA 0.5 g、甲醇檸檬酸Na2HPO4混合溶液10 mL，2000 r/min渦旋混合1 min，超聲提取10 min，3500 r/min離心5 min，取上清液，殘?jiān)貜?fù)提取1次，合并上清液至另一個(gè)離心管。上述清液中加入MIBK 5 mL，2000 r/min渦旋混合1 min，3500 r/min離心5 min，將上層液轉(zhuǎn)移至15 mL玻璃試管中，重復(fù)上述操作一次。合并兩次MIBK提取液，于40℃氮吹至干，甲醇1 mL復(fù)溶后，與下層液合并，待固相萃取柱凈化。

Oasis HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水預(yù)活化，上樣， 10 mL水淋洗，控制流速為每秒1滴， 以甲醇3 mL、0.1%甲酸甲醇溶液3 mL依次洗脫，收集全部洗脫液，于40℃氮吹至干。以1 mL定容液復(fù)溶，混勻，過(guò)膜，待測(cè)定。

2.4色譜條件

CAPCELL PAK MGII C18色譜柱（150 mm×2.0 mm， 5 μm）； 柱溫25℃； 流速0.2 mL/min； 進(jìn)樣量10 μL； 流動(dòng)相： A 為0.1%甲酸，B 為0.1%甲酸乙腈； 洗脫梯度： 0～2 min，90% A； 2～4 min，90%～25% A； 4～9 min，25% A； 9～10 min， 25%～90% A； 10～12 min，90% A。

2.5質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子檢測(cè)模式，噴霧電壓： 4500 V，霧化氣壓： 241 kPa，輔助氣壓： 13.8 kPa，離子傳輸毛細(xì)管溫度： 350℃，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表1，Q1半峰寬： 0.7 Da，Q3半峰寬： 0.7 Da，碰撞氣壓力： 氬氣，1.2 mTorr。標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

3結(jié)果與討論

3.1提取劑的選擇

3種多肽類抗生素溶解性差異較大，單一試劑均不可達(dá)到理想的提取效果[16，17]。分別以乙腈0.1%甲酸溶液、甲醇0.1%甲酸溶液、乙腈檸檬酸Na2HPO4溶液和甲醇檸檬酸Na2HPO4溶液作為提取劑。結(jié)果表明，甲醇0.1%甲酸溶液和甲醇檸檬酸Na2HPO4溶液提取效果差異不大。但由于后續(xù)步驟需使用Na2EDTA，且Na2EDTA在溫和pH條件下才會(huì)發(fā)揮作用，故選擇甲醇檸檬酸Na2HPO4溶液作為提取劑。同時(shí)比較了提取劑與抗生素溶液的體積比對(duì)提取效果的影響，二者比例為3∶4時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)的提取效率最高。

3.2乙二胺四乙酸二鈉用量的選擇

沉積物基質(zhì)復(fù)雜，其中含有不等量的重金屬和有機(jī)質(zhì)等復(fù)雜雜質(zhì)[18～20]。在電噴霧質(zhì)譜條件下，該雜質(zhì)會(huì)對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生明顯離子抑制作用，完全抑制粘菌素和桿菌肽電離。由圖2a可見(jiàn)，加入適量Na2EDTA可除去部分雜質(zhì)，消除部分離子抑制作用，有效降低雜質(zhì)影響。實(shí)驗(yàn)以泥質(zhì)沉積物為基質(zhì)，比較了未加入Na2EDTA和分別加入0.25，0.50，0.75和1.0 g Na2EDTA對(duì)3種目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明，加入0.5 g Na2EDTA，目標(biāo)物的回收率最高。

3.3凈化溶液的選擇

雖然通過(guò)Na2EDTA的絡(luò)合作用可除去部分重金屬雜質(zhì)，但殘留在提取液中的金屬絡(luò)合物仍對(duì)粘菌素和桿菌肽的回收率造成嚴(yán)重影響。質(zhì)譜全掃描發(fā)現(xiàn)， 存在的干擾物質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)分子量接近，在電噴霧質(zhì)譜條件下，該類干擾物質(zhì)容易對(duì)目標(biāo)物質(zhì)形成離子抑制作用（圖2a質(zhì)譜圖）。實(shí)驗(yàn)比較了不同凈化溶液的凈化效率，研究表明，MIBK可進(jìn)一步去除目標(biāo)物質(zhì)分子量接近的雜質(zhì)，完全消除雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的離子抑制作用，使得目標(biāo)物在電噴霧質(zhì)譜上有明顯響應(yīng)（圖2b）。

由于維吉尼霉素M1易溶于有機(jī)試劑，故部分維吉尼霉素M1被MIBK浸提出來(lái)，影響維吉尼霉素M1的提取。為消除MIBK對(duì)維吉尼霉素M1提取效率的影響，MIBK層氮吹至干后，用甲醇將溶于MIBK中的維吉尼霉素M1反萃取出來(lái)。最終將此甲醇溶液合并于提取液中，經(jīng)固相萃取柱凈化后再進(jìn)行檢測(cè)， 3種目標(biāo)物的回收率均達(dá)到了檢測(cè)要求。實(shí)驗(yàn)比較了3， 5， 10和15 mL MIBK的凈化效果（圖3），即使添加少量MIBK，3種目標(biāo)物的回收率均可以達(dá)到理想效果，為了充分降低絡(luò)合物的影響， MIBK分兩次凈化，每次5 mL。

3.4凈化方法的選擇

實(shí)驗(yàn)比較Oasis HLB固相萃取柱和SAX 強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱對(duì)目標(biāo)物凈化效果和回收率的影響。結(jié)果表明，Oasis HLB固相萃取柱凈化效果好，總體回收率均大于70%，同時(shí)對(duì)洗脫溶劑進(jìn)行優(yōu)化。由表2可知，甲醇作為洗脫溶劑，維吉尼霉素M1充分洗脫，但粘菌素和桿菌肽洗脫不完全； 0.1%甲酸甲醇作為洗脫溶劑，洗脫現(xiàn)象正好相反。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)采用3 mL甲醇、3 mL 0.1%甲酸甲醇溶液依次洗脫。

3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限和定量限

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法，移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用空白沉積物樣品提取液分別配制成不同質(zhì)量濃度基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，粘菌素和桿菌肽濃度分別為10， 50， 500， 1000， 2500， 5000和10000 μg/L，維吉尼霉

素M1的濃度分別為4， 20， 200， 400， 1000， 2000和4000 μg/L。 各組分濃度與其色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系， 線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

以3倍信噪比（S/N）計(jì)算，粘菌素、桿菌肽、維吉尼霉素M1檢出限分別為5， 5和2 μg/kg； 以10倍信噪比（S/N）計(jì)算，粘菌素、桿菌肽、維吉尼霉素M1定量限分別為10， 10和4 μg/kg。

3.6方法準(zhǔn)確度和精密度

以實(shí)際采集的養(yǎng)殖區(qū)泥質(zhì)為研究對(duì)象進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)，粘菌素和桿菌肽添加水平分別為10， 100和1000 μg/kg，維吉尼霉素M1添加水平分別為4， 40和400 μg/kg，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，考察方法的準(zhǔn)確度及精密度，平均回收率為79.7%～91.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～10.8%（表3）。20天內(nèi)100 μg/kg加標(biāo)濃度下進(jìn)行6次標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)，考察方法日間精密度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～11.1%（表3）。方法的精密度和準(zhǔn)確度均能滿足藥物殘留監(jiān)測(cè)需求。選取3種類型的沉積物（泥質(zhì)、泥沙、沙質(zhì)）為對(duì)象，100 μg/kg加標(biāo)濃度下考察方法適用性，回收率為78.1%～84.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～9.6%（表4）。結(jié)果表明，本方法適用范圍廣。

3.7實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法測(cè)定漳州東山灣沿岸水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)3個(gè)采樣點(diǎn)的沉積物樣品，均未檢出上述3 種目標(biāo)物。

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