易青 苗虹 吳永寧

摘要：建立了食品中氯丙醇類化合物的非衍生化在線凝膠滲透色譜氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Online GPCGCMS/MS）測定方法，目標(biāo)化合物包括3氯1，2丙二醇（3MCPD）、2氯1，3丙二醇（2MCPD）、1，3二氯2丙醇（1，3DCP）和2，3二氯1丙醇（2，3DCP）。樣品中加入氘代同位素內(nèi)標(biāo)后，采用ExtrelutTM NT硅藻土進行固相支持液液萃取凈化，用正己烷淋洗去除非極性雜質(zhì)，以乙酸乙酯萃取目標(biāo)物，萃取液經(jīng)濃縮后直接采用Online GPCGCMS/MS測定。4種氯丙醇在0.005～1.000 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，4種氯丙醇的檢出限在0.002～0.005 mg/kg之間，定量限在0.005～0.01 mg/kg之間。以空白醬油樣品為代表性基質(zhì)的3個水平（0.02， 0.1和0.5 mg/kg ）的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD， n=6）分別為94.8%～106.3%（2.2%～10.3%）， 91.8%～108.8%（2.1%～10.6%）和83.1%～109.4%（1.3%～9.4%）。采用本方法分別對醬油、水解植物蛋白液（粉）、料酒、雞精、面包和糕點樣品進行檢測，均得到了滿意的測定結(jié)果。

關(guān)鍵詞 ：食品； 氯丙醇； 在線凝膠滲透色譜氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 固相支持液液萃取凈化； 非衍生化

1 引 言

氯丙醇類化合物（包括3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP）早期在于酸水解植物蛋白液及以其為原料的調(diào)味品（如醬油等）中發(fā)現(xiàn)[1～3]，之后又陸續(xù)在面包、香腸、咖啡、谷物類等食品中檢出[4～8]。

毒理學(xué)研究表明，3MCPD可以通過血睪屏障和血腦屏障，并在體液中廣泛分布，具有生殖、腎臟和神經(jīng)毒性[9，10]。WHO/FAO食品添加劑和污染物聯(lián)合專家委員會（JECFA）確定1，3DCP具有體外遺傳毒性和生殖毒性，會引起大鼠肝、腎臟、甲狀腺等的癌變[11]；2，3DCP會對肝、腎臟及精子產(chǎn)生影響[11]。

目前，食品中氯丙醇的檢測通常采用七氟丁酰咪唑（HFBI）、七氟丁酰酐（HFBA）[12]、三氟乙酸酐（TFAA）[13]和苯硼酸[1]等衍生試劑將氯丙醇衍生，利用氣相色譜質(zhì)譜（GCMS或GCMS/MS）法進行測定[14～18]。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 5009.1912006《食品中氯丙醇含量的測定》中氯丙醇的測定采用的是以HFBI衍生化的GCMS方法[19]。在上述方法中，衍生化步驟繁冗復(fù)雜；衍生物穩(wěn)定性較差，需衍生后盡快完成測定；衍生試劑昂貴，增加樣品檢測成本，并且對環(huán)境濕度要求極高，否則易吸潮變質(zhì)。

Online GPCGCMS是將凝膠滲透色譜和GCMS在線聯(lián)用的分析檢測技術(shù)，能將樣品凈化液中分子量較大的脂類、色素等干擾物質(zhì)與目標(biāo)物分離，減少基質(zhì)影響，降低分析背景，提高重現(xiàn)性，實現(xiàn)連續(xù)自動的部分前處理和儀器測定的在線分析，加快分析速度和提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。與GCMS相比，GCMS/MS將離子碎片施予適當(dāng)能量再次打碎，形成二級離子碎片，增強了結(jié)構(gòu)解析和定性能力，更有效地排除基質(zhì)干擾。本研究建立了非衍生化的Online GPCGCMS/MS法直接測定食品中氯丙醇的檢測方法，同時對食品樣品的前處理方法進行了優(yōu)化。本方法對樣品的適用性廣泛，不僅適用于調(diào)味品，也適用于面包、糕點等其它食品樣品。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

Online GPCGCMS/MS系統(tǒng)（日本Shimadzu公司），GPC系統(tǒng)包括SIL20ADvp自動進樣器、ShodexEV200AC凝膠滲透色譜柱（150 mm × 2 mm）、CTO20ASvp柱溫箱、SPD20Avp紫外檢測器；GCMS/MS系統(tǒng)包括QP2010Plus氣相色譜儀、TQ8040型質(zhì)譜聯(lián)用儀，并配有PTV2010大體積進樣器；MilliQ超純水器（美國Millipore公司）；G560E型渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；NEVAPTM111型吹氮濃縮儀（美國Organomation Associates公司）；G560E渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；AL204分析天平（瑞士梅特勒公司）；NDO400型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）。

3MCPD（純度98%，德國Aldrich公司）；五氘代3氯1，2丙二醇（D53MCPD，純度≥99%，德國DrEhrenstorfer公司）；1，3DCP、2，3DCP、五氘代1，3二氯2丙醇（D51，3DCP）和五氘代2，3二氯1丙醇（D52，3DCP）（純度≥97%，德國Fluka公司）；2MCPD、五氘代2氯1，3丙二醇（D52MCPD）（純度≥98%，加拿大TRC公司）；正己烷、乙酸乙酯（色譜純，美國J.T. Baker公司）；無水Na2SO4（優(yōu)級純，天津市津科精細化工研究所，使用前經(jīng)195℃烘烤8 h使用）；ExtrelutTM NT硅藻土填料（德國Merck公司）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取各氯丙醇和氘代氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg），用乙酸乙酯溶解并定容至不同的10 mL棕色容量瓶中，配制成1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于20℃貯存。準(zhǔn)確吸取各氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液， 用正己烷逐級稀釋，配制成10 mg/L氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。準(zhǔn)確吸取各氘代氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用正己烷稀釋，配制成10 mg/L氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別準(zhǔn)確吸取適量氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液和適量氘代氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)使用液， 用正己烷稀釋，配制成0.01， 0.02， 0.05， 0.1， 0.2， 0.5和1.0 mg/L的氯丙醇系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中氘代氯丙醇的含量均為0.2 mg/L。

2.3 實驗方法

2.3.1 樣品提取與凈化 準(zhǔn)確稱取2 g試樣于10 mL離心管中（若為固體或半固體試樣，則加入2 mL水，溶解后混勻），加入10 mg/L氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)使用液20 μL，渦旋30 s，加入到填充了2 g ExtrelutTM NT硅藻土填料的塑料層析柱（180 mm × 150 mm）中，靜置10 min，用3 mL正己烷淋洗，棄去流出液，以10 mL乙酸乙酯進行固相支持液液萃取，收集流出液至裝有3 g無水Na2SO4的離心管中，充分吸收水分，轉(zhuǎn)移上清液并于30℃以氮氣吹至近干，用正己烷定容至1 mL，渦旋混勻，無水Na2SO4除水，待測。

2.3.2 Online GPCGCMS/MS條件 Online GPC條件：泵流速0.1 mL/min；柱溫40℃；載氣吹掃0.1 min； 流動相為丙酮環(huán)己烷（3∶7， V/V）。

氣相色譜質(zhì)譜條件： 氣相色譜柱系統(tǒng)包括空柱（惰性石英管，5 m × 0.53 mm）、預(yù)柱（DB5MS石英毛細管柱，5 m × 0.25 mm × 0.25 μm）和分析柱（DB5MS石英毛細管柱，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。進樣體積：10 μL，不分流進樣。進樣口程序升溫：120℃保持5 min，以100℃/min升至280℃，并恒溫15.9 min。進樣時間：7 min；柱溫箱程序升溫：82℃保持5 min，以8℃/min升至150℃，繼續(xù)以25℃/min升至250℃，并保持5 min。載氣：高純氦氣（純度99.999%），流速為1.75 mL/min。離子源：電子轟擊源，溫度為200℃。溶劑延遲時間為10 min。采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）掃描，主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 Online GPC收集時間考察

Online GPCGCMS/MS的原理是樣品經(jīng)Online GPC柱分離，廢液通過六通閥排出，含有目標(biāo)物的餾分先被儲存在定量補集環(huán)路（200 μL）中，再全部注入GC，通過溶劑蒸汽出口排出溶劑，同時目標(biāo)分析物保存在預(yù)柱中。待溶劑排出口關(guān)閉后柱，柱溫箱開始升溫，目標(biāo)物進入分析柱分離，因此收集時間的選擇顯得尤為重要。配制0.5 mg/L氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進樣5次，獲得目標(biāo)物在GPC上保留時間為3.99～ 4.05 min，考慮到靈敏度和基質(zhì)去除效果，確定收集時間為3.80～4.25 min。氯丙醇及其內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 mg/L）的MRM質(zhì)譜圖見圖1， 各氯丙醇的色譜圖見圖2和圖3。

3.2 樣品凈化方法的優(yōu)化

文獻 [20，21]利用ExtrelutTM NT硅藻土進行固相支持液液萃取凈化，測定食用植物油中的氯丙醇，使提取液先吸附于硅藻土表面，經(jīng)正己烷淋洗去除脂肪和色素后，以乙酸乙酯與吸附于硅藻土表面的氯丙醇進行液液萃取。本實驗對乙酸乙酯溶劑（純度≥99%）的用量（2， 4， 6， 8， 10和12 mL）進行了優(yōu)化，結(jié)果見圖4，當(dāng)乙酸乙酯用量為10 mL時，各氯丙醇的峰面積響應(yīng)值最高。因此，乙酸乙酯用量選擇10 mL。

考慮到Online GPC的在線凈化能力以及簡化實驗操作，比較了不經(jīng)填料吸附直接進行液液萃取凈化的傳統(tǒng)方法與以ExtrelutTM NT硅藻土進行的固相支持液液萃取凈化方法的效果，以空白醬油樣品添加回收實驗的方式（0.2 mg/L）測得4種氯丙醇的回收率分別為53.2%～81.2%和83.3%～110.1%。結(jié)果表明，以ExtrelutTM NT硅藻土進行的固相支持液液萃取凈化的效果更好、準(zhǔn)確度更高。

3.3 方法學(xué)驗證

3.3.1 線性范圍、檢出限和定量限 以氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)使用液及氯丙醇內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液配制濃度分別為0.005， 0.01， 0.02， 0.05， 0.1， 0.2， 0.5和1.0 mg/L（內(nèi)標(biāo)濃度均為0.2 mg/L）的氯丙醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)Online GPCGCMS/MS測定。以氯丙醇的色譜峰峰面積與其對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰面積之比（y）為縱坐標(biāo)，氯丙醇與其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的濃度之比（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見表2。4種氯丙醇在0.005～1.0 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R）均大于0.999。

在空白醬油樣品中添加0.001， 0.002， 0.005和0.010 mg/L 4個水平的3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP標(biāo)準(zhǔn)樣品。以3倍信噪比（S/N=3）所對應(yīng)的含量作為方法的檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）所對應(yīng)的含量作為方法的定量限（LOQ），得到氯丙醇類化合物的檢出限在0.002～0.005 mg/kg之間， 定量限在0.005～0.01 mg/kg之間，結(jié)果見表2。與文獻[19]報道的衍生化方法相比，本方法的檢出限更低（表3）。

3.3.2準(zhǔn)確度與精密度 以空白醬油加標(biāo)回收率表示方法的準(zhǔn)確度，以回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示方法的精密度。在空白醬油樣品中添加0.02， 0.1和0.5 mg/L的3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP， 2，3DCP標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個加標(biāo)水平平行測定6份，結(jié)果見表4。4種氯丙醇的3個水平加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為94.8%～106.3%（2.2%～10.3%）， 91.8%～108.8%（2.1%～10.6%）和83.1%～109.4%（1.3%～9.4%）。結(jié)果表明，方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

3.4 實際樣品分析

利用本方法對于北京地區(qū)超市、農(nóng)貿(mào)市場及相關(guān)食品企業(yè)采集的78份食品樣品（其中包括醬油20份、料酒16份、面包糕點21份、雞精15份、水解植物蛋白液3份、水解植物蛋白粉3份）進行了檢測，結(jié)果見表5。在檢測的78份樣品中，3MCPD的檢出率最高，為100%（78/78），2MCPD的檢出率為67.9%（53/78），1，3DCP和2，3DCP的檢出率相對較低。依據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB27622012《食品中污染物限量》[22]對液態(tài)調(diào)味品和固態(tài)調(diào)味品中3MCPD的限量標(biāo)準(zhǔn)（0.4和1.0 mg/kg），醬油、水解植物蛋白液、水解植物蛋白粉、料酒、雞精樣品超標(biāo)率依次為4/20， 2/3， 1/3， 2/16， 0/15。由樣品檢測結(jié)果可見，某些食品中氯丙醇污染水平仍然較高，因此有必要對食品中氯丙醇污染進行監(jiān)測，并采取相應(yīng)的監(jiān)督管理措施。

4 結(jié) 論

結(jié)合固相支持液液萃取凈化樣品前處理技術(shù)，建立了無需衍生化反應(yīng)的Online GPCGCMS/MS同時測定食品中氯丙醇的方法。通過線性實驗、空白加標(biāo)回收實驗等方法學(xué)實驗驗證了方法的準(zhǔn)確性。與傳統(tǒng)的GCMS衍生化方法相比，本方法簡便、快速、經(jīng)濟，適于食品中氯丙醇的檢測。實際樣品檢測結(jié)果表明，不同食品中仍存在氯丙醇污染超過我國相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)象，因此有必要加強監(jiān)測及相應(yīng)的監(jiān)督管理措施。

References

1 Baer I， Calle B I， Taylor P. Anal. Bioanal Chem.， 2010， 396： 443-456

2 Velíek J， Davidek J， Hajlová J， Kubelka V， Janíek G， Mánková B. Zeitschrift Fur LebensmittelUntersuchung UndForschung， 1978， 167（4）： 241-244

3 Collier P D，Cromie D D O， Davies A P. J. Am. Oil Chem. Soc.， 1991， 68： 785-790

4 Anna R S， Ewa C. J. Verbr. Lebensm.， 2015， 10： 117-122

5 Belitz H D， Grosch W， Schieberle P. Food Chemistry. Berlin Heidelberg： Springer， 2009： 938-970

6 Dolezal M， Chaloupska M， Divinova V， Svejkovska B， Velisek J. Eur. Food Res. Technol， 2005， 221： 221-225

7 Svejkovska B， Novotny O， Divinova V， Reblova Z， Dolezal M， Velisek J. Czech J. Food Sci.， 2004， 22（5）： 190-196

8 Chung H Y， Chung S W C， Chan B T P， Ho YY， Xiao Y. Food Addit. Contam. A， 2013， 30（9）： 1508-1512

9 Jones A R， Chantrill L A. Reprod. Fert. Develop.， 1989， 1： 357-367

10 Hamlet C G， Sadd P A， Gray D A. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52（7）： 2067-2072

11 JECFA. JECFA Monograph on the Safety Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants.， 2001

12 LI YongJun， HUANG ZhiQiang， DAI Hua. Chin. J. Anal. Lab.， 2003， 22（4）： 47-49

李擁軍， 黃志強， 戴 華. 分析試驗室， 2003， 22（4）： 47-49

13 LUO RenCai， JIN QingZhong， ZHANG Zheng， ZHOU Shan， LI Jie. Food Sci.， 2000， 21（7）： 36-37

羅仁才， 金慶中， 張 正， 周 珊， 李 潔. 食品科學(xué)， 2000， 21（7）： 36-37

14 FU WuSheng， WU YongNing， ZHAO YunFeng， MA JinBo， ZHANG Qi. Chin. J. Food Hyg.， 2004， （4）： 289-294

傅武勝， 吳永寧， 趙云峰， 馬金波， 張 琦. 中國食品衛(wèi)生雜志， 2004， （4）： 289-294

15 GAO Jie. Chin.Brew.， 2013， 32（9）： 145-147

高 潔. 中國釀造， 2013， 32（9）： 145-147

16 HUANG Qi， JI XiaoJuan， WANG DanDan. J. Zhejiang. Univer. Sci. Techn.， 2013， 25（1）： 33-37

黃 琦， 季曉娟， 王丹丹. 浙江科技學(xué)院學(xué)報， 2013， 25（1）： 33-37

17 XU XiaoMin， SHEN XiangHong， SONG GuoLiang. REN YiPing. Chin. J. Heal. Lab. Techn.， 2006， （6）： 661-662

徐小民， 沈向紅， 宋國良， 任一平. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2006， （6）： 661-662.

18 YANG XueQin， LU LiXia， XIONG XiaoHui. Food Res. Develop.， 2008， 29（7）： 162-164

楊雪芹， 陸利霞， 熊曉輝. 食品研究與開發(fā)， 2008， 29（7）： 162-164

19 GB/T 5009.1912006， Ministry of Health of the People′s Republic of China. Determination of Chloropropanols in Foods， 2006

GB/T 5009.1912006， 中華人民共和國衛(wèi)生部. 食品中氯丙醇含量的測定， 2006

20 LI Shan， MIAO Hong， CUI Xia， ZHAO YunFeng， WU YongNing. Chin. J. Prev. Med.， 2015， 49（6）： 102-107

李 珊， 苗 虹， 崔 霞， 趙云峰， 吳永寧. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2015， 49（6）： 102-107

21 CUI Xia， DING Hao， ZOU JianHong， LI Shan， MIAO Hong， FU WuSheng， ZHAO YunFeng， WU YongNing. Food Sci.， 2014， 35（12）： 98-102

崔 霞， 丁 灝， 鄒建宏， 李 珊， 苗 虹， 傅武勝， 趙云峰， 吳永寧. 食品科學(xué)， 2014， 35（12）： 98-102

22 GB/T 2762-2012， Ministry of Health of the People′s Republic of China. The Limit of Contaminants in Foods， 2012

GB/T 2762-2012， 中華人民共和國衛(wèi)生部. 食品中污染物限量， 2012

Abstract A derivatizationfree method for chloropropanols determination in food using online gel permeation chromatographygas chromatographytriple quadrupole mass spectrometry （Online GPCGCMS/MS） with free of derivatization was established. The target compounds were 3monochloropropane1，2diol （3MCPD）， 2monochloropropane1，3diol （2MCPD）， 1，3dichloropropan2ol （1，3DCP） and 2，3dichloropropan1ol （2，3DCP）. Samples were spiked with isotope internal standards， and extracted by matrix solidsupported liquidliquid extraction on the ExtrelutTM NT absorbent. Hexane was added to wash away the apolar matrix interferences and then ethyl acetate was used to extract the target compounds. The concentrated extracts were directly injected into Online GPCGCMS/MS. The good linear relationships for the four types of analytes were obtained in the concentration range of 0.005-1.000 mg/L with correlation coefficients not less than 0.999. The limits of detection and quantitation for chloropropanols in the food samples were in the ranges of 0.002-0.005 mg/kg， and 0.005-0.01 mg/kg respectively. The recoveries and the relative standard deviations （RSD， n=6） for the spiked blank samples at the levels of 0.02， 0.1， 0.5 mg/kg were in the ranges of 94.8%-106.3% （2.2%-10.3%）， 91.8%-108.8% （2.1%-10.6%） and 83.1%-109.4% （1.3%-9.4%）， respectively. The established method was applied to the samples of soy sauce， hydrolyzed vegetables protein solution and powder， cooking wine， chicken powder， bread and cake， and satisfactory results were acquired.

Keywords Food； Chloropropanols； Online gel permeation chromatographygas chromatographytriple quadrupole mass spectrometry； Matrix solidsupported liquidliquid extraction； Derivatizationfree