基于立方體納米氧化亞銅修飾的安培型葡萄糖生物傳感器的制備及性能研究

馬真真 余會(huì)成 吳朝陽 吳燕 肖福兵

摘要：將合成的立方體納米氧化亞銅用于修飾玻碳電極，在其上固定葡萄糖氧化酶，構(gòu)建了高靈敏的安培型葡萄糖生物傳感器。采用X射線衍射（XRD）、掃描電鏡（SEM）對(duì)合成的立方體納米氧化亞銅及其修飾電極進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，合成的納米氧化亞銅為均勻的立方體形狀。采用循環(huán)伏安法 （CV）、交流阻抗譜 （EIS）、差分脈沖伏安法 （DPV） 及計(jì)時(shí)電流法 （CA）考察了修飾電極的電化學(xué)行為。在含0.1 mmol/L葡萄糖的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）中研究了立方體納米氧化亞銅修飾電極的循環(huán)伏安（CV）響應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此修飾電極對(duì)葡萄糖顯示出良好的電催化性能。DPV響應(yīng)電流與葡萄糖的濃度在5.0×10mol/L（S/N=3）。CA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，尿酸、抗壞血酸、D果糖對(duì)傳感器不產(chǎn)生干擾。本傳感器具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可用于實(shí)際樣品中葡萄糖的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 ：立方體納米氧化亞銅； 葡萄糖氧化酶； 葡萄糖； 電催化； 生物傳感器

1 引 言

葡萄糖濃度的準(zhǔn)確檢測(cè)在臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品分析等領(lǐng)域極為重要[1]。目前，測(cè)定葡萄糖濃度的方法主要有分光光度法[2]、熒光檢測(cè)法[3]、高效液相色譜法[4]及毛細(xì)管電泳法[5]等，這些方法大多數(shù)靈敏度低或耗時(shí)長(zhǎng)、成本較高。電化學(xué)傳感器具有靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間短、線性范圍寬、成本低并且可在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因此電化學(xué)葡萄糖生物傳感器已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一[6]。

目前，電化學(xué)葡萄糖傳感器多采用葡萄糖氧化酶 （GOx）修飾電極[7]。直接將GOx涂滴在電極表面上，GOx很容易喪失活性，電子傳遞也較慢；采用殼聚糖或Nafion等成膜，通過戊二醛交聯(lián)，可將GOx固定在電極表面膜上，但固定的GOx在電極上的電子傳遞受到明顯抑制，因此所構(gòu)建的電化學(xué)傳感器的靈敏度較低。

納米材料具有較大比表面積、良好的電子傳遞能力[8]，鉑、金、銀、碳納米管、石墨烯等納米材料已被廣泛用于修飾GOx傳感電極表面，以提高檢測(cè)葡萄糖的靈敏度[9～11]。納米材料的電催化性能不但取決于材料尺寸及元素組成，還取決于材料的形貌，高表面能的晶面常比低表面能的晶體表現(xiàn)出更高的電催化活性[12～15]。納米氧化亞銅作為新型的p 型氧化物半導(dǎo)體材料， 具有活性的電子空穴對(duì)， 表現(xiàn)出良好的電催化活性[16]。Li等[17]制備了正八面體納米氧化亞銅與碳納米量子點(diǎn)復(fù)合物修飾的非酶性葡萄糖傳感器；Khan等[18]發(fā)現(xiàn)飛鏢狀納米氧化亞銅可在葡萄糖的檢測(cè)中表現(xiàn)出良好的電催化效果。

為了提高電化學(xué)方法檢測(cè)葡萄糖的靈敏度，本研究合成了立方體納米氧化亞銅，構(gòu)建了基于立方體納米氧化亞銅修飾電極的安培型葡萄糖生物傳感器，采用循環(huán)伏安法（CV）、交流阻抗 （EIS）技術(shù)、差分脈沖伏安法 （DPV）及計(jì)時(shí)電流法 （CA）對(duì)修飾電極的電化學(xué)行為進(jìn)行了研究，考察了其對(duì)葡萄糖的分析性能。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CHI660E型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；PHS3C型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；Ultima Ⅳ型X射線衍射儀（日本理學(xué)株式會(huì)社）；SUPRA 40/40VP場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（德國(guó)卡爾蔡司公司）。

葡萄糖氧化酶 （Glucose oxidase， GOx， E. C1. 1. 3. 4， 234， 900 units/g）、 尿酸 （UA， 純度 99%）、L抗壞血酸 （AA， 純度 99%）、D果糖 （Fru， ≥99.0% （HPLC））、牛血清白蛋白 （凍干粉， Protease， essentially free， ≥98%）、二茂鐵 （98%）、葡萄糖 （≥99.5% （GC））均購自Sigma 公司；CuCl2 （純度99%）、NaOH （純度99.9%）、丙酮 （純度99.7%）及無水乙醇 （純度99.7%）均購自天津科密歐化學(xué)試劑廠。除非特殊說明，所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水 （18.3 MΩ cm）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 立方體納米氧化亞銅的合成 立方體納米氧化亞銅的合成參考文獻(xiàn)＼[19＼]并稍作改進(jìn)。將1.0 mL 0.1 mol/L CuCl2溶液及1.0 mL 0.5 mol/L NaOH溶液加入到50 mL超純水中，持續(xù)攪拌，出現(xiàn)藍(lán)色的Cu（OH）2沉淀后再攪拌5 min。然后加入1.0 mL 0.1 mol/L抗壞血酸溶液，沉淀由藍(lán)色變成黃色，最后又變成磚紅色。反應(yīng)30 min后，10000 r/min離心5 min，并用超純水洗滌沉淀3次，沉淀最后保存在乙醇溶液中。

2.2.2 修飾電極的制備 將玻碳電極（GCE， Φ=2 mm）表面依次用0.3和0.05 μm的Al2O3粉末拋光成鏡面，然后依次用超純水、稀HNO3（1∶1， V/V）、乙醇、超純水各超聲清洗5 min。

將5 mL 立方體納米氧化亞銅 （8.0 mg/mL）懸濁液分散在 5 mL 5% Nafion溶液中，然后取8 μL溶液均勻滴涂在電極表面，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，滴涂6 μL 1.25% （V/V）戊二醛，然后滴涂8 μL 含有10 mg/L葡萄糖氧化酶、8. 0 mg/L 牛血清白蛋白及5.0 mg/L二茂鐵 （電子媒介體）的混合溶液，在室溫下放置晾干8 h， 用磷酸鹽緩沖溶液 （PBS）洗去多余的反應(yīng)物，干燥后即得葡萄糖氧化酶立方體納米氧化亞銅修飾電極 （GOx/Cu2O/GCE）。 無納米氧化亞銅修飾的葡萄糖氧化酶電極 （GOx/GCE）的制備除了不加立方體納米氧化亞銅外，其余步驟同上。

2.2.3 電化學(xué)測(cè)試 采用三電極體系：修飾GCE電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉑絲為對(duì)電極為。在含有不同濃度葡萄糖的0.1 mol/L Na2HPO4KH2PO4緩沖溶液 （PBS，pH 7. 4）中進(jìn)行CV， DPV及CA測(cè)試。

3 結(jié)果與討論

3.1 材料及修飾電極的表征

采用抗壞血酸還原法制備的納米氧化亞銅的X射線衍射（XRD）圖譜、掃描電鏡（SEM）圖及其修飾電極的SEM圖如圖1所示。由圖1a可見，XRD譜中所有的衍射峰都與氧化亞銅立方晶系的標(biāo)準(zhǔn)圖譜相對(duì)應(yīng) （JCPDS 5667，晶胞參數(shù)a=0.4269 nm）， 且具有較高的衍射強(qiáng)度，峰形尖銳，表明產(chǎn)物結(jié)晶性較好；合成的材料無雜質(zhì)峰， 表明產(chǎn)物晶型單一，晶體純度高。由圖1b可見，制備的納米氧化亞銅呈立方體形狀，分散性良好，大小均勻，粒徑約為80 nm。從圖1c可見，納米氧化亞銅在玻碳電極表面分布均勻，有利于電極表面上進(jìn)行的電催化反應(yīng)。

3.2 立方體納米氧化亞銅修飾電極的電化學(xué)表征

葡萄糖氧化酶 （GOx）催化氧化溶液中的葡萄糖生成葡萄糖酸內(nèi)酯及H2O2，H2O2 的生成量與溶液中葡萄糖的含量相關(guān)，電子媒介體二茂鐵能夠與電極表面上GOx的氧化還原中心進(jìn)行有效的傳輸電子，使反應(yīng)不斷進(jìn)行，因此可通過檢測(cè)酶催化反應(yīng)釋放的H2O2間接檢測(cè)溶液中葡萄糖的濃度[20]。

玻碳電極 （GCE，曲線a）、無（GOx/GCE，曲線b）及有 （GOx/Cu2O/GCE，曲線c）納米氧化亞銅的葡萄糖氧化酶修飾電極在含有0.1 mmol/L葡萄糖的PBS緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖如圖2所示，玻碳電極 （曲線a）未出現(xiàn)氧化還原峰；GOx/GCE電極的循環(huán)伏安曲線上出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰，為H2O2的氧化還原峰，但峰電流較小。這是因?yàn)镚Ox包埋固定在電極表面膜上，其電子傳遞受到抑制；而GOx/Cu2O/GCE電極的循環(huán)伏安曲線出現(xiàn)一對(duì)明顯的氧化還原峰，且峰電流與GOx/GCE相比顯著增大，說明納米氧化亞銅對(duì)葡萄糖氧化具有顯著的電催化作用。

采用K3＼[Fe（CN）6＼]/K4＼[Fe（CN）6＼]作為電子探針測(cè)定制備的葡萄糖氧化酶納米氧化亞銅修飾玻碳電極上的交流阻抗譜。交流阻抗Nyquist圖中高頻區(qū)的半圓的直徑對(duì)應(yīng)于電極表面的電荷轉(zhuǎn)移電阻（Rct），半圓直徑越小，電荷轉(zhuǎn)移電阻越小，電子在電極表面上的電子轉(zhuǎn)移越容易[21]。

玻碳電極 （GCE，曲線a）、無立方體納米氧化亞銅（GOx/GCE，曲線b）及有立方體納米氧化亞銅（GOx/Cu2O/GCE，曲線c）的葡萄糖氧化酶修飾電極在含有10 mmol/L K3＼[Fe（CN）6＼]/K4＼[Fe（CN）6＼]的0.1 mol/L PBS緩沖溶液中的交流阻抗Nyquist圖如圖3所示，無納米氧化亞銅的葡萄糖氧化酶修飾電極的半圓的直徑最大（曲線b），這是由于葡萄糖氧化酶固定在電極表面膜上，包埋固定的GOx阻礙了探針在電極上的電子傳遞。當(dāng)采用立方體納米氧化亞銅修飾電極后，半圓的直徑顯著變小，說明立方

體納米氧化亞銅可以有效地加速電子在電極表面上的傳遞。玻碳電極及各修飾電極的交流阻抗譜的結(jié)果與循環(huán)伏安的研究結(jié)果一致。

3.4 傳感器選擇性和穩(wěn)定性

采用計(jì)時(shí)電流法，考察了不同干擾物對(duì)本傳感器的干擾情況。在攪拌的條件下，連續(xù)添加0.1 mmol/L的尿酸 （UA）、抗壞血酸 （AA）、D果糖 （Fru）及目標(biāo)物葡萄糖 （Glu），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。以上干擾物引起的干擾電流較小，可以忽略不計(jì)，表明GOx/Cu2O/GCE的選擇性良好。

采用差分脈沖伏安法對(duì)0.1 mmol/L葡萄糖溶液（0.1 mol/L PBS，pH 7.4）進(jìn)行測(cè)試，5 次平行測(cè)定的峰電流相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%，表明檢測(cè)的重現(xiàn)性良好。制備了5 支相同的修飾電極，測(cè)得葡萄糖峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%，表明此電極具有良好的制備重現(xiàn)性。將電極于室溫下放置2個(gè)月后，其響應(yīng)電流下降3.9%，表明此電極具有良好的穩(wěn)定性。

3.5 實(shí)際樣品分析

采用GOx/Cu2O/GCE對(duì)糖尿病人的尿液中的葡萄糖含量進(jìn)行測(cè)定。取5 mL尿液，加入5 mL 0.2 mol/L PBS （pH 7.4）緩沖溶液， 采用GOx/Cu2O/GCE及1816拜安康血糖分析儀（德國(guó)拜耳公司）對(duì)樣品分別進(jìn)行測(cè)定，4個(gè)尿樣的檢測(cè)結(jié)果見表1。

兩種方法的測(cè)定結(jié)果一致，表明所構(gòu)建的傳感器可用

[DZ（20，24]于實(shí)際樣品分析。

4 結(jié) 論

采用抗壞血酸還原法制備了立方體納米氧化亞銅，用于修飾玻碳電極，在葡萄糖的測(cè)定中呈現(xiàn)出顯著的電催化作用。構(gòu)建的基于葡萄糖氧化酶立方體納米氧化亞銅修飾電極的電化學(xué)傳感器具有線性范圍寬、靈敏度高、檢出限低、選擇性及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)際樣品中葡萄糖的分析檢測(cè)。

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Abstract A highly sensitive amperometric glucose biosensor was fabricated by using the synthesized nanocube copper oxide （Cu2O）. The synthesized nanoCu2O and the modified electrode were characterized using Xray diffraction （XRD）， scanning electron microscopy （SEM）. The results showed that the obtained samples were nanocube Cu2O. The electrochemical properties of the modified electrode were investigated by cyclic voltammetry （CV）， differential pulse voltammetry （DPV）， electrochemical impedance spectroscopy （EIS）， and chronoamperometry （CA）. The CV behavior of nanocube Cu2O modified sensor was examined in 0.1 mol/L PBS （pH 7.4） containing 0.1 mmol/L glucose. The experimental results showed the prepared sensor presented remarkably enhanced electrocatalytic activity towards glucose detection. Linear responses of the sensor to glucose were observed for gulcose concentrations ranging from 5.0×10mol/L （S/N=3）. The CA results showed that the interference from potential interfering species such as uric acid， ascorbic acid， and D fructose could be ignored. In addition， the developed sensor exhibited good repeatability and stability， and was successfully applied to the determination of glucose in real urea samples from diabetics.

Keywords Nanocube copper oxide； Glucose oxidase； Glucose； Electrocatalysis； Biosensor