程小麗，朱向東，王　燕，郭婷婷，張曉婧

(甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000)

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·實驗研究·

四神丸對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清IL-23、IL-27含量和結(jié)腸黏膜Foxp3 mRNA表達的影響*

程小麗，朱向東，王燕，郭婷婷，張曉婧

(甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000)

目的：觀察四神丸針對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清中IL-23、IL-27含量和結(jié)腸組織中Foxp3 mRNA表達的影響，探討四神丸對脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制。方法：使用TNBS/乙醇溶液灌腸、番瀉葉灌胃聯(lián)合氫化可的松腹腔注射復制脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型。將120只大鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，四神丸低劑量組、中劑量組、高劑量組和SASP組，通過藥物進行干預治療，利用光鏡觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)并進行評分，采用ELISA檢測法檢測大鼠血清中的IL-23和IL-27水平，RT-PCR檢測法檢測Foxp3mRNA表達水平。結(jié)果：與空白對照組對比，模型對照組大鼠結(jié)腸組織的黏膜層有炎癥和潰瘍發(fā)生，證實模型成功。與空白對照組對比，模型對照組大鼠血清的IL-23、IL-27含量顯著升高，結(jié)腸組織Foxp3基因表達量明顯下降，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型對照組對比，四神丸低、中、高劑量組和SASP組血清IL-23 、IL-27水平降低，結(jié)腸組織Foxp3基因表達量升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：四神丸有可能是通過對促炎因子lL-23、IL-27的下調(diào)表達，對Foxp3基因的表達量進行升高表達，從而調(diào)節(jié)腸道中的異常免疫反應，起到防治潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

四神丸；潰瘍性結(jié)腸炎；IL-23；IL-27；Foxp3；作用機制；動物；大鼠

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是較為常見的炎癥性腸病(inflam-matory boweLdisease，IBD)之一，也是一種非特異性的免疫性炎癥[1]，其病變部位好發(fā)于直腸和結(jié)腸，多表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液膿血便、里急后重,具有易反復、病程遷延、不易治愈的特點。若任其發(fā)展，則有并發(fā)癥多、癌變的傾向，從而嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。UC的病因和發(fā)病機制，目前尚不十分明確，多數(shù)學者認為其發(fā)病與免疫、飲食、遺傳、環(huán)境，及心理等諸多因素有關(guān)，其中免疫系統(tǒng)的異常和紊亂被認為是最為密切的影響因素?，F(xiàn)代醫(yī)學通常使用磺胺類藥物、激素治療，但常因其副作用較大、患者難以耐受而使用受限。中醫(yī)學無UC這一病名[3]，根據(jù)其臨床表現(xiàn)多以腹瀉予以治療，而四神丸為治療腹瀉的經(jīng)典方劑之一[4]，且運用四神丸治療脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎有顯著療效；只是該方法治療潰瘍性結(jié)腸炎的現(xiàn)代科學機制尚未得到闡明。本研究遵循中醫(yī)辨證論治的精髓，采用復合法建立大鼠 UC 模型，通過觀察四神丸的療效，以及從免疫學的角度探討該療效機制，為四神丸的廣泛臨床運用以及進一步的開發(fā)提供有力的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物

SPF級Wistar大鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗中心提供，動物合格證號：SCXK(甘)2011-0001。飼料亦由以上單位提供。

1.2藥品、試劑與儀器

四神丸源自《證治準繩》，由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑室制備。按照原方2∶4∶2∶1∶2∶2比例取肉豆蔻、補骨脂、五味子、吳茱萸、生姜、大棗，用8倍量 700 g/L的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取藥渣。合并3次醇提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇后得醇提取濃縮液，將其干燥后得干膏，將干膏粉碎成細粉，加入揮發(fā)油。實驗用不含賦形劑的浸膏，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。柳氮磺吡?SASP)，0.25 g/片，上海三維制藥有限公司產(chǎn)品，批號H32020026；番瀉葉水煎液，由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室熬制加工，藥材購自蘭州惠仁堂藥店；氫化可的松注射液，天津藥業(yè)焦作有限公司產(chǎn)品，批號11080411。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號2008-16-2；大鼠IL-23、IL-27檢測試劑盒，深圳市達科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號20150502B；PCR引物設計，北京金唯智生物科技有限公司產(chǎn)品，批號108030404；TrizoL試劑(批號 19919)、瓊脂糖(批號 0000101394)，均為Invitrogen 公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號 0000007526)、PCR 試劑盒(批號 108030404)，均為Promega Corporation公司產(chǎn)品；異丙醇，天津市百世化工有限公司產(chǎn)品；三氯甲烷、無水乙醇，均為天津市化學試劑工廠產(chǎn)品； 二抗大鼠SP檢測試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號13135A05。Biorad iMark酶標儀，美國BLO-RAD公司產(chǎn)品；CT14RD高速冷凍離心機，天美科技有限公司產(chǎn)品；303-2型恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永鑫實驗設備儀器公司產(chǎn)品 ；S1000TM型PCR儀、BIO-RAD凝膠成像儀，均為美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.3動物分組、模型的建立與給藥

將大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為空白對照組，模型對照組，SASP組和四神丸低、中、高劑量組6組，每組各20只。采用TNBS/乙醇溶液灌腸、番瀉葉灌胃聯(lián)合氫化可的松腹腔注射法制作脾腎陽虛型UC大鼠模型：將大鼠正常飼養(yǎng)1周，待其體質(zhì)量(180±20)g時，空白對照組以蒸餾水(每只3 mL/d)灌胃、生理鹽水(每只1 mL/d)腹腔注射；其余5組以番瀉葉(每只3 mL/d)灌胃、氫化可的松(每只5 mg/d)腹腔注射，共計21 d。21 d后，將Wistar大鼠禁食、不禁水24 h，用100 g/L水合氯醛(3 μL/g)腹腔麻醉，用橡膠輸液管輕緩注入大鼠距肛門7～8 cm 深的腸腔內(nèi)，將TNBS/乙醇液(100 ng/g+500 g/L 的乙醇0.25 mL)溶液注入，留置數(shù)分鐘；用針頭抽取少量空氣，采用同樣方法注入大鼠腸腔，以防治溶液外漏。灌腸結(jié)束后，讓動物保持平躺狀態(tài)，自然清醒。空白對照組大鼠采用同樣方法用等量的生理鹽水灌腸。

于造模結(jié)束第2天開始灌胃治療，每日1次，連續(xù)21 d。四神丸低、中、高劑量組分別按生藥1.12，2.24，4.48 g/(kg·d)的劑量(按照臨床成人用量的2.5，5及10倍折算)灌胃，SASP組按0.3g/kg劑量灌胃，空白對照組、模型對照組以等體積的生理鹽水灌胃，灌胃體積均為10 μL/g。

1.4檢測指標

治療21d 后，乙醚麻醉大鼠，股動脈采血，取血清用于 ELISA 法檢測血清IL-23、IL-27含量；脫頸處死大鼠，取病變最嚴重處結(jié)腸5～8 cm，用冷PBS清洗結(jié)腸，肉眼觀察結(jié)腸損傷情況并評分；取病變最明顯處0.5 cm左右，迅速移至液氮中保存，用于免疫組化和基因表達檢測。

1.4.1一般情況

在造模及治療期間觀察各組大鼠精神、毛色、飲食、大便等情況。

1.4.2血清IL-23、IL-27含量檢測

采用ELISA法測定血清IL-23、IL-27含量，實驗步驟嚴格按試劑盒要求操作。在檢測波長450 nm和校正波長620 nm同時讀板，通過標準曲線計算各樣本含量。

1.4.3結(jié)腸組織大體形態(tài)

大體形態(tài)損傷評分參照Luketal標準[5]進行。0分：無損傷。1分：充血但沒有潰瘍。2分：充血而且腸壁變厚但沒有潰瘍。3分：有一處小潰瘍，直徑0～1 cm。4分：潰瘍較大，直徑1～2 cm，但腸管與外周臟器無粘連。5分：潰瘍直徑1～2 cm，腸管增厚，與周圍臟器粘連嚴重。

1.4.4結(jié)腸組織中Foxp3蛋白的定位表達

采用免疫組化SP法。主要步驟：固定石蠟切片，將其常規(guī)脫蠟。每張切片滴加體積分數(shù) 30 mL/L 的H2O2，于室溫放置 10 min。將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH值6.0)中進行抗原熱修復，自然冷卻至室溫。滴加50 g/L的BSA 封閉液，室溫放置20 min。分別滴加Foxp3一抗，4 ℃冰箱過夜。滴加生物素化山羊抗兔 IgG，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min。滴加試劑 SABC，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育 20 min。加DAB 顯色劑，蘇木素輕度復染3 min；經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。通過顯微鏡觀察結(jié)果，拍片。同一組片中，用PBS 代替一抗作孵育，其余步驟同上，來進行染色對照。Foxp3蛋白主要表達于大鼠結(jié)腸組織中的腸道黏膜及黏膜下層，尤以胞漿為主。Foxp3表達陽性為胞質(zhì)呈棕黃顆粒染色，顏色越深則表明表達越強；若未出現(xiàn)棕黃顆粒則為陰性。采用 BI-2000圖像分析系統(tǒng)之免疫組化分析系統(tǒng)，隨機選取 5 個視野，測量陽性細胞平均積分光密度值(IOD)，其值越大則表明蛋白表達強，反之則表達弱。

1.4.5大鼠結(jié)腸組織中Foxp3的水平以及表達

采用RT-PCR法檢測。RNA的提取采用經(jīng)典的Trizol法，通過Bio-RAd核酸定量分析儀測定總 RNA 的濃度和純度，確保 2.0>A260/A280>1.8。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄,合成 cDNA,用 cDNA模板對大鼠內(nèi)參照β-actin 及Foxp3基因分別進行PCR 擴增，引物由金唯智生物科技北京有限公司合成。內(nèi)參照β-actin 引物序列為：上游引物 5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游引物5′-AAGGGTGTAAAACACAGCTC-3′，擴增產(chǎn)物長度 292 bp。Foxp3引物序列為：上游引物5′-AAAGTGGCAGGGAAGGAGTG-3′，下游引物5′-CAAGTCTCGTGTGAAGGCAGA-3′，產(chǎn)物長度 196 bp。擴增反應體系為 50 μL,其中 cDNA 3 μL、上下游引物各 1 μL；MgCl23 μL、10×Reaction Buffer 5 μL、dNTP Mix 1 μL；Tap DNA 聚合酶 0.25 μL；無酶水補足至50 μL。擴增參數(shù)為：預變性95 ℃、2 min，95 ℃變性 45 s，退火 53 ℃、45 s,72 ℃、延伸30 s，共40個循環(huán)(β-actin為25個循環(huán))，總延伸72 ℃、5 min。PCR 擴增產(chǎn)物于 10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,在凝膠成像儀上成像,采用 Quantity One 圖像分析軟件分析數(shù)據(jù),獲得各電泳條帶的積分光密度(X)，用β-actin 的積分光密度(A)作為內(nèi)參照，計算基因的相對表達量(X/A)。

1.5統(tǒng)計學方法

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠一般情況對比

空白對照組：大鼠皮毛光澤順滑，反應靈活，精神、飲食正常，大便正常。模型對照組：造模完成時，大鼠精神萎靡、活動減少，大便清稀不成形，毛發(fā)松散無光澤，爪甲顏色較淡，尾巴變涼，弓背倦怠，喜扎堆，飲食、飲水量顯著下降。自造模第2天，大鼠出現(xiàn)持續(xù)稀便、肛周污濁、毛色晦暗無光澤且有被糞便沾染的現(xiàn)象，部分大鼠出現(xiàn)肉眼可見的血便。第7天，上述現(xiàn)象最為突出，是病證最顯著階段。因為大鼠自身有一定的修復功能，自第14天開始上述癥狀有一定程度的改善，第21天改善較為明顯，飲食增多，皮毛較前潔凈順滑，大便較前略成形，反應較前靈敏。其余各治療組經(jīng)過治療后癥狀均有不同程度的改善，SASP組大鼠皮毛較有光澤，反應較靈敏，精神較正常，活動尚靈敏，飲食尚可，大便基本正常，個別有稀便現(xiàn)象；四神丸組大鼠皮毛光澤，反應靈活，精神活動可，飲食接近正常，大便呈顆粒狀，其中中劑量組各癥狀恢復最好，與空白對照組對比基本無異。

2.2各組大鼠血清IL-23、IL-27水平對比

與空白對照組對比，模型對照組大鼠血清IL-23、IL-27含量升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，四神丸高、中、低劑量組和SASP組血清IL-23 、IL-27水平降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

組 別動物數(shù)劑量/(g·kg-1)IL-23/(ng·L-1)IL-27/(ng·L-1)空白對照組2008.5863±0.330910.0378±0.9794模型對照組0209.9217±0.4344**8.8211±0.8449**SASP組200.468.3898±0.5932#10.0144±0.6148##四神丸低劑量組2011.188.3855±0.5531#9.9243±0.8579#四神丸中劑量組2022.378.3052±1.4298#9.7982±0.4151#四神丸高劑量組2044.738.2952±0.4982#9.8748±0.4082#

注：與空白對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05，##P<0.01。

2.3各組大鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)對比

模型對照組大鼠結(jié)腸黏膜可見明顯的充血、水腫、潰瘍，腸壁變厚、腸道縮短等。經(jīng)過3種劑量四神丸和SASP治療后，大鼠結(jié)腸黏膜損傷情況均有改善，但各組具體的修復情況不同。其中，SASP組和四神丸中、高劑量組的大鼠黏膜僅存在少量的充血水腫，其余損傷基本恢復至正常形態(tài)。四神丸組、SASP 組與模型對照組對比，結(jié)腸損傷評分降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2　各組大鼠結(jié)腸組織大體形態(tài)評分對比　　±s

注：與空白對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，##P<0.01。

2.4各組大鼠結(jié)腸組織Foxp3基因表達量對比

與空白對照組對比，模型對照組大鼠結(jié)腸組織Foxp3基因表達量下降，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，四神丸高、中、低劑量組和SASP組Foxp3基因表達量升高(P<0.05)。見表3。

組 別劑量/(g·kg-1)Foxp3相對表達量空白對照組00.9086±0.1477模型對照組00.4725±0.1108**SASP組0.460.8472±0.0806#Δ*四神丸低劑量組11.180.8762±0.0870#Δ*四神丸中劑量組22.370.6641±0.3281#四神丸高劑量組44.730.7506±0.0493#

注：與空白對照組對比，**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05；與四神丸中劑量組對比，△P<0.05；與四神丸高劑量組對比，＊P<0.05。

3　討　論

潰瘍性結(jié)腸炎屬中醫(yī)學“痢疾”“腸風”“腸癖”“便血”“泄瀉”“帶下”“臟毒”等范疇。中醫(yī)學認為：UC的發(fā)生由飲食、勞倦、情志損傷等多重因素相互作用使五臟失調(diào)所致，濕邪是其最主要的致病因素之一。脾主運化水濕，雖然UC的病變部位在腸，但中醫(yī)學認為本病的發(fā)生、發(fā)展與脾有著密切關(guān)系。UC病程較長，根據(jù)久病及腎理論，該病易損傷腎臟，從而引起腎虛。腎主二便，腎虛則氣化不行，大便失約而為泄瀉，故目前臨床治療應從脾虛泄瀉、腎虛泄瀉來論治。四神丸是治療五更泄瀉的經(jīng)典名方之一，臨床治療UC臨床療效顯著，但作用機制不明。

目前，免疫因素是UC發(fā)病研究的熱點之一[7]。IL-23、IL-27為新近發(fā)現(xiàn)的IL-12之家族成員，與IL-12組織結(jié)構(gòu)類似、生物功能相近，可以參與免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病，以及腫瘤等多種免疫調(diào)節(jié)過程[8]，尤其是在慢性腸病發(fā)病中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。IL-23歸屬于介導細胞免疫的因子之一，主要來源于活化的樹突狀細胞與巨噬細胞。IL-23不僅參與機體的抗感染免疫和抗腫瘤免疫，還在自身免疫性疾病的發(fā)病和長期慢性復發(fā)性炎癥中起著不可或缺的作用。IL-23可誘導T細胞產(chǎn)生多種細胞因子，如IL-17、IL-10、IFN-γ等[9]，其中，IL-17為已被證實為促炎因子，其可誘導中性粒細胞進行增殖、成熟和趨化，從而促使T細胞活化與增殖；此外，還可以促進TNF、IL-1、IL-6等促炎細胞因子的釋放。有文獻[10]報道，IL-23是引發(fā)腸道炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)之一。IL-27主要由活化的巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞產(chǎn)生，表達部位主要在髓細胞系。IL-27作用于免疫反應早期階段，通過STAT1、T-bet途徑使CD4+T細胞增殖，使其向Th1細胞方向分化；同時可協(xié)同IL-12刺激細胞產(chǎn)生IFN-γ，促進單核細胞產(chǎn)生TNF、IL-1、IL-12等炎性細胞因子[11]，從而導致炎癥的發(fā)生。另一方面，在Th1細胞高度活化時，IL-27還可通過抑制Th2和Th17細胞的分化，從而促進IL-10的產(chǎn)生，抑制炎癥因子IL-2的分泌，進而抑制Th1型免疫反應從而達到抗炎作用[12]。

Foxp3是叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子的家族成員之一[13]，與調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的發(fā)育、分化和功能發(fā)揮密不可分[14]，被認為是屬于Treg的標志性分子。Treg細胞是具有免疫調(diào)節(jié)功能的一類T細胞亞群，在多種免疫性疾病中有著重要作用。雖然其具體的作用機制尚不清楚，但越來越來多的研究證明：Treg細胞能通過多種機制來抑制免疫應答，在維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3基因敲除或突變的小鼠，由于CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量減少，F(xiàn)oxp3表達缺陷，其自身免疫病的發(fā)病率大大增高。在人類體內(nèi)，同源的Foxp3突變有引起基因性疾病的可能性，如腸病、免疫失調(diào)、內(nèi)分泌疾病等[15]。由此可知，F(xiàn)oxp3可能是影響自身免疫性疾病發(fā)病機制的重要因子之一，其突變或缺失能夠引起嚴重的自身免疫性疾病。本研究結(jié)果顯示：與空白對照組對比，模型對照組大鼠血清的IL-23、IL-27含量普遍升高，結(jié)腸組織Foxp3基因表達量明顯下降，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型對照組對比，四神丸低、中、高劑量組和SASP組血清IL-23、IL-27含量降低，結(jié)腸組織Foxp3基因表達量升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果表明：四神丸可能是通過下調(diào)促炎因子lL-23、IL-27表達，升高Foxp3基因表達量，來調(diào)節(jié)腸道中的異常免疫反應，從而達到防治UC的作用。

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(編輯陶珠)

1001-6910(2016)02-0066-05

R574.62

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.02.32

朱向東，教授，博士，zhuxiangdong33@163.com

國家自然科學基金資助項目(BH-2013-8)

2015-05-08；

2015-12-03