張　寧，王　征,2，王征帆,3，劉竹蘭，劉建利

(1.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安　710069;2.陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/陜西省風(fēng)濕與腫瘤類(lèi)中藥制劑工程技術(shù)研究中心,陜西中醫(yī)學(xué)院,陜西 咸陽(yáng)　712083;3.西北大學(xué) 附屬中學(xué)，陜西 西安　710069)

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·生命科學(xué)·

細(xì)胞中藥學(xué)初探之寒者熱之

張寧1，王征1,2，王征帆1,3，劉竹蘭1，劉建利1

(1.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710069;2.陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/陜西省風(fēng)濕與腫瘤類(lèi)中藥制劑工程技術(shù)研究中心,陜西中醫(yī)學(xué)院,陜西 咸陽(yáng)712083;3.西北大學(xué) 附屬中學(xué)，陜西 西安710069)

用寒涼中藥造寒證細(xì)胞模型,是否可以用溫?zé)嶂兴幠孓D(zhuǎn),驗(yàn)證細(xì)胞水平上的“寒者熱之”這一中醫(yī)基本治則。用黃連20 μg/mL、黃柏50 μg/mL、虎杖50 μg/mL造寒證細(xì)胞模型,以白胡椒、蓽茇、吳茱萸、肉桂4種熱藥在5 ～ 800 μg/mL濃度范圍內(nèi)分8個(gè)濃度梯度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。所選4味熱藥對(duì)由黃連、黃柏、虎杖的寒性產(chǎn)生的細(xì)胞抑制作用有不同程度的逆轉(zhuǎn)。這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,從而證明“寒者熱之”的中醫(yī)治則在細(xì)胞水平同樣適用?！昂邿嶂钡闹嗅t(yī)治則在細(xì)胞水平上是適用的,彌補(bǔ)了中醫(yī)藥理論在細(xì)胞水平認(rèn)識(shí)部分的缺失,為細(xì)胞中藥學(xué)的提出提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

細(xì)胞中藥學(xué);寒者熱之;MTT法;SGC-7901細(xì)胞

生命科學(xué)對(duì)人體的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷了從整體、器官、組織、細(xì)胞,到分子的過(guò)程。細(xì)胞是生命的基本單位,在生命科學(xué)的認(rèn)識(shí)、發(fā)展與研究等過(guò)程中起到了重要的作用。中醫(yī)藥理論經(jīng)千百年的臨床實(shí)踐，通過(guò)對(duì)人體整體的把握辨證論治，現(xiàn)代科學(xué)對(duì)中醫(yī)藥的影響,使中醫(yī)藥直接進(jìn)入了分子水平,從而造成了中醫(yī)藥理論在細(xì)胞水平上認(rèn)識(shí)的缺失。隨著中醫(yī)藥學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展與交叉,一個(gè)在細(xì)胞水平上認(rèn)識(shí)中醫(yī)藥的學(xué)科——細(xì)胞中藥學(xué)就呼之欲出。中藥藥性理論是中醫(yī)藥理論的重要組成部分。而寒熱藥性理論又是中藥藥性理論和中醫(yī)治法治則的基礎(chǔ)?！昂邿嶂?熱者寒之”是中醫(yī)的基本治則,經(jīng)幾千年臨床實(shí)踐證明,至今仍然指導(dǎo)著中醫(yī)臨床用藥[1]。如果要彌補(bǔ)中醫(yī)藥理論在細(xì)胞水平認(rèn)識(shí)的缺失,首選應(yīng)從寒熱藥性開(kāi)始,考察“寒者熱之,熱者寒之”這個(gè)中醫(yī)臨床基本治則是否能在細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)證明熱藥作用于細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),寒藥作用于細(xì)胞則抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[2-12]。初步證明寒熱藥物作用于細(xì)胞具有與人體一致的效應(yīng)。本文探討用寒涼中藥造寒證細(xì)胞模型,是否可以用溫?zé)嶂兴幠孓D(zhuǎn),進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞水平上的“寒者熱之”這一中醫(yī)臨床基本治則。

1　材　料

1.1儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo),超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰),SpectraMax 190酶標(biāo)儀(Molecular Devices),細(xì)胞96孔培養(yǎng)板(耐思生物科技有限公司),DMIL-LED倒置顯微鏡(leica)。

1.2藥品與試劑

黃連(CoptisChinensisFranch.)、黃柏(PhellodendronchinenseSchneid.)、虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.)、白胡椒(PipernigrumL.)、蓽茇(PiperlongumL.)、吳茱萸(Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.)、肉桂(CinnamomumcassiaPresl)均購(gòu)自西安德茂堂大藥房,經(jīng)西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院房敏峰教授鑒定為正品藥材。DMEM培養(yǎng)液(HyClone),胎牛血清(HyClone),MTT(Sigma),0.25%胰蛋白酶(HyClone),二甲基亞砜,磷酸緩沖液。

1.3細(xì)胞株

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901,由第四軍醫(yī)大學(xué)提供。

2　方　法

2.1藥品溶液的制備

分別稱(chēng)取黃連、黃柏、虎杖、白胡椒、蓽茇、吳茱萸、肉桂各25g,加水煎煮3次,每次0.5 h,合并煎液,濃縮,定容至25 mL,使質(zhì)量濃度為1 g/mL。藥液10 000 r/min離心30 min,取上清液,0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),無(wú)菌水稀釋至10 μg/μL,備用。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)

將SGC-7901細(xì)胞消化于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(pH 7.0～7.4)中,在37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

2.3MTT試驗(yàn)

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞,照文獻(xiàn)方法[2-12]培養(yǎng)。模型組每孔加入等體積不同濃度的寒藥,使得造模終質(zhì)量濃度黃連為20 μg/mL、黃柏為50 μg/mL、虎杖為50 μg/mL。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和調(diào)零孔,每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h后,吸棄含造模藥物的培養(yǎng)基,用磷酸緩沖液洗凈殘留藥物,加入新鮮培養(yǎng)基。再分別以白胡椒、蓽茇、吳茱萸、肉桂等熱藥進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。每孔加入等體積不同濃度的熱藥,使終質(zhì)量濃度分別為5，10，20，50，100，200，400，800 μg/mL。加藥完畢后,培養(yǎng)24 h,更換新鮮培養(yǎng)液(180 μL/孔),每孔加入新鮮配制的MTT溶液(5 g/L)20 μL,照文獻(xiàn)方法用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm下吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞抑制率[2-12]。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3　結(jié)　果

分別用黃連20μg/mL、黃柏50 μg/mL、虎杖50 μg/mL在SGC-7901細(xì)胞上造模,以白胡椒、蓽茇、吳茱萸、肉桂4味熱藥在5 ～ 800 μg/mL濃度范圍內(nèi)分8個(gè)濃度梯度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。當(dāng)黃連質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí),對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率為83.25%。分別用白胡椒、蓽茇、吳茱萸、肉桂等熱藥進(jìn)行逆轉(zhuǎn),結(jié)果見(jiàn)表1。

濃度μg/mL 白胡椒 肉桂 蓽茇 吳茱萸 A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%50.234±0.001**82.700.162±0.002**73.090.708±0.001**52.610.246±0.002**49.80100.428±0.104**68.300.194±0.003**67.770.893±0.004**40.220.283±0.004**42.24200.811±0.052*40.000.217±0.003**63.950.811±0.017**45.710.279±0.002**43.06500.707±0.178*47.700.232±0.001**61.461.130±0.034*24.360.289±0.004**41.021000.733±0.065*45.800.349±0.002**42.021.125±0.006**24.700.315±0.004**35.712000.539±0.050**60.100.219±0.008**63.600.892±0.001**40.300.365±0.004*25.514000.485±0.002**64.100.22±0.003**63.450.948±0.002**36.550.416±0.008*15.108000.444±0.036**67.200.173±0.001**71.260.741±0.002**80.400.372±0.005*24.06對(duì)照1.352±0.010—0.602±0.001—1.494±0.014—0.490±0.003—

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

由表1結(jié)果可知,寒藥黃連造模后,再加入白胡椒、蓽茇、吳茱萸、肉桂等熱藥,抑制率均為正值,說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)仍是受抑制的。但是，以上4味熱藥在5 ～ 800 μg/mL濃度范圍內(nèi)8個(gè)濃度的抑制率均小于黃連在20 μg/mL時(shí)抑制率83.25%。表明以上4味熱藥作用于黃連造模細(xì)胞后,逆轉(zhuǎn)了黃連對(duì)細(xì)胞的抑制作用。以上4味熱藥對(duì)黃連(20 μg/mL)的最佳逆轉(zhuǎn)濃度分別是白胡椒20 μg/mL、蓽茇400 μg/mL、肉桂100 μg/mL、吳茱萸400 μg/mL。用抑制率對(duì)逆轉(zhuǎn)熱藥濃度作圖,以直觀反映4味熱藥對(duì)黃連造模細(xì)胞的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知,4味熱藥曲線均表現(xiàn)為先下降后上升,最低處為每味熱藥的最佳逆轉(zhuǎn)濃度。而此后抑制率上升是因?yàn)闊崴幵诟邼舛葧r(shí)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了抑制作用[2-12]。

當(dāng)黃柏質(zhì)量濃度為20μg/mL時(shí),對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率為78.58%。分別用上述4味熱藥進(jìn)行逆轉(zhuǎn),結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1　對(duì)黃連造寒證細(xì)胞模型的影響Fig.1　Effects of four kinds of hot drugs on cold syndrome cell model which was established with Coptis Chinesis Franch

表2結(jié)果表明,4味熱藥也可以逆轉(zhuǎn)黃柏對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。最佳逆轉(zhuǎn)濃度分別為白胡椒50 μg/mL、蓽茇100 μg/mL、肉桂200 μg/mL、吳茱萸200 μg/mL。用抑制率對(duì)藥物濃度作圖,結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果與黃連造模組基本一致。

濃度μg/mL 白胡椒 肉桂 蓽茇 吳茱萸 A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%50.455±0.004**80.240.252±0.004**58.140.32±0.001**78.580.248±0.004**49.39100.539±0.006**76.600.301±0.009**50.000.361±0.022**75.840.271±0.006**44.70

續(xù)表2

濃度μg/mL 白胡椒 肉桂 蓽茇 吳茱萸 A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%200.781±0.001**66.100.279±0.011**53.650.345±0.009**76.910.289±0.001**41.02500.920±0.69360.100.276±0.004**54.150.445±0.014**72.210.320±0.022*34.691000.576±0.002**75.000.357±0.006**40.690.773±0.015**48.260.286±0.001**41.632000.518±0.025**77.500.414±0.001**31.230.646±0.030**56.760.354±0.006**27.764000.690±0.012**70.000.387±0.002**35.710.669±0.014**55.220.328±0.004**33.478000.747±0.017**67.600.324±0.005**46.180.526±0.011**64.790.315±0.007*35.71對(duì)照2.303±0.049—0.602±0.001—1.494±0.014—0.490±0.003—

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

圖2　4味熱藥對(duì)黃柏造寒證細(xì)胞模型的影響Fig.2　Effects of four kinds of hot drugs on cold syndrome cell model which was established with Phellodendron Chinense Schneid.

當(dāng)虎杖質(zhì)量濃度為50μg/mL時(shí),對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率為65.70%。分別用上述4味熱藥進(jìn)行逆轉(zhuǎn),結(jié)果見(jiàn)表3。

4味熱藥作用于虎杖造模細(xì)胞后,在5 ～ 800 μg/mL濃度范圍內(nèi)，8個(gè)濃度的抑制率基本上小于虎杖50 μg/mL時(shí)的抑制率65.70%,即對(duì)虎杖所造寒證細(xì)胞模型有逆轉(zhuǎn)作用。4味熱藥對(duì)虎杖的最佳逆轉(zhuǎn)濃度分別為白胡椒200 μg/mL、蓽茇200 μg/mL、肉桂5 μg/mL、吳茱萸100 μg/mL。其中肉桂對(duì)虎杖的逆轉(zhuǎn)作用特別明顯,低濃度即產(chǎn)生明顯的抑制作用,但隨濃度增大,逆轉(zhuǎn)作用減弱。這個(gè)現(xiàn)象很特別,值得進(jìn)一步研究。而蓽茇對(duì)虎杖的逆轉(zhuǎn)作用卻不明顯。為了更加直觀地反映這一結(jié)果,以抑制率對(duì)藥物濃度作圖,結(jié)果見(jiàn)圖3。

濃度μg/mL 白胡椒 肉桂 蓽茇 吳茱萸 A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%50.417±0.020**69.16%0.486±0.004*19.270.521±.001**65.130.244±0.001**55.20100.43±0.033**66.200.454±0.015*24.580.518±0.004**65.330.259±0.012*50.30200.428±0.013**66.300.372±0.001**38.200.507±0.002**66.060.275±0.001**47.30500.505±0.001**62.400.347±0.002**42.360.499±0.015**66.600.329±0.002**44.001000.665±0.093*50.800.302±0.006**49.830.561±0.009**62.450.265±0.01**33.002001.074±0.50220.600.283±0.002**52.990.586±0.019**60.780.216±0.003**46.004000.374±0.009**72.300.256±0.001**57.480.514±0.006**65.600.192±0.005**56.008000.499±0.002**63.100.247±0.001**58.970.244±0.002**83.670.491±0.001**60.90對(duì)照1.352±0.010—0.602±0.001—1.494±0.014—0.220±0.002—

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

圖3　4味熱藥對(duì)虎杖造寒證細(xì)胞模型的影響Fig.3　Effects of four kinds of hot drugs on cold syndrome cell model which was established with Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.

由圖3可知,白胡椒、蓽茇、吳茱萸等3條曲線與黃連造模組、黃柏造模組基本一致,均是先下降后上升,最低處即為其最佳逆轉(zhuǎn)濃度。而肉桂曲線只有上升,沒(méi)有下降,表明起始濃度即為其最佳逆轉(zhuǎn)濃度。

綜上,所選白胡椒、蓽茇、吳茱萸、肉桂等4味熱藥對(duì)由黃連、黃柏、虎杖3味寒藥所造寒證細(xì)胞模型均有一定程度的逆轉(zhuǎn)作用。這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[1],從而初步證明“寒者熱之”的中醫(yī)治則在細(xì)胞水平上是適用的。

4　討　論

要補(bǔ)上中醫(yī)藥學(xué)在細(xì)胞水平上的缺失,就有必要研究中藥與細(xì)胞的相互作用,尋找中藥性質(zhì)與細(xì)胞之間的相互關(guān)系。中藥的首要性質(zhì)就是寒熱藥性,我們前期工作顯示熱藥能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),而寒藥則抑制細(xì)胞生長(zhǎng),并基于此建立了評(píng)價(jià)中藥寒熱藥性的細(xì)胞學(xué)方法[2-12]。

“寒者熱之、熱者寒之”是中醫(yī)臨床的基本治則。由本文結(jié)果可知,在細(xì)胞上以寒藥造模,再以

熱藥進(jìn)行逆轉(zhuǎn),雖不能完全逆轉(zhuǎn)使細(xì)胞達(dá)到正常狀態(tài),但在一定程度上降低了寒藥對(duì)細(xì)胞的抑制作用。這一結(jié)果及趨勢(shì)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致[1],從而說(shuō)明在細(xì)胞水平上“寒者熱之”的治則是適用的。也為細(xì)胞中藥學(xué)提供了新的內(nèi)容。

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(編輯徐象平)

Exploring the cytological effect of Chinese material medica by treating cold syndrome with hot drugs

ZHANG Ning1， WANG Zheng1,2, WANG Zheng-fan1,3, LIU Zhu-lan1, LIU Jian-li1

(1.School of Life Science, Northwest University, Xi′an 710069, China; 2.Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/Shaanxi Province Key Laboratory of New Drugs and Chinese Medicine Foundation Research/Shaanxi Rheumatism and Tumor Center of TCM Engineering Technology Research,Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712083， China; 3.Middle School Attached to Northwest University, Xi′an 710069, China)

To study whether the traditional therapeutic rule “to treat cold syndrome with hot drugs” can apply to the cold syndrome cell model which was established with cold drugs. Three cold herbal drugsCoptisChinensisFranch. (20 μg/mL),PhellodendronchinenseSchneid. (50 μg/mL) andPolygonumcuspidatumSieb. et Zucc. (50 μg/mL) were used to treat the cell to induce cold model. Four kinds of hot drugsPipernigrumL.,PiperlongumL.,Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.,CinnamomumcassiaPresl were used to reverse models. Four hot herbal drugs could cure the cold syndrome and the results were in accordance with that obtained on animal model. The traditional therapeutic rule “to treat cold symptom with hot drug” can apply on cell model.

cytology of Chinese materia medica; “to treat cold syndrome with hot drugs”; MTT assay; SGC-7901

2015-04-07

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014JM4125)；陜西省中醫(yī)管理局基金資助項(xiàng)目(13-JC012)；陜西省教育廳專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(14JK1737)

張寧，女，陜西寶雞人，西北大學(xué)副教授,博士,從事中藥化學(xué)成分與藥性理論研究。

劉建利,男,陜西西安人，西北大學(xué)教授,博士，從事中醫(yī)藥學(xué)研究。

R285.1

ADOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-01-014