卡托普利聯(lián)合非諾貝特對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變保護(hù)作用的研究

李凌冰，趙躍萍，徐　葳，邰　賀*

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卡托普利聯(lián)合非諾貝特對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變保護(hù)作用的研究

李凌冰1，趙躍萍1，徐葳2，邰賀1*

目的研究卡托普利聯(lián)合非諾貝特對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡作用、外周血血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)及其氧化相關(guān)物質(zhì)的影響，以明確其保護(hù)糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy，DR)的作用機(jī)制。方法選取清潔級(jí)性成熟SD大鼠100只，隨機(jī)分為5組(每組20只)：A組(假造模組，普通飼料喂養(yǎng)并灌胃相同體積的生理鹽水)、B組[模型組，高脂飼料喂養(yǎng)4周后給予腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，給予相同體積生理鹽水8周]、C組(卡托普利干預(yù)組，高脂飼料喂養(yǎng)4周后給予腹腔注射鏈脲佐菌素，給予卡托普利干預(yù)8周)、D組(非諾貝特干預(yù)組，高脂飼料喂養(yǎng)4周后給予腹腔注射鏈脲佐菌素，給予非諾貝特干預(yù)8周)、E組(卡托普利+非諾貝特聯(lián)合干預(yù)組，高脂飼料喂養(yǎng)4周后給予腹腔注射鏈脲佐菌素，給予卡托普利+非諾貝特干預(yù)8周)，抽取外周血檢測(cè)外周血清甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)、超氧化物歧化酶(Superioxide dismutase，SOD)、活性氧類物質(zhì)(Reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、VEGF濃度，處死大鼠，取出眼球，用Tunel染色法檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果A組大鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值均高于其他4組(P<0.05)，而ROS、MDA、VEGF和Tunel指數(shù)均低于其他4組(P<0.05)；B組大鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值均低于其他4組(P<0.05)，而ROS、MDA、VEGF與Tunel指數(shù)均高于其他4組(P<0.05)；E組大鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值均高于C組、D組(P<0.05)，而ROS、MDA、VEGF與Tunel指數(shù)均低于C組、D組(P<0.05)；D組大鼠外周血清GSH-PX、SOD活性均高于C組(P<0.05)，而ROS、MDA與Tunel指數(shù)均低于C組(P<0.05)；D組大鼠外周血清VEGF濃度值低于C組(P<0.05)。結(jié)論卡托普利及非諾貝特均能改善DR，通過(guò)抑制凋亡與抗氧化對(duì)視網(wǎng)膜起到很好的保護(hù)作用，但兩藥聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；大鼠；卡托普利；非諾貝特；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；氧化；凋亡

0　引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病較常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，是四大致盲性眼病之一，DR的發(fā)病率隨著糖尿病發(fā)病率的升高逐年升高[1]。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)能很好地抑制糖尿病腎病(Diabetic nephrosis，DN)的進(jìn)展[2-3]。非諾貝特是一種過(guò)氧化物酶體激活型增殖體受體α(Peroxisome proliferator activated receptor α)激動(dòng)劑，具有一定的抑制新生血管生成和改善血管內(nèi)皮的功能[1]，此外，非諾貝特作為一種降脂藥，能降低機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]。目前研究表明，DR進(jìn)展過(guò)程中氧化應(yīng)激能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。本研究以SD大鼠為DR模型，研究卡托普利聯(lián)合非諾貝特對(duì)DR大鼠眼底病變的抑制作用及其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物100只SD大鼠由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供：周齡9～10周，體重370～390 g(雄鼠)，260～270 g(雌鼠)。5組大鼠周齡、性別比、體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理將100只大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E 5組，每組20只，雌、雄鼠分開(kāi)飼養(yǎng)，控溫20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水取食。除A組外(給予普通飼料喂養(yǎng))，其余4組均給予高脂飼料(脂肪含量36%)連續(xù)喂養(yǎng)4周，禁食水12 h后，將除A組(注射相同體積的濃度為0.1 mmol/L、pH值為4.4的枸櫞酸鈉)外的其余4組腹腔注射STZ 50 mg/kg(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，用新鮮配制的0.1 mmol/L、pH值為4.4的枸櫞酸鈉緩沖液配制)，2周后尾緣靜脈抽血測(cè)非空腹血糖(血糖儀為One ToucuⅡ型，由美國(guó)LifeScan公司提供)，血糖>11.1 mmol/L為糖尿病大鼠模型[6]。將造模成功的大鼠進(jìn)行如下處理：A組(假造模組，普通飼料喂養(yǎng)并且灌胃相同體積的生理鹽水8周)、B組(模型組，高脂飼料喂養(yǎng)并給予相同體積生理鹽水灌胃8周)、C組[卡托普利對(duì)抗組，高脂飼料喂養(yǎng)并給予卡托普利10 mg/(kg·d)干預(yù)8周，商品名：開(kāi)博通，原料由中美上海施貴寶制藥有限公司提供]、D組[非諾貝特對(duì)抗組，高脂飼料喂養(yǎng)并給予非諾貝特200 mg/(kg·d)干預(yù)8周，商品名：力平之，原料由法國(guó)利博福尼制藥公司提供]、E組[卡托普利+非諾貝特聯(lián)合對(duì)抗組，高脂飼料喂養(yǎng)并給予卡托普利10 mg/(kg·d)+非諾貝特200 mg/(kg·d)干預(yù)8周]，非諾貝特與卡托普利均用0.9%氯化鈉制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。8周干預(yù)結(jié)束后、禁食水12 h后、抽取尾緣靜脈血檢測(cè)GSH-PX、SOD、ROS酶活性與MDA、VEGF濃度后立即處死大鼠(ELISA檢測(cè)試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品，GSH-PX、SOD、ROS檢測(cè)試劑盒均為南京建成生物科技公司產(chǎn)品)，在專業(yè)眼科醫(yī)生指導(dǎo)下取小鼠眼球，并在冰臺(tái)上顯微鏡下快速仔細(xì)分離視網(wǎng)膜組織行Tunel染色(免疫組織化學(xué)試劑盒為中杉金橋公司產(chǎn)品)。

1.2.3GSH-PX、SOD、ROS酶活性與MDA、VEGF濃度測(cè)定抽取大鼠尾緣靜脈血，用酶聯(lián)免疫法(ELISA)法測(cè)定VEGF濃度，檢測(cè)GSH-PX活性、SOD活性、MDA含量、ROS活性。將血清在離心機(jī)10 000～15 000 r/min離心，勻漿時(shí)間10 s/次，間隙30 s，連續(xù)3～4次，溫度4 ℃，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定GSH-PX、SOD與ROS活性，并檢測(cè)MDA含量。所取標(biāo)本均在1周內(nèi)測(cè)定。

2　結(jié)果

2.1各組造模成功情況四組成功造模情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2視網(wǎng)膜細(xì)胞Tunel指數(shù)檢測(cè)B組大鼠眼球視網(wǎng)膜細(xì)胞Tunel指數(shù)高于其他4組(P<0.05)，E組大鼠眼球視網(wǎng)膜細(xì)胞Tunel指數(shù)低于C組、D組(P<0.05)，D組大鼠眼球視網(wǎng)膜細(xì)胞Tunel指數(shù)低于C組(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

表1　四組造模成功情況(例，%)

2.3GSH-PX活性、SOD活性、MDA含量、ROS活性檢測(cè)結(jié)果A組大鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值均高于其他4組(P<0.05)，而ROS、MDA、VEGF均低于其他4組(P<0.05)；B組大鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值均低于其他4組(P<0.05)，而ROS、MDA、VEGF均高于其他4組(P<0.05)；E組大鼠外周血清GSH-PX、SOD活性值均高于C組、D組(P<0.05)，而ROS、MDA、VEGF均低于C組、D組(P<0.05)；D組大鼠外周血清GSH-PX、SOD活性高于C組(P<0.05)，而ROS、MDA均低于C組(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

2.4VEGF濃度檢測(cè)結(jié)果A組大鼠外周血清VEGF均低于其他4組(P<0.05)；B組大鼠外周血清VEGF均高于其他4組(P<0.05)；E組大鼠外周血清VEGF均低于C組、D組(P<0.05)；D組大鼠外周血清VEGF濃度值低于C組(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4。

圖1　視網(wǎng)膜組織Tunel染色表達(dá)情況(×400)

表2　Tunel指數(shù)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與D組比較，▽P<0.05

3　討論

近年來(lái)大量研究證實(shí)，DR的發(fā)生、發(fā)展與視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)[7]，且糖尿病導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡遠(yuǎn)早于微血管病變[8]。目前關(guān)于DR視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究集中在氧化應(yīng)激損傷方面[9]。細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，其會(huì)切斷核小體間的基因組DNA，常采用Tunel染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，匡洪宇等[10]研究表明，高糖狀態(tài)下，牛視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生凋亡，Tunel指數(shù)升高。GSH-PX是人體內(nèi)重要的抗氧化酶，能清除自由基，促進(jìn)SOD的抗氧化活力，阻斷超氧離子誘導(dǎo)的自由基連鎖反應(yīng)，這兩種酶的活性反映了組織氧化與抗氧化間的平衡[11]。DR患者外周血往往存在過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致ROS活性和MDA濃度升高[12]。

視網(wǎng)膜組織Tunel染色結(jié)果表明，非諾貝特和卡托普利均能抑制DR眼球視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，且非諾貝特效果優(yōu)于卡托普利，既往曾有研究證實(shí)，非諾貝特、卡托普利均能抑制心肌肥厚細(xì)胞發(fā)生凋亡[13-14]。兩藥抑制DR視網(wǎng)膜細(xì)胞的研究較少，而兩藥合作效果優(yōu)于單藥應(yīng)用。

表3　外周血GSH-PX、SOD、ROS活性

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與D組比較，▽P<0.05

表4　外周血VEGF、MDA濃度

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05；與D組比較，▽P<0.05

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，非諾貝特和卡托普利均能抑制過(guò)氧化反應(yīng)，而非諾貝特抑制效果強(qiáng)于卡托普利，兩藥聯(lián)合效果更佳。A組大鼠外周血清VEGF低于其他4組；B組大鼠外周血清VEGF高于其他4組；E組大鼠外周血清VEGF低于C組、D組；D組大鼠外周血清VEGF濃度值低于C組，進(jìn)一步證實(shí)了非諾貝特與卡托普利均能抑制VEGF，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同[1,3]。

本實(shí)驗(yàn)僅僅研究了作用8周后的作用效果，今后需要增加作用時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)一步了解視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡變化情況。本研究結(jié)果表明，卡托普利聯(lián)合非諾貝特能很好地抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生凋亡，為今后的臨床及預(yù)防工作提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Study on the protective effect of captopril combined with fenofibrate on diabetic retinopathy in diabetic rats

LI Ling-bing1,ZHAO Yue-ping1,XU Wei2,TAI He1*

(1.Department of Endocrinology,Liaoning Provincial Corps Hospital of Chinese People′s Armed Police Forces,Shenyang 110034,China;2.Medicinal Chemistry and Pharmaceutical Analysis Section,Logistics University of Chinese People′s Armed Police Forces,Tianjin 300300,China)

ObjectiveTo study the mechanism of captopril combined with fenofibrate in protecting diabetic retinopathy and detect the apoptosis in the eyes,and the VEGF,oxidizing material in the serum.MethodsTotally 100 viripotent SD rats were randomly divided into five groups,20 rats in each group.Group A (Sham group,rats being given common forage and injected with sodium chloride),group B (Model group,exposure to high-fat diet for 4 weeks,rats being injected intraperitoneally with STZ,then lavaged with sodium chloride for 8 weeks),group C (Captopril intervention group,exposure to high-fat diet for 4 weeks,rats being injected intraperitoneally with STZ,then lavaged with captopril for 8 weeks),group D (Fenofibrate intervention group,exposure to high-fat diet for 4 weeks,rats being injected intraperitoneally with STZ,then lavaged with fenofibrate for 8 weeks),group E (captopril combined with fenofibrate intervention group,exposure to high-fat diet for 4 weeks,rats being injected intraperitoneally with STZ,then lavaged with fosinopril combined with fenofibrate for 8 weeks).Blood was taken to detect the activity of GSH-PX,SOD,ROS and the concentration of MDA,VEGF,then the rats were euthanized,and the apoptosis of retinal cells was detected through the Tunel staining method in the eyes.ResultsThe activity of GSH-PX and SOD in group A was higher than those of other four groups (P<0.05),but the concentration of ROS,MDA,VEGF and the Tunel index was lower (P<0.05).The activity of GSH-PX and SOD in group B was lower than other four groups (P<0.05),but the concentration of ROS,MDA,VEGF and the Tunel index was higher (P<0.05).The activity of GSH-PX and SOD in group E was lower than that of group C and group D (P<0.05),but the concentration of ROS,MDA,VEGF and the Tunel index was higher (P<0.05).The activity of GSH-PX and SOD in group D was higher than that of group C (P<0.05),but the concentration of ROS,MDA and the Tunel index was lower (P<0.05).The concentration of VEGF in group D was lower than that of group C (P<0.05).ConclusionCaptopril and fenofibrate can both improve the diabetic retinopathy;through inhibiting the apoptosis and oxidation,and the combination of captopril with fenofibrate can get better effect.

Diabetic retinopathy;Rat;Captopril;Fenofibrate;Vascular endothelial growth factor;Oxidation;Apoptosis

2015-12-31

1.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽(yáng) 110034；2.武警后勤學(xué)院藥物化學(xué)與藥物分析教研室，天津 300300

10.14053/j.cnki.ppcr.201609006