普羅布考聯(lián)合瑞舒伐他汀對糖尿病大鼠對比劑急性腎損傷保護(hù)作用的研究

曹　媛

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普羅布考聯(lián)合瑞舒伐他汀對糖尿病大鼠對比劑急性腎損傷保護(hù)作用的研究

曹媛

目的探討普羅布考聯(lián)合瑞舒伐他汀對糖尿病大鼠對比劑急性腎損傷的保護(hù)作用。方法SD大鼠100只，隨機(jī)分為空白對照組(20只)及造模組(80只)，利用鏈脲佐菌素進(jìn)行糖尿病造模，并利用優(yōu)維顯碘普羅胺對造模成功的76只大鼠進(jìn)行對比劑造影，同時將上述大鼠隨機(jī)平均分為聯(lián)合用藥組(灌胃給予普羅布考及瑞舒伐他汀)、普羅布考組(僅灌胃給予普羅布考)、瑞舒伐他汀組(僅灌胃給予瑞舒伐他汀)、模型組(僅灌胃給予生理鹽水)。觀察造影前、造影后24、48及72 h各組大鼠血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)的變化情況；觀察各組大鼠腎臟病理標(biāo)本；檢測各組大鼠造影72 h后氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化情況(超氧化物歧化酶、超敏C反應(yīng)蛋白、丙二醛及谷胱甘肽過氧化物酶)。結(jié)果與模型組比較，聯(lián)合用藥組、普羅布考組及瑞舒伐他汀組造影24、48及72 h后Scr、BUN均明顯下降，聯(lián)合用藥組上述指標(biāo)改善程度明顯優(yōu)于普羅布考組及瑞舒伐他汀組；聯(lián)合用藥組大鼠病理切片情況均明顯優(yōu)于造模組、普羅布考組和瑞舒伐他汀組，其腎小管損傷評分為0.62分，明顯優(yōu)于造模組(2.5分)、普羅布考組(1.62分)和瑞舒伐他汀組(1.57分)；造影72 h后，聯(lián)合用藥組超氧化物歧化酶、超敏C反應(yīng)蛋白、丙二醛及谷胱甘肽過氧化物酶改善程度明顯優(yōu)于普羅布考組及瑞舒伐他汀組。結(jié)論普羅布考聯(lián)合瑞舒伐他汀對糖尿病大鼠對比劑急性腎損傷具有較好的保護(hù)作用，其效果優(yōu)于各單一用藥。

普羅布考；瑞舒伐他汀；對比劑；急性腎損傷；糖尿病

0　引言

隨著現(xiàn)代造影技術(shù)普及程度的不斷增加，對比劑的使用亦明顯增多[1]。然而，由此所導(dǎo)致的對比劑損傷(Contrast-induced nephropathy，CIN)發(fā)病率亦明顯升高[2]。CIN為使用對比劑后48～72 h中，患者血清肌酐(Serum creatinine，Cr)的絕對值升高0.5 mg/dL或其相對值升高25%[3-4]。目前，CIN已成為醫(yī)院獲得性腎功能衰竭的三大主要原因之一，相關(guān)流行病學(xué)研究結(jié)果表明，CIN的危險因素主要包括糖尿病、高血壓、高齡及腎臟功能不全等，其中糖尿病是對比劑腎損傷發(fā)生的最常見危險因素之一[5-6]，但目前針對糖尿病患者CIN治療的相關(guān)研究較為缺乏，臨床亦無權(quán)威治療手段。盡管在臨床中逐漸開始分別使用瑞舒伐他汀或普羅布考單一給藥來治療對比劑腎損傷，但其聯(lián)合用藥是否對糖尿病對比劑腎損傷具有更好的治療作用，目前國內(nèi)相關(guān)的研究及報道并不充分。為此，本研究通過探討該聯(lián)合用藥對大鼠對比劑損傷的保護(hù)作用，為臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物健康清潔級SD大鼠100只，雌雄不分，體重150～200 g，周齡8～10周，由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供并代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，日常光照及自由飲水。動物合格證編號：SCXK(陜)2014-0219。

1.1.2主要實驗藥品與儀器瑞舒伐他汀(阿斯利康制藥有限公司；批號：08097812；規(guī)格：10 mg/片)，普羅布考(齊魯制藥有限公司；批號：2014090823；規(guī)格：125 mg/片)，優(yōu)維顯碘普羅胺(德國拜耳醫(yī)藥公司；批號：90982107；碘含量：370 mg/mL；規(guī)格：50 mL/瓶；滲透壓為774 mOsm/kgH2O)，STZ(鏈脲佐菌素，美國SIGMA公司，批號：87098921)。ELX800型全自動酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)；LX20型全自動生化儀(美國貝克曼公司)；CX41型生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；MODEL722型紫外分光光度計(上海觀科分光儀有限公司)。

1.2實驗動物分組及給藥方法

1.2.1大鼠給藥劑量根據(jù)藥物使用說明書，瑞舒伐他汀和普羅布考的人體用藥一般劑量分別為10 mg/d及450 mg/d，按照文獻(xiàn)公式[7]：大鼠劑量(mg/kg)=成人劑量(mg/kg)×6.25，成人體重按60 kg計：瑞舒伐他汀的人體正常劑量為：10 mg/60 kg=0.167 mg/kg，換算每只大鼠(按150 g標(biāo)準(zhǔn)體重計)每天用量：0.167×6.25=1.043 mg/kg；普羅布考的人體正常劑量為：450 mg/60 kg=7.5 mg/kg，換算每只大鼠(按180 g計)每天用量：7.5×6.25=46.87 mg/kg。

1.2.2建立糖尿病大鼠模型隨機(jī)選取80只大鼠分為造模組，在禁食12 h后給予一次性單劑量STZ腹腔注射(劑量：60 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。注射后72 h和7 d后，分別對所有大鼠進(jìn)行尾靜脈取血，利用葡萄糖氧化酶法測其血糖，共計76只大鼠達(dá)到糖尿病大鼠的成模標(biāo)準(zhǔn)(非禁食血糖≥16.65 mmol/L)[8]，其中1只大鼠未造模成功而棄除，3只大鼠造模期間死亡。

1.2.3實驗動物分組將上述剩余20只正常大鼠分為正常對照組，將造模成功的造模組大鼠(76只)隨機(jī)平均分為4個小組：普羅布考組、瑞舒伐他汀組、普羅布考與瑞舒伐他汀聯(lián)合用藥組(聯(lián)合用藥組)及模型組，每組19只。

1.2.4大鼠給藥及實驗方法根據(jù)“1.2.2”項中糖尿病造模并飼養(yǎng)7 d后，按照10 mg/kg的劑量對造模組大鼠進(jìn)行優(yōu)維顯碘普羅胺尾靜脈注射，注射造影完成后1 h，分別對各組大鼠進(jìn)行灌胃給藥，普羅布考組給予普羅布考7.5 mg/kg；瑞舒伐他汀組給予瑞舒伐他汀1.043 mg/kg；聯(lián)合用藥組同時給予普羅布考7.5 mg/kg及瑞舒伐他汀1.043 mg/kg；模型組及正常組大鼠均僅給予等量生理鹽水灌胃。

各組大鼠在造影前均禁水禁食12 h，并分別于造影前及造影后48 h和72 h對各組大鼠進(jìn)行內(nèi)眥取血，分離血清并保存于-80 ℃冰箱備用。實驗72 h取血完成后處死各組大鼠，剖腹取雙側(cè)腎，其中一側(cè)腎臟利用多聚甲醛(pH=7.4)固定保存，用石蠟包埋制片；另一側(cè)腎臟則利用玻璃勻漿器制作成大鼠腎臟組織勻漿。

1.3大鼠檢測指標(biāo)①利用全自動生化儀檢測各組大鼠造影前，造影后24、48、72 h血清中血肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)等腎功能指標(biāo)含量。②大鼠腎臟病理及腎小管評分[9]：對“1.2.4”項中得到的大鼠腎臟切片進(jìn)行HE染色，并利用光鏡觀察其病理變化情況。利用Paller法對大鼠腎小管進(jìn)行評分，即根據(jù)腎小管萎縮及擴(kuò)張程度、腎小管上皮細(xì)胞空泡變性及壞死程度和腎臟間質(zhì)纖維化程度，重度、中度、輕度及無分別計為3、2、1及0分。各組大鼠切片均連續(xù)觀察10個不重疊的高倍視野，并計算其平均分。③大鼠腎組織勻漿氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測：造影72 h后，分別采用黃嘌呤氧化酶法、雙位點夾心酶聯(lián)免疫吸附法、硫代巴比妥酸比色法及化學(xué)比色法分別檢測各組大鼠腎組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、超敏C反應(yīng)蛋白(hr-CRP)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)含量。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠腎臟功能指標(biāo)變化情況與空白對照組比較，造影24 h后，模型組Scr及BUN含量均明顯升高25%以上，提示本實驗中糖尿病對比劑腎損傷造模成功；與空白對照組比較，模型組、聯(lián)合用藥組、普羅布考組及瑞舒伐他汀組造影24、48及72 h后，Scr、BUN均明顯上升，各組相關(guān)指標(biāo)與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，聯(lián)合用藥組、普羅布考組及瑞舒伐他汀組造影24、48及72 h后，Scr、BUN均明顯下降，各組相關(guān)指標(biāo)與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組上述指標(biāo)改善程度明顯優(yōu)于普羅布考組及瑞舒伐他汀組，各組相關(guān)指標(biāo)與聯(lián)合用藥組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1　造模前后各組大鼠血清Scr含量變化情況

注：與聯(lián)合用藥組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2　造模前后各組大鼠血清BUN含量變化情況

注：與聯(lián)合用藥組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2各組大鼠HE染色腎小管損傷程度檢測情況空白對照組大鼠腎臟切片可見其腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細(xì)胞未出現(xiàn)明顯損傷；模型組大鼠中可見部分腎小管結(jié)構(gòu)破壞，腎小球內(nèi)皮及上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性、腫脹，大量腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性、細(xì)胞及刷狀緣脫落、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及灶性水腫，與空白對照組腎小管上皮細(xì)胞損傷評分相比顯著增加(P<0.05)；普羅布考組及瑞舒伐他汀組大鼠病理切片情況基本一致，均可見腎小球系膜細(xì)胞以及基質(zhì)中度增生，毛細(xì)血管袢管腔無壓迫，其腎小管上皮細(xì)胞損失評分相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合用藥組中可見大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)部分空泡變性及輕度腫脹，腎間質(zhì)出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，其較模型組大鼠損傷明顯減輕，腎小管損傷評分分別與普羅布考組及瑞舒伐他汀組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表1、見圖3。

表1　各組大鼠腎小管損傷評分比較情況(分)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與聯(lián)合用藥組比較，#P<0.05

2.3各組大鼠腎組織勻漿氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測情況造影72 h后，聯(lián)合用藥組、普羅布考組及瑞舒伐他汀組大鼠腎組織勻漿中SOD及GSH-PX較模型組均明顯升高，各組相關(guān)數(shù)據(jù)與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；造影72 h后，聯(lián)合用藥組、普羅布考組及瑞舒伐他汀組大鼠腎組織勻漿中hr-CRP及MDA較模型組均明顯降低，各組相關(guān)數(shù)據(jù)與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；造影72 h后，聯(lián)合用藥組相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)改善程度均明顯優(yōu)于普羅布考組及瑞舒伐他汀組，聯(lián)合用藥組相關(guān)數(shù)據(jù)與各組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3　討論

近十幾年來，由于介入診療技術(shù)在冠心病等疾病治療中的發(fā)展突飛猛進(jìn)，對比劑的應(yīng)用亦越來越廣泛[10]，該藥物在對臨床診斷與治療中起著重要作用的同時，不良反應(yīng)亦不容忽視，其中最常見的即對比劑腎損傷(CIN)[11-12]。糖尿病不僅是冠心病常見的并發(fā)癥，同時還是CIN的高危因素，根據(jù)相關(guān)流行病學(xué)研究結(jié)果，在糖尿病患者中，CIN的總發(fā)生率高達(dá)5.7%～29.4%，相比非糖尿病對比劑腎損傷，糖尿病對比劑腎損傷對腎臟的損害更大，預(yù)后也更差[13]。目前臨床對于糖尿病對比劑腎損傷的治療方法有很多，除水化治療之外，他汀類等降血脂藥物也能夠有效預(yù)防糖尿病對比劑腎病。普羅布考具有抗脂質(zhì)過氧化及調(diào)節(jié)血脂的藥理作用，臨床廣泛應(yīng)用于血脂調(diào)節(jié)及抗動脈粥樣硬化[14-15]。瑞舒伐他汀作為重要的他汀類藥物，不僅能夠有效降低血脂，同時還可用于預(yù)防缺血性腎病[16]。

圖3　光鏡下各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)變化

注：A.空白對照組,B.模型組,C.聯(lián)合用藥組,D.普羅布考組,E.瑞舒伐他汀組

注：a.聯(lián)合用藥組與模型組比較；b.普羅布考組與模型組比較；c.瑞舒伐他汀組與模型組比較；d.聯(lián)合用藥組與普羅布考組比較；e.聯(lián)合用藥組與瑞舒伐他汀組比較

本研究利用STZ進(jìn)行糖尿病大鼠造模，同時在此基礎(chǔ)上利用造影劑注射完成了糖尿病大鼠CIN模型，該方法成熟可靠，而造影24 h后，模型組Scr及BUN含量均明顯升高25%以上，說明本實驗造模成功。在腎功能相關(guān)血清指標(biāo)觀察中，造影24、48及72 h后，聯(lián)合用藥組、普羅布考組及瑞舒伐他汀組Scr、BUN含量較模型組均明顯下降，而聯(lián)合用藥組上述指標(biāo)改善程度明顯優(yōu)于普羅布考組及瑞舒伐他汀組。病理切片結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組大鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)部分空泡變性及輕度腫脹，腎間質(zhì)出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象，腎臟損傷較模型組、普羅布考組及瑞舒伐他汀組明顯減輕。上述實驗結(jié)果說明了普羅布考與瑞舒伐他汀聯(lián)合用藥對大鼠腎臟功能的改善效果明顯優(yōu)于單一給藥。其機(jī)制可能在于瑞舒伐他汀可通過抑制氧化亞氮衍生物的氧化，上調(diào)腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶等作用來保護(hù)腎臟功能[17]；而普羅布考可抑制機(jī)體致炎因子的基因表達(dá)，對自由基介導(dǎo)的炎癥具有較強(qiáng)的改善作用，因此，兩藥聯(lián)合使用可產(chǎn)生協(xié)同作用，提高治療效果。此外，自由基反應(yīng)是正常機(jī)體的一類防御機(jī)制，自由基的產(chǎn)生與清除之間失衡是導(dǎo)致組織損傷的重要原因[18]。各組大鼠腎組織勻漿中相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的比較結(jié)果提示，聯(lián)合用藥的方法對于糖尿病CIN大鼠SOD及MDA等指標(biāo)的改善程度明顯優(yōu)于單一用藥組，表明普羅布考與瑞舒伐他汀聯(lián)合用藥較單一藥物治療能夠更有效地緩解糖尿病CIN大鼠腎臟氧化應(yīng)激情況，對其組織損傷具有更好的保護(hù)作用。

由于相關(guān)文獻(xiàn)的缺乏等原因，本研究亦存在一些不足：首先，實驗設(shè)計中僅針對不同的用藥方法進(jìn)行研究，而對于同一治療方法的不同給藥劑量則缺少探討，這種劑量與治療效果的相關(guān)性在后期研究中應(yīng)該予以闡述；其次，本研究結(jié)果相關(guān)機(jī)制仍不明確，還需要深入討論；再次，由于本實驗是為臨床優(yōu)化用藥做理論基礎(chǔ)，因此，還需在后期探討中對聯(lián)合用藥后的不良反應(yīng)情況進(jìn)行詳細(xì)觀察；最后，本實驗中缺少對各組大鼠尿液中相關(guān)指標(biāo)的檢測，而對腎功能相關(guān)的血清指標(biāo)檢測項目也不足，后續(xù)研究中應(yīng)予以補(bǔ)充。

綜上所述，普羅布考聯(lián)合瑞舒伐他汀較單一用藥能夠更有效地保護(hù)糖尿病大鼠對比劑急性腎損傷，值得展開深入研究。

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Protective effects of probucol combined with rosuvastatin on the diabetic contrast-induced nephropathy in rats

CAO Yuan

(Baoji Renmin Hospital,Baoji 721000,China)

ObjectiveTo explore the protective effect of probucol combined with rosuvastatin on the diabetic contrast-induced nephropathy in rats.MethodsTotally 100 SD rats were randomly divided into five groups:blank control group,model group,probucol group,rosuvastatin group and combination group.STZ was injected to make the diabetic model in the model group,probucol group,rosuvastatin group and combination group.Contrast agent was injected into such groups.Serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN) were observed before making model,after making model for 24 h,48 h and 72 h.The pathologic changes and SOD,MDA,GSH-PX and hr-CRP levels were observed.ResultsScr in model group were all increased over 25% after contrast agent injection for 24 h,48 h and 72 h.Compared with model group,the Scr and BUN levels decreased in probucol group,rosuvastatin group and combination group,and the promotion of combination group was better than probucol group and rosuvastatin group.The renal tubular damage score was 0.62 in combination group,which was highter than of model group (2.50),probucol group (1.62) and rosuvastatin group (1.57).The improvement of SOD,MDA,GSH-PX and hr-CRP levels in combination group were better than those of other groups.ConclusionProbucol combined with rosuvastatin has protective effect on the acute kidney injury induced by contrast agent in rats,which is better than the single use of probucol or rosuvastatin.

Probucol;Rosuvastatin;Contrast agent;Acute kidney injury;Diabetes

2016-01-25

寶雞市人民醫(yī)院藥劑科，陜西 寶雞 721000

10.14053/j.cnki.ppcr.201609008