基于偏最小二乘法的近紅外光譜模型用于丹參口服液提取過程的分析

馮婉紅,鄒艷君,麻淑磊*

?

·藥學研究·

基于偏最小二乘法的近紅外光譜模型用于丹參口服液提取過程的分析

馮婉紅1,鄒艷君2,麻淑磊2*

目的探討丹參口服液提取過程采用近紅外光譜(NIR)分析的可能性及其方法。方法制備共122份提取液，采用高效液相色譜法(HPLC)測定原兒茶醛含量，并收集NIR圖，用偏最小二乘法(PLS)建立校正模型。結(jié)果采用二階求導及Savitzky-Golay平滑處理后的校正模型交叉驗證均方根誤差(RMSECV)為3.456，相關(guān)系數(shù)為0.988，優(yōu)于其他優(yōu)化方式。結(jié)論基于PLS的原兒茶醛NIR模型可用于丹參口服液提取過程的在線分析。

丹參口服液；質(zhì)量控制；近紅外光譜；偏最小二乘法

0　引言

丹參為唇形科鼠尾草植物丹參(Salviamiltiorrhiza)的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功。由丹參單味藥材煎煮制成的丹參口服液屬于醫(yī)保乙類藥，具有較為優(yōu)良的療效，且不良反應小，臨床上用于治療心絞痛[1-3]、冠心病[4-5]等心血管疾病?！兜⒖诜嘿|(zhì)量標準》(以下簡稱“標準”)現(xiàn)收錄于國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標準，指標性成分為原兒茶醛[6]。

中藥提取液的質(zhì)量直接決定了制劑的質(zhì)量，因此有必要進行實時監(jiān)控。在線近紅外光譜(NIR)技術(shù)提供了一種對提取過程進行檢測的方法，可以實時監(jiān)控提取液中主要成分的變化情況[7-8]，并根據(jù)這些情況靈活調(diào)整提取方案，從而獲得質(zhì)量最優(yōu)的提取液。本實驗按照“標準”中的提取工藝，采用NIR技術(shù)對其建模，對提取過程進行質(zhì)量控制。

1　儀器及試藥

AntarisⅡ型近紅外光譜儀(Thermo Fisher公司)，配備Version 3 SP4 Result and TQ光譜分析軟件；LC-20AB高效液相色譜儀[島津(中國)有限公司]；Venusil XBP C18色譜柱(博納艾吉爾科技有限公司)；EL104型分析天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]；PHS-3C型精密pH計(上海精科儀器有限公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)。 丹參(批號：141201，產(chǎn)地：山東)購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司；原兒茶醛(批號：110810-201007，含量：98.2%)；氫氧化鈉(分析純，江蘇永華精細化學品有限公司)，無水乙醇(分析純，南京化學試劑有限公司)；醋酸(分析純，南京化學試劑有限公司)；明膠(藥用，青島市豐樂化工有限公司)；液相用甲醇(色譜純，美國天地試劑公司)。

2　試驗方法

2.1提取工藝參照“標準”中工藝，稱取處方量丹參飲片，加11倍量水，提取2次，第1次2 h，第2次1.5 h，濃縮至相對密度為1.10～1.15，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5～5.0，即得。采用此方法，分別于第1次煎煮0.5、1.0、1.5、2.0 h，第2次煎煮0.5、1.0、1.5 h，濃縮后及調(diào)pH后等節(jié)點取樣，重復14組，共得到122份樣品(4份樣品被棄用)，備用。

2.2原兒茶醛含量測定參考文獻報道[9]，經(jīng)過試驗，最終的HPLC色譜條件為：色譜柱為Venusil XBP C18色譜柱，流動相為甲醇-0.2%醋酸(20∶80)，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，檢測波長280 nm。理論塔板數(shù)按原兒茶醛計算不低于8 000，各組分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且各組分的色譜峰對稱，原兒茶醛及樣品色譜圖見圖1。采用上述方法測定各組樣品的原兒茶醛含量。

圖1　丹參口服液原兒茶醛含量測定HPLC色圖譜

2.3近紅外光譜采集取各組樣品，置于樣品池中，測量其透射光譜，光譜范圍12 000～4 000/cm，波長增量為2 nm，掃描次數(shù)為300次，每個樣本采集3張NIR圖譜，取平均值作為樣本的NIR圖譜，所得光譜圖如圖2所示。

3　結(jié)果與討論

3.1模型的建立

3.1.1異常點的剔除由于實驗人員的操作、實驗環(huán)境、儀器自身等存在誤差因素的影響，導致部分樣品的測定結(jié)果出現(xiàn)異常，從而使模型精密度下降。通過采用相關(guān)性對照檢驗及參考馬氏距離(杠桿值)等方法，可將異常點剔除[10]。線性回歸圖橫坐標為實測值，縱坐標為預測值，離回歸線很近或落在回歸線上面的點，說明預測值與實際值很接近或者一致，離回歸線過遠的點則為異常點。馬氏距離圖在優(yōu)化建模參數(shù)時作為輔助參考指標。見圖3。

圖2　提取液的近紅外光譜圖

圖3　異常校正點提出說明

3.1.2模型建立去除異常點后，首先運用Version 3 SP4 Result and TQ光譜分析軟件進行光譜范圍分析，發(fā)現(xiàn)譜區(qū)的差異主要集中在8 449.9～6 101.7/cm，因此，選定此范圍作為PLS建模效果最優(yōu)的光譜范圍。檢測過程易受多種因素的影響，從而產(chǎn)生誤差。因此需要對光譜進行預處理，以便去除干擾，擴大有效信息，提高模型的精確度及預測效果。采用標準歸一化法(SNV)處理及Delaunay三角剖分(DT)處理，分別達到了消除光程差異和消除基線漂移的效果。在比較原始圖譜、一階導數(shù)、二階導數(shù)后，增加了SG平滑、Norris平滑兩種平滑方式與求導聯(lián)用，進一步提升優(yōu)化效果(見表1)。

通過對各組模型進行對比，發(fā)現(xiàn)二階導數(shù)+SG平滑組的預處理效果最好，RMSECV最小，R2優(yōu)于其他模型，故選擇該模型作為原兒茶醛的定量模型，其校正曲線如圖4A所示。模型的主因子數(shù)也是模型建立的一個重要的參考指標，選取的主因子數(shù)越多，引入噪聲的可能性越大，模型也越不穩(wěn)定；但主因子數(shù)過少時，易造成有效信號的遺漏，使模型的準確性達不到要求，故主因子數(shù)選擇應適中(通常為8～10)。主因子數(shù)的選擇主要以預測殘差平方和及RMSECV為指標，以兩者拐點時的主因子數(shù)為最佳主因子數(shù)。主因子數(shù)-PRESS、主因子數(shù)-RMSECV相關(guān)圖見圖4B、4C，由圖可知，當主因子數(shù)為8時，PRESS和RMSECV均處于拐點，因此，以主因子數(shù)為8時的模型為最優(yōu)模型。

表1　原兒茶醛的校正模型

圖4　原兒茶醛含量測定的校正和測試模型

3.2近紅外光譜模型的驗證

3.2.1精密度考察取1個批次樣品重復測量6次近紅外光譜，分別用建立的原兒茶醛定量分析模型計算得到原兒茶醛的含量，考察方法的精密度，結(jié)果RSD為1.1%。

3.2.2準確性考察校正集樣品經(jīng)外部驗證，RMSEV為0.86%，與實際含量相比，NIR測定結(jié)果平均RSD為1.35%，最大RSD為2.98%。外部驗證均方差為0.137%，與實際含量相比，NIR測定結(jié)果平均RSD為1.51%，最大RSD為2.47%。將驗證集樣品NIR結(jié)果與實際含量在95%置信區(qū)間內(nèi)進行配對t檢驗，NIR檢測與參考方法結(jié)果無顯著差異。

3.2.3穩(wěn)定性考察取1批次樣品，于0、2、4、6、8、12、24、36、48和60 h測定光譜，用模型分析其含量，考察其穩(wěn)定性，RSD為1.08%。說明模型具有良好穩(wěn)定性。

3.2.4實際樣品含量分析用建立的原兒茶醛近紅外模型分析3組樣品，并將結(jié)果與實際含量比較，結(jié)果見表2，NIR方法與實際含量間無顯著差異。

表2　三組樣品分析結(jié)果

4　結(jié)論

PLS通過最小化誤差的平方和找到一組數(shù)據(jù)的最佳函數(shù)匹配，易于辨別系統(tǒng)信息與噪聲，是NIR建模的常用算法[11]。但是中藥提取物成分復雜，即使采用PLS也難以較好地區(qū)分系統(tǒng)信息與噪聲。通過對NIR圖譜共振峰進行求導，可將共振峰銳化，使原本難以分離的峰得以分離，從而減少噪聲的干擾；二階導數(shù)是在一階導數(shù)的基礎(chǔ)上再進行一次求導，減少噪聲的效果更好。SG平滑是利用中心點及其前3個點和后3個點進行最小二乘法擬合，可以減少噪聲對結(jié)果的影響。根據(jù)最終結(jié)果，二階導數(shù)聯(lián)合SG平滑更適用于丹參口服液的NIR圖譜處理。

中藥提取過程的在線監(jiān)控，一直都是中藥現(xiàn)代化研究的一個重要方面和熱點。常規(guī)的定量方法，如HPLC、紫外法(UV)、質(zhì)譜法(MS)等，均無法即時得到測定結(jié)果，無法做到在線監(jiān)控；同時，這三種方法只能分析部分活性成分，無法從整體評價提取液的質(zhì)量。NIR可以有效解決上述兩個問題，且檢測方便，在線監(jiān)控型的NIR光譜儀只需將探頭插入提取液中，便可即時得到測定結(jié)果，無需對供試液進行處理。因此，NIR可以很好地用于中藥提取過程的在線監(jiān)控。

[1]王俠,李曉慶,吳煥林.丹參多酚酸鹽治療心絞痛的非時機、同期對照臨床研究[J].實用醫(yī)學雜志,2010,26(1):111-113.

[2]王影.注射用丹參凍干對心絞痛患者血液流變學、心電圖的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,20(17):2128-2129.

[3]周松,范叔清,張喜民,等.丹參在治療心絞痛中成藥組分中的應用分析[J].中成藥,2015,37(4):925-928.

[4]劉志寧,趙慶霞,尤莉.丹參多酚鹽注射液對猝死型冠心病復蘇過程中的心肌保護作用[J].南方醫(yī)科大學學報,2010,30(3):645-646.

[5]高傳長,鄒書兵.丹參及其主要成份在冠心病及胰腺炎等疾病中的致病機制[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,30(11):1222-1226.

[6]國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標準.丹參口服液藥品標準[S].2003,71,WS-73(Z-12)9.

[7]陸婉珍,袁洪福,褚小立,等.當代中國近紅外光譜技術(shù)-全國第一屆近紅外光譜學術(shù)會議論文集[C].北京:中國石化出版社,2006:47-53.

[8]瞿海斌,劉曉宣,程翼宇.中藥材三七提取液近紅外光譜的支持向量機回歸校正方法[J].高等學校化學學報,2004,25(1):39-43.

[9]黃趙剛,劉鋼,夏泉,等.HPLC法測定不同廠家丹參注射液中丹參素和原兒茶醛的含量[J].安徽醫(yī)藥,2008,12(11):1055-1056.

[10]張亞非,左翔云,畢宇安,等.近紅外光譜技術(shù)在熱毒寧注射液萃取液濃縮過程中的應用研究[J].中國中藥雜志,2014,39(16):3069-3073.

[11]吳志生.中藥過程分析中NIR技術(shù)的基本理論和方法研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學,2012.

NIR model based on PLS used to analyze the extraction process of Salvia oral

FENG Wan-hong1,ZOU Yan-jun2,MA Shu-lei2*

(1.Hangzhou Xiaoshan Hospital of TCM,Hangzhou 311201,China;2.Yongjia Hospital of TCM,Wenzhou 325401,China)

ObjectiveTo discuss the feasibility and methods of using near infrared (NIR) to analyze the extraction process of Salvia oral.Methods122 extracts were prepared to detect the content of protocatechuic aldehyde by high performance liquid chromatography (HPLC),and the NIR spectrums were collected.Partial least squares (PLS) was used to build the correction model.ResultsWith 2-derivative optimization and Savitzky-Golay smoothing optimization,the RMSECV of the correction model was 3.456,and the correlation coefficient (r) was 0.988,which means 2-derivative optimization and Savitzky-Golay (SG) smoothing optimization were better than other optimizations.ConclusionThe NIR correlation model of protocatechuic aldehyde based on PLS is reliable for quality controlling of Salvia oral on line.

Salvia oral;Quality controlling;NIR;PLS

2016-03-02

1.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院，杭州 311201;2.永嘉縣中醫(yī)醫(yī)院，溫州 325401

永嘉縣科技發(fā)展計劃項目(2015306)

10.14053/j.cnki.ppcr.201609026