梁文娟，張榮光，段廣才，王穎芳，洪麗娟，

張　冰1，王鵬飛1，郗園林1，楊海燕1

(1. 鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，河南鄭州　450001；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng)　453003；3. 河南科技大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，河南洛陽　471023)

?

◇技術(shù)方法研究◇

基于CRISPR對大腸埃希菌O157∶H7的檢測

梁文娟1,2，張榮光1，段廣才1,2，王穎芳3，洪麗娟1，

張冰1，王鵬飛1，郗園林1，楊海燕1

(1. 鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，河南鄭州450001；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng)453003；3. 河南科技大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，河南洛陽471023)

目的基于成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)，建立對大腸埃希菌O157∶H7的新型檢測方法。方法應(yīng)用PCR擴(kuò)增實驗室保存的443株腸道細(xì)菌(310株非O157∶H7大腸埃希菌、35株大腸埃希菌O157∶H7、89株志賀菌和9株沙門菌)的CRISPR1和CRISPR2，并將PCR產(chǎn)物測序；提取CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫中(標(biāo)準(zhǔn)法)100株腸道細(xì)菌(47株非O157∶H7大腸埃希菌、5株大腸埃希菌O157∶H7、9株志賀菌和39株沙門菌)的CRISPR1和CRISPR2序列。使用CRISPRFinder在線軟件分析PCR產(chǎn)物測序序列和CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫的CRISPR序列。ClustalX軟件進(jìn)行間隔序列比對。比較標(biāo)準(zhǔn)法和PCR擴(kuò)增CRISPR兩種方法檢測大腸埃希菌O157∶H7的一致性。結(jié)果共分析543株腸道細(xì)菌，其中75.6%的非O157∶H7大腸埃希菌、75.5%志賀菌、91.7%沙門菌和95%O157∶H7大腸埃希菌含有CRISPR1，其間隔序列數(shù)目為3～26、2～9、2～32、3。57.1%的非O157∶H7大腸埃希菌、77.6%志賀菌、85.4%沙門菌和100%O157∶H7大腸埃希菌含有CRISPR2，其間隔序列數(shù)目為1～20、1～6、2～27、1或4個。95%的O157∶H7大腸埃希菌的CRISPR1和90%CRISPR2分別含有3條獨(dú)特間隔序列(S1-1，S1-2，S1-3)和1條獨(dú)特間隔序列(S2-1)。間隔序列比對結(jié)果顯示，S1-1+S1-2+S1-3和S2-1檢測O157∶H7大腸埃希菌的特異性分別是100%和99.6%。標(biāo)準(zhǔn)法檢測和PCR擴(kuò)增CRISPR1和CRISPR2檢測大腸埃希菌O157∶H7的一致性分別達(dá)99.6%和99.3%?；贑RISPR檢測大腸埃希菌O157∶H7在模擬樣品中的應(yīng)用，結(jié)果顯示在原樣品大腸埃希菌O157∶H7濃度約2.3CFU/mL時，經(jīng)12h增菌后即能檢測出來。大腸埃希菌O157∶H7聚類分析顯示，40株O157∶H7大腸埃希菌可分為3類。結(jié)論基于CRISPR的大腸埃希菌O157∶H7的檢測方法，可以作為監(jiān)測大腸埃希菌O157∶H7感染和高毒株大腸埃希菌O157∶H7有價值的流行病學(xué)工具。

大腸埃希菌O157∶H7；成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)；聚合酶鏈反應(yīng)；檢測

大腸埃希菌O157∶H7是大腸埃希菌中一個重要的致病血清型。O157∶H7菌株感染不僅可引起出血性結(jié)腸炎、闌尾炎、食管狹窄和結(jié)腸穿孔等嚴(yán)重胃腸道并發(fā)癥[1]，而且在兒童和老年人群中還可引起溶血性尿路綜合征(hemolyticuremicsyndrome,HUS)和血栓性血小板紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura,TTP)等并發(fā)癥[2]，嚴(yán)重時可致腎衰竭而死亡。目前大腸埃希菌O157∶H7檢測方法主要有標(biāo)準(zhǔn)法檢測、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。分子生物學(xué)方法主要以PCR檢測方法為主，具有簡便、快速、敏感的特點(diǎn)；通常以特異性的編碼基因O157脂多糖抗原基因(rfbE)、鞭毛抗原H7基因(flic)、志賀樣毒素基因(stx)、溶血素基因(hly)、粘附素基因(eaeA)等作為靶基因[3]；PCR擴(kuò)增鑒定時，需要同時擴(kuò)增rfbE和flic，而毒力因子基因stx、hly、eaeA只能作為輔助鑒定因子。

成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats,CRISPR)主要由重復(fù)序列(repeat)和間隔序列(spacer)等組成；其與CRISPR相關(guān)基因(CRISPR-associatedgenes,Cas)共同構(gòu)成CRISPR/Cas系統(tǒng)[4]。這一系統(tǒng)是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌處理噬菌體[5]、質(zhì)粒[6]等外源遺傳物質(zhì)的原核生物免疫系統(tǒng)，廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。一個細(xì)菌中可以有多個CRISPR位點(diǎn)，在每個CRISPR位點(diǎn)中重復(fù)序列幾乎完全一致；而spacer高度可變。目前，普遍認(rèn)為spacer來源于外源噬菌體和質(zhì)粒等可移動遺傳因子[7]，是細(xì)菌進(jìn)行免疫識別的核心元件；cas可表達(dá)具有多種酶功能的Cas蛋白，從而發(fā)揮CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用[8]。本課題組前期對CRISPR/Cas在志賀菌中的分布特征[9]及其與毒力[10]、耐藥關(guān)系[11]等進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示CRISPR中的spacer對于不同菌株具有一定的識別意義。

本研究通過對實驗室保存和CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫的大腸埃希菌(包括40株大腸埃希菌O157∶H7)、志賀菌和沙門菌的CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行檢測與分析，探討大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR分布特征并建立一種基于CRISPR的大腸埃希菌O157∶H7細(xì)菌的檢測方法，評價其特異性和靈敏性，并比較標(biāo)準(zhǔn)法和PCR擴(kuò)增CRISPR檢測大腸埃希菌O157∶H7的一致性。

1　材料與方法

1.1主要儀器和試劑酵母浸粉、胰蛋白胨(英國Oxoid公司)；瓊脂粉(Sigma公司)；瓊脂糖(BIOWEST公司進(jìn)口分裝)；大腸埃希菌O157膠體金檢測試劑條盒(鄭州萬泰)；大腸埃希菌O157∶H7診斷血清(寧波天潤)；API20E生化鑒定板條(法國梅里埃)；DNA試劑提取盒(上海萊楓生物科技有限公司)。PTC-100型基因體外擴(kuò)增儀(MJRESEARCH公司)；DYY-8C型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀(北京六一儀器廠)；Genesnap圖像掃描儀(美國Syngene公司)。各種固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基在本實驗室按配方配制。

1.2菌株共分析腸道細(xì)菌543株，其中本實驗室細(xì)菌443株和CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫(http://crispr.u-psud.fr/crispr/)細(xì)菌100株。菌株型分別為：O157∶H7大腸埃希菌40株(實驗室35株，數(shù)據(jù)庫5株)，非O157∶H7大腸埃希菌357株(實驗室310株，數(shù)據(jù)庫47株)，志賀菌98株(實驗室89株，數(shù)據(jù)庫9株)，沙門菌48株(實驗室9株，數(shù)據(jù)庫39株)。所有實驗室菌株均經(jīng)過API20E生化鑒定條檢定。

1.3實驗室菌株CRISPR1和CRISPR2的檢測及測序DNA模板制備時，大腸埃希菌采用煮沸法提取DNA，志賀菌和沙門菌根據(jù)試劑盒提取基因組DNA。

PCR擴(kuò)增檢測O157∶H7大腸埃希菌、非O157∶H7大腸埃希菌[12]、志賀菌[9]和沙門菌[9]的CRISPR1和CRISPR2的引物序列、擴(kuò)增條件、體系均參考相應(yīng)文獻(xiàn)。所有引物(表1)由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。將CRISPR1和CRISPR2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠電泳后，由上海生工生物有限公司測序。

表1CRISPR引物序列

Tab.1TheprimersofCRISPRforPCR

CRISPR引物引物序列(5'～3')產(chǎn)物長度(bp)大腸埃希菌CRISPR1FGTTATGCGGATAATGCTACCRCGTAYYCCGGTRGATTTGGA497～1829大腸埃希菌和志賀菌CRISPR2FAAATCGTATGAAGTGATGCATRGTCGATGCAAACACATAAATA579～2318(大腸) 1357(志賀)志賀菌CRISPR1FAGCGACTAACTGGAATCTTGRCAATCTGGCTACTGGAAGTG711～1193沙門菌CRISPR1FGTRGTRCGGATAATGCTGCCRCGTATTCCGGTAGATBTDGATGG628～1261沙門菌CRISPR2FGAGCAATACYYTRATCGTTAACGCCRGTTGCDATAKGTYGRTRGRATGTRG764～1277

R=G或A；Y=T或C；K=G或T；D=G或A或T；B=G或T或C。

1.4同源比對實驗室菌株測序的CRISPR序列和提取CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫的菌株的CRISPR序列均通過CRISPRfinder在線軟件(http://crispr.u-psud.fr/Server/)進(jìn)行分析并獲取重復(fù)序列和spacer信息，所有菌株的spacer比對使用ClustalX軟件，CRISPRTarget在線工具(http://bioanalysis.otago.ac.nz/CRISPRTarget/crispr_analysis.html)查找大腸埃希菌O157∶H7的spacer的同源質(zhì)?；蚴删w。

1.5應(yīng)用CRISPR檢測大腸埃希菌O157∶H7方法對模擬樣品的分析將大腸埃希菌O157∶H7接種于新鮮無菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃過夜(12h)培養(yǎng)。通過菌落計數(shù)方法推算其菌液原液的細(xì)菌數(shù)2.3×109CFU/mL。全脂奶粉10g溶于90mL生理鹽水，滅菌，然后分別加入230CFU/mL和23CFU/mL的大腸埃希菌O157∶H7菌液1mL，混勻作為樣品原液，即大腸埃希菌O157:H7的菌液濃度分別為23、2.3CFU/mL，放置2h。吸取5mL混合液加入45mL的營養(yǎng)肉湯放置37 ℃溫箱進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置兩組平行對照，一組陰性對照，然后于8、12、16、20h各取10mL混合液，分離培養(yǎng)細(xì)菌以提取DNA進(jìn)行CRISPR1檢測，方法同1.3項。

1.6聚類分析使用SPSS21.0對40株(實驗室35株，數(shù)據(jù)庫5株)大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR1和CRISPR2的檢測結(jié)果進(jìn)行樣本聚類分析。

2　結(jié)　　果

2.1543株腸道細(xì)菌的CRISPR和spacer信息PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序序列和提取CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫的菌株的CRISPR序列均使用CRISPRFinder軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示75.6%(270/357)的非O157∶H7大腸埃希菌、75.5%(74/98)志賀菌、91.7%(44/48)沙門菌、95%O157∶H7(38/40)大腸埃希菌含有CRISPR1，其spacer數(shù)目為3～26，2～9，2～32，3；57.1%(204/357)的非O157∶H7大腸埃希菌、77.6%(76/98)的志賀菌、85.4%(41/48)的沙門菌、100%(40/40)的O157∶H7大腸埃希菌含有CRISPR2，其spacer數(shù)目為1～20，1～6，2～27，1或4個(表2)。

2.2大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR1和CRISPR2的電泳結(jié)果實驗室保存O157∶H7大腸埃希菌的CRISPR1和CRISPR2位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果符合其長度(圖1)。

2.3大腸埃希菌O157∶H7的spacer信息及比對結(jié)果通過CRISPRFinder軟件分析40株大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR，結(jié)果顯示95%的(38/40)大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR1可以檢測出完全一致的4條重復(fù)序列(CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC)和3條獨(dú)特spacer(分別命名為S1-1，S1-2，S1-3)，90%(36/40)的大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR2可以檢測出完全一致的2條重復(fù)序列(GGTTTATCCCCACTGGCGCGGGGAAC-TC)和1條獨(dú)特spacer(命名為S2-1)。其中實驗室保存的4株大腸埃希菌O157∶H7CRISPR2分別可以檢測到5條重復(fù)序列和4條spacer(未列出)。通過CRISPRTarget在線工具進(jìn)行spacer的同源比對，結(jié)果顯示沒有發(fā)現(xiàn)與之匹配的同源質(zhì)?；蚴删w(表3)。

表2大腸埃希菌、志賀菌和沙門菌的CRISPR和spacer信息

Tab.2CRISPRandspacersofEscherichia coli,ShigellaandSalmonella

菌株組別CRISPR1菌株數(shù)[n(%)]Spacer數(shù)目CRISPR2菌株數(shù)[n(%)]Spacer數(shù)目非O157∶H7大腸埃希菌實驗室(n=310)238(76.8)3～26172(55.5)1～15數(shù)據(jù)庫(n=47)32(68.1)3～2532(68.1)1～20合計(n=357)270(75.6)3～26204(57.1)1～20志賀菌實驗室(n=89)72(80.9)2～975(84.3)1～6數(shù)據(jù)庫(n=9)2(22.2)2～31(11.1)1合計(n=98)74(75.5)2～976(77.6)1～6沙門菌實驗室(n=9)9(100.0)7～159(100.0)10～16數(shù)據(jù)庫(n=39)35(89.7)2～3232(82.1)2～27合計(n=48)44(91.7)2～3241(85.4)2～27O157∶H7大腸埃希菌實驗室(n=35)33(94.3)335(100.0)1或4數(shù)據(jù)庫(n=5)5(100.0)35(100.0)1合計(n=40)38(95.0)340(100.0)1或4

圖1大腸埃希菌O157∶H7(mel-e200001/hn)的CRISPR1和CRISPR2

Fig.1TheCRISPR1andCRISPR2intheEscherichia coliO157∶H7 (mel-e200001/hn)

M:DL2000marker; 1:CRISPR1; 2:CRISPR2。

表3大腸埃希菌O157∶H7菌株的獨(dú)特spacer信息

Tab.3ThespacersinEscherichia coliO157∶H7

名稱Spacer長度(bp)同源質(zhì)?；蚴删wS1-1AGCGGCACGCTGGATTGAACAAATCCCTGGGC32無S1-2AAACCGAAACACACGATCAATCCGAATATGAG32無S1-3TTTGGTGACAGTTTTTGTCACTGTTTTGGTGA32無S2-1CTCGACTTTAATTTTTTCGCTGCCCGCTTTTGC33無

2.4CRISPR檢測大腸埃希菌O157∶H7方法的特異性經(jīng)過ClustalX比對和分析CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫中47株非O157∶H7大腸埃希菌、9株志賀菌、39株沙門菌和實驗室310株非O157∶H7大腸埃希菌、89株志賀菌、9株沙門菌的spacer，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，spacerS1-1+S1-2+S1-3和S2-1對檢測大腸埃希菌O157∶H7的特異性分別是100%和99.6%(CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫中有2株大腸埃希菌O55:H7含有S1-1和S2-1)。

2.5標(biāo)準(zhǔn)法和CRISPR檢測大腸埃希菌O157∶H7的一致性比較共選用543份腸道菌株，同時進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)法和PCR擴(kuò)增CRISPR1(S1-1+S1-2+S1-3)、CRISPR2(S2-1)的檢測，結(jié)果顯示CRISPR1和CRISPR2與標(biāo)準(zhǔn)法一致性分別達(dá)到99.6%(541/543)和99.3%(539/543)(表4)。

表4兩種檢測大腸埃希菌O157∶H7方法的比較

Tab.4TheconsistencyofthetwomethodsfordetectingE.coliO157∶H7

標(biāo)準(zhǔn)法CRISPR1(S1-1+S1-2+S1-3)+-CRISPR2(S2-1)+-+382364-05030501

2.6基于CRISPR檢測大腸埃希菌O157∶H7對模擬樣品的分析結(jié)果菌液濃度分別為23、2.3CFU/mL的樣品原液經(jīng)培養(yǎng)12h后PCR均能擴(kuò)增出預(yù)期的目的片段(圖2)。

2.7大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR1和CRISPR2樣品聚類分析40株O157∶H7大腸埃希菌的聚類分析結(jié)果顯示可分為3類(圖3)。

圖2CRISPR檢測大腸埃希菌O157∶H7在模擬樣品中的應(yīng)用

Fig.2TheapplicationwithCRISPR1todetectE.coliO157∶H7inthemilksample

M：DL2000marker；1～4、5～8分別為原菌液濃度為23、2.3CFU/mL的樣品培養(yǎng)8、12、16、20h。

圖340株大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR1和CRISPR2樣品聚類分析結(jié)果

Fig.3Theclusteranalysisfor40 Escherichia coliO157∶H7strainswithCRISPR1andCRISPR2

3　討　　論

大腸埃希菌O157∶H7作為大腸埃希菌的一種特定血清型，1982年首次發(fā)現(xiàn)于美國[1]，1986年我國徐州首次檢出，隨后沿海地區(qū)有散發(fā)病例報道，至上世紀(jì)末江蘇和上海爆發(fā)，感染患者超過2萬人，死亡達(dá)177人[13]。大腸埃希菌O157∶H7一般經(jīng)污染的食物和水源感染人類，人被感染后輕者表現(xiàn)腹瀉，嚴(yán)重后果為出血性結(jié)腸炎、出血性尿毒癥，甚至死亡[14]，重癥患者尚無有效的治療方法。因此，高毒株的大腸埃希菌O157∶H7和新發(fā)細(xì)菌的感染檢測非常重要。標(biāo)準(zhǔn)法檢測大腸埃希菌O157∶H7需要3～5d，時間長；分子生物學(xué)檢測大腸埃希菌O157∶H7需同時擴(kuò)增rfbEO157基因和鞭毛抗原H7特異基因flic，而毒力因子stx、hly、eaeA只能作為輔助鑒定因子。

CRISPR/Cas廣泛分布于細(xì)菌和古生菌中。1987年，ISHINO等[15]在對大腸埃希菌的堿性磷酸酶同工酶所對應(yīng)的核酸序列進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)其下游存在29個堿基組成的重復(fù)序列和其間的spacer。2002年，JANSEN等[16]其正式命名為ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，即成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列。本文通過CRISPRFinder對CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫52株大腸埃希菌(5株大腸埃希菌O157∶H7)、9株志賀菌、39株沙門菌的CRISPR和實驗室保存的345株大腸埃希菌(包括35株大腸埃希菌O157∶H7)、89株志賀菌和9株沙門菌的CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示有38株大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR1可以檢測到3條獨(dú)特spacer，36株大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR2可以檢測到1條獨(dú)特spacer，其余4株大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR2分別檢測到4條spacer，與CRISPR2的1條獨(dú)特spacer均不一致，但不影響基于CRISPR1對大腸埃希菌O157∶H7的檢測。4株大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR2的spacer不一致，這是首次在大腸埃希菌O157∶H7發(fā)現(xiàn)，或許可以為大腸埃希菌O157∶H7的分型提供依據(jù)。至于不一致的原因，有可能與其毒力水平有關(guān)，還需要進(jìn)一步實驗研究。

建立基于CRISPR對大腸埃希菌O157∶H7的新型檢測方法特異性好。通過ClustalX比對和分析CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫47株非O157∶H7大腸埃希菌、9株志賀菌、39株沙門菌和實驗室310株非O157∶H7大腸埃希菌、89株志賀菌、9株沙門菌的spacer，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRISPR1的3條獨(dú)特spacer和CRISPR2的1條獨(dú)特spacer對大腸埃希菌O157∶H7的檢測的特異性分別是100%和99.6%(CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫中有2株大腸埃希菌O55∶H7含有S2-1)。SABINE等研究顯示，基于CRISPR定量PCR特異性檢測大腸埃希菌O26∶H11、O45∶H2、O103∶H2、O111∶H8、O121∶H19、O145∶H28、O157∶H7[17]和O104∶H4，提示CRISPR與大腸埃希菌的血清型有一定聯(lián)系，但CRISPR與大腸埃希菌的血清型的內(nèi)在聯(lián)系機(jī)制有待繼續(xù)研究。

CRISPRdatabase數(shù)據(jù)庫中有2株大腸埃希菌O55:H7都含有spacerS2-1，提示spacer能反映出大腸埃希菌O157∶H7與O55:H7有很近的親緣關(guān)系。研究顯示，大腸埃希菌O55:H7丟失O55抗原簇，基因組插入stx噬菌體，捕獲大質(zhì)粒pO157后，可以改變O抗原形成O157∶H7血清型。因此，推測S2-1spacer是O55:H7向O157∶H7進(jìn)化過程中保留下來的，且spacerS1-1和S2-1的存在早于S1-2，S1-3。那么spacerS1-2、S1-3在O157∶H7形成過程中是逐個插入還是作為整體插入染色體，仍需繼續(xù)研究。但spacer或許可以作為新型菌株出現(xiàn)的靶標(biāo)。S1-1、S1-2、S1-3、S2-1與已知質(zhì)粒pO157、stx噬菌體和LEE毒力島均沒有匹配，或許提示O157∶H7的形成過程中有可能還有其他未知可移動元件的參與，或者spacer的形成存在其他機(jī)制，這尚有待進(jìn)一步研究。

本實驗選用543株腸道菌株進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)法和PCR擴(kuò)增CRISPR1(S1-1+S1-2+S1-3)、CRISPR2 (S2-1)比較，結(jié)果顯示CRISPR1、CRISPR2與標(biāo)準(zhǔn)法檢測大腸埃希菌O157∶H7的一致性分別達(dá)到99.6%和99.3%，說明PCR擴(kuò)增CRISPR檢測大腸埃希菌O157∶H7與標(biāo)準(zhǔn)法一致性很好。基于CRISPR檢測大腸埃希菌O157∶H7在模擬樣品中應(yīng)用，結(jié)果顯示原樣品大腸埃希菌O157∶H7菌液濃度分別為23、2.3CFU/mL的樣品經(jīng)培養(yǎng)12h后均能擴(kuò)增出預(yù)期的目的片段，靈敏性較高，可進(jìn)行臨床推廣使用。

大腸埃希菌O157∶H7的CRISPR1和CRISPR2的樣本聚類分析顯示，40株O157∶H7大腸埃希菌可分為3類。大腸埃希菌O157∶H7菌株EDL933、EC4115、Sakai、TW14359、xuzhou21分別引發(fā)了美國、日本、中國暴發(fā)性感染性腹瀉。實驗室菌株是在2000年河南省某縣首次大腸埃希菌O157∶H7感染性腹瀉疫情中收集的，其中31株屬于此類，這提示分離于河南的大腸埃希菌O157∶H7與高毒株大腸埃希菌O157∶H7親緣關(guān)系較近。

基于CRISPR的大腸埃希菌O157∶H7新型檢測方法，積極發(fā)展并用于O157∶H7的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查，將成為監(jiān)測大腸埃希菌O157∶H7感染、高毒株大腸埃希菌O157∶H7或者新型菌株出現(xiàn)的有價值的流行病學(xué)工具。

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(編輯國榮)

DetectionofEscherichiacoliO157∶H7basedonCRISPRlocus

LIANGWen-juan1,2,ZHANGRong-guang1,DUANGuang-cai1,2,WANGYing-fang3,HONGLi-juan1,ZHANGBing1,WANGPeng-fei1,XIYuan-lin1,YANGHai-yan1

(1.DepartmentofEpidemiology,CollegeofPublicHealthofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001; 2.HenanInnovationCenterofMolecularDiagnosisandLaboratoryMedicine,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003; 3.DepartmentofPreventiveMedicine,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471023,China)

ObjectiveToestablishamethodfordetectionandidentificationofEscherichia coliO157∶H7withtheClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats(CRISPR)locusasatargetbyPCR.MethodsPCRamplificationwasusedtodetecttheCRISPRlocusof443strains(310strainsofnon-O157∶H7 Escherichia coli, 35strainsofEscherichia coliO157∶H7, 89Shigellastrains,and9Salmonellastrains).TheCRISPRFinderwasusedtoanalyzethesequencesincludingthe100strains(47strainsofnon-O157∶H7 Escherichia coli, 5strainsofEscherichia coliO157∶H7, 9Shigellastrains,and39Salmonellastrains)intheCRISPRdatabase.ThespacerswerealignedwithClustalX.ThentheconsistencywasanalyzedwiththestandardmethodandPCRamplificationCRISPR1detectionofE.coliO157∶H7.ResultsWefoundthat75.6%ofnon-O157∶H7 Escherichia coli, 75.5%ofShigella, 91.7%ofSalmonellaand95%ofO157∶H7 Escherichia colicontainedCRISPR1.Thenumberofthespacerscouldbe3-26, 2-9, 2-32and3amongthe543strains,respectively. 57.1%ofnon-O157∶H7 Escherichia coli, 77.6%ofShigella, 85.4%ofSalmonellaand100%ofO157∶H7 Escherichia colicontainedCRISPR2;thenumberofthespacerswas1-20, 1-6, 2-27,and1or4,respectively.Threeuniquespacers(S1-1,S1-2,S1-3)andoneuniquespacer(S2-1)couldbedetectedinCRISPR1andCRISPR2oftheEscherichia coliO157∶H7.ThespaceralignmentresultsshowedthatthespecificityoftheEscherichia coliO157∶H7withtheS1-1+S1-2+S1-3andS2-1was100%and99.6%,respectively.TheconsistencyforCRISPR1andCRISPR2detectingO157∶H7 Escherichia coliwas99.6%and99.3%comparedwiththestandardmethod.TheEscherichia coliO157∶H7wasdetectedafter12hourswithasensitivityof2.3CFU/mLmilksample.Theclusteranalysisshowedthat40strainsofO157∶H7 E.colicouldbedividedintothreegroups.ConclusionThedetectionofE.coliO157∶H7basedontheCRISPRlocusbyPCRmaybecomeavaluableepidemiologictoolforthesurveillanceofE.coliO157∶H7infections.

Escherichia coliO157∶H7;clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat(CRISPR);PCR;detection

2015-10-27

2016-04-24

國家科技重大專項(No.2013ZX100046070),新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心(No.XTCX-2015-PY4)

段廣才.E-mail:gcduan@zzu.edu.cn

R37

A

10.7652/jdyxb201605027

SupportedbytheNationalScienceandTechnologyMajorProject(No.2013ZX100046070)andHenanInnovationCenterofMolecularDiagnosisandLaboratoryMedicine(No.XTCX-2015-PY4)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160805.1022.016.html(2016-08-05)