馮珊珊,楊 博,劉愛琴,武 婧,翟惠虹
(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院:1. 外科學(xué)研究室;2. 消化內(nèi)科,寧夏銀川 750004)
?
◇技術(shù)方法研究◇
S100A6siRNA的構(gòu)建及鑒定
馮珊珊1,楊博2,劉愛琴2,武婧2,翟惠虹2
(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院:1. 外科學(xué)研究室;2. 消化內(nèi)科,寧夏銀川750004)
目的利用小片段干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)抑制S100A6蛋白的表達(dá),為研究CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位機(jī)制提供有利的工具。方法設(shè)計(jì)S100A6的siRNA序列,用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將siRNA轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中,在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,用Real-timePCR及Westernblot方法檢測(cè)S100A6在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果構(gòu)建了3對(duì)S100A6-siRNA,熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞成功;RT-PCR證明了在SW480細(xì)胞內(nèi)S100A6的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05);Westernblot證明了SW480細(xì)胞內(nèi)S100A6蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與S100A6si-1、S100A6si-3組相比,S100A6si-2組對(duì)S100A6的mRNA和蛋白抑制效果最明顯(P<0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建了S100A6-siRNA,為CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位機(jī)制研究提供了有利的工具。
結(jié)腸癌;S100A6;siRNA;鈣周期素結(jié)合蛋白
鈣周期素結(jié)合蛋白[calcyclin(S100A6)-binding-protein,CacyBP]是1998年從小鼠艾氏腹水瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的以鈣依賴方式結(jié)合S100A6的蛋白[1];2001年發(fā)現(xiàn)一種人Siah-1結(jié)合蛋白(Siah-1interactingprotein,SIP)與CacyBP序列相同,從此命名為CacyBP/SIP[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),鈣周期素結(jié)合蛋白(CacyBP/SIP)在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中高表達(dá)[3-4]。研究還發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸癌細(xì)胞中,CacyBP/SIP在細(xì)胞質(zhì)表達(dá),給予胃泌素[4-5]、表皮生長(zhǎng)因子[6]、前列腺素E2[7]、缺氧[8]刺激后,CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[4],且CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位后可能與核內(nèi)的細(xì)胞周期調(diào)控因子結(jié)合[9]。細(xì)胞核是細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、分化及遺傳物質(zhì)的調(diào)控中心。因此,CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位機(jī)制尚不明確。根據(jù)CacyBP/SIP結(jié)構(gòu)分析,CacyBP/SIP通過Ca2+可以結(jié)合S100蛋白家族中的S100A1、S100A6、S100B、S100P[10]。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),S100A6可能導(dǎo)致CacyBP/SIP發(fā)生依賴Ca2+濃度方式的核轉(zhuǎn)位。因此,本研究通過S100A6-siRNA的構(gòu)建及鑒定,為CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位機(jī)制研究提供有利的工具。
1.1材料人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞(北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù));S100A6-siRNA(上海吉瑪公司);無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司);小鼠抗人S100A6單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(Santa公司);SYBRGreenPCRMasterMix(ABI公司);逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒(Fermentas公司);LipofectamineTM2000、Trizol(美國(guó)Invitrogen公司);DNA引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞用含有100mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的IMEM培養(yǎng)液,37 ℃、50mL/LCO2條件下培養(yǎng),48h更換1次培養(yǎng)液,用2.5g/L胰酶消化傳代,細(xì)胞傳代3~4次后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
1.2.2S100A6-siRNA引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank提供的S100A6基因cDNA序列(編號(hào)GI:NM_014624),選擇S100A6的靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物(表1)。
表1S100A6-siRNA序列
Tab.1SequenceofS100A6-siRNA
GenesiRNAsequenceTargetsites陰性對(duì)照組Sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'Anti-sense:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'S100A6si-1Sense:5'-GCGAAUGUGCGUUGUGUAATT-3'Anti-sense:5'-UUACACAACGCACAUUCGCTT-3'120~138S100A6si-2Sense:5'-GUGGCCAUCUUCCACAAGUTT-3'Anti-sense:5'-ACUUGUGGAAGAUGGCCACTT-3'349~367S100A6si-3Sense:5'-CCUCUCUGAGUCAAAUCCATT-3'Anti-sense:5'-UGGAUUUGACUCAGAGAGGTT-3'624~642
1.2.3基因轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞,以(5~6)×104/孔細(xì)胞接種于6孔板,細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前更換無抗生素培養(yǎng)基過夜。按照LipofectamineTM2000步驟轉(zhuǎn)染siRNA,將7.5μL標(biāo)記熒光素的陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6h后更換無抗生素的完全培養(yǎng)液,24~72h內(nèi)熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
1.2.4Real-timePCR檢測(cè)S100A6-siRNA效率本實(shí)驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組、S100A6si-1組、S100A6si-2組、S100A6si-3組,檢測(cè)轉(zhuǎn)染72h后各組細(xì)胞S100A6的mRNA表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參,采用Primer4.0軟件設(shè)計(jì)引物[10](表2)。分別提取各組細(xì)胞總RNA,以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用SYBRGreenⅠ熒光染料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性,5min;94 ℃變性,20s;退火59 ℃,20s;延伸72 ℃,20s;40個(gè)循環(huán)。采用Real-timePCR中相對(duì)定量比較Ct值法計(jì)算各組S100A6mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,并根據(jù)各組表達(dá)倍數(shù)差異得出抑制率。
表2RT-PCR引物序列和長(zhǎng)度
Tab.2SequenceandlengthofS100A6-siRNA
GeneSequenceLengthS100A6Forward:5'-GGGAGGGTGACAAGCACAC-3'Reverse:5'-AGCTTCGAGCCAATGGTGAG-3'79bpβ-actinForward:5'-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3'Reverse:5'-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3'208bp
1.2.5Westernblot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中S100A6蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染步驟同上。轉(zhuǎn)染72h后分別提取各組總蛋白,用BCA蛋白分析試劑測(cè)定蛋白濃度。取30μg總蛋白進(jìn)行100g/LSDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜進(jìn)行免疫印跡,以GAPDH為內(nèi)參,檢測(cè)S100A6的蛋白表達(dá)水平。
2.1siRNA陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞用siRNA陰性對(duì)照片段標(biāo)記熒光素FAM摸索轉(zhuǎn)染條件,3組S100A6-siRNA按陰性對(duì)照條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。經(jīng)檢測(cè),轉(zhuǎn)染后72h,轉(zhuǎn)染效率>80%(熒光鏡下細(xì)胞數(shù)/光鏡下細(xì)胞數(shù)),轉(zhuǎn)染效果較理想,可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。
2.2結(jié)腸癌SW480細(xì)胞總RNA的表達(dá)各組轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞,提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)28S和18S特征性條帶,證明細(xì)胞總RNA完整性較好,無明顯降解發(fā)生(圖2)。
2.3結(jié)腸癌SW480細(xì)胞S100A6mRNA的表達(dá)采用Real-timePCR法觀察S100A6在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)的mRNA表達(dá),β-actin為內(nèi)參,得到擴(kuò)增曲線和熔解曲線(圖3),熔解曲線為單峰,擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好,無引物二聚體形成,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。
圖1對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞Fig.1ControlplasmidwastransfectedinSW480cells(×400)
A:光鏡下細(xì)胞數(shù);B:熒光鏡下細(xì)胞數(shù)。
圖2SW480細(xì)胞總RNA的電泳結(jié)果
Fig.2TotalmRNAlevelofSW480cells1. 空白組;2. 對(duì)照組;3.S100A6si-1;4.S100A6si-2;5.S100A6si-3。
圖3擴(kuò)增曲線和熔解曲線
Fig.3Amplificationcurveandmeltcurve
A:擴(kuò)增曲線;B:熔解曲線。
2.4S100A6mRNA的相對(duì)定量結(jié)果采用Real-timePCR中相對(duì)定量比較Ct值法比較目的基因mRNA的相對(duì)含量。結(jié)果顯示,siRNA-S100A6實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比,mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05);S100A6si的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組相比,S100A6si-2組抑制效果最好(P<0.05),抑制率達(dá)到87.9%;空白組與陰性對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表3、圖4)。提示從mRNA水平上證明了S100A6-siRNA明顯抑制了SW480細(xì)胞內(nèi)S100A6的表達(dá)。
表3各組間S100A6mRNA的表達(dá)倍數(shù)
Tab.3mRNAexpressionlevelofS100A6-siRNAindifferentgroups
組別ΔCt值△△Ct倍數(shù)(2-△△Ct)空白組6.896±0.0440.000±0.0441.000陰性對(duì)照組6.891±0.0150.036±0.0150.976S100A6si-1組8.935±0.1102.080±0.1100.237S100A6si-2組9.910±0.1173.055±0.1170.121S100A6si-3組7.632±0.0770.777±0.0770.584
圖4S100A6在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的mRNA表達(dá)
Fig.4mRNAexpressionlevelofS100A6incolonSW480cells
與對(duì)照組比較,*P<0.05;與S100A6si-2比較,#P<0.05。
2.5結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中S100A6蛋白的表達(dá)免疫印跡結(jié)果證明,S100A6siRNA實(shí)驗(yàn)組的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05,圖5),S100A6siRNA實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),S100A6si-2組與S100A6si-1、S100A6si-3組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。提示S100A6si-2組抑制效果最好(P<0.05),抑制率達(dá)到85.0%;空白組與陰性對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示從蛋白水平證明了S100A6在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)受抑制。
在胃癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),胃癌的多藥耐藥性與CacyBP/SIP上調(diào)有關(guān),并且CacyBP/SIP可以調(diào)控胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的應(yīng)答反應(yīng)[11],首次發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP可能是胃癌多藥耐藥治療的潛在靶點(diǎn)。本課題組早期制備了CacyBP/SIP的單克隆抗體[12]。隨后研究了CacyBP/SIP在正常組織及腫瘤組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在正常結(jié)腸黏膜組織不表達(dá),在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)[3]。進(jìn)一步研究了CacyBP/SIP在不同大腸組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在大腸增生性息肉中不表達(dá),在大腸腺瘤組織、大腸癌組織中高表達(dá)。提示CacyBP/SIP可能參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展[13]。研究還發(fā)現(xiàn),CacyBP/SIP在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中亦高表達(dá)[5]。
圖5S100A6在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的蛋白表達(dá)
Fig.5ProteinexpressionlevelofS100A6incolonSW480cells
A:S100A6轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的相對(duì)蛋白表達(dá)量(1:空白組;2:對(duì)照組;3:S100A6si-1;4:S100A6si-2;5:S100A6si-3)。B:不同轉(zhuǎn)染組S100A6/GAPDH的相對(duì)表達(dá)比較,與對(duì)照組比較,*P<0.05;與S100A6si-2比較,#P<0.05。
FILIPEK[14]、WU[15]在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤NB-2a細(xì)胞和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),CacyBP/SIP具有Ca2+依賴的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。本課題組在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),CacyBP/SIP在細(xì)胞質(zhì)表達(dá),給予胃泌素[4-5]、細(xì)胞外刺激因子如表皮生長(zhǎng)因子[6]、前列腺素E2[7]、缺氧[8]刺激,可以誘導(dǎo)CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。研究還發(fā)現(xiàn),在胃癌細(xì)胞[16]和結(jié)腸癌細(xì)胞[5]中,CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核后可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,使G1期縮短。提示CacyBP/SIP通過核轉(zhuǎn)位參與了細(xì)胞周期調(diào)控。我們進(jìn)一步篩選并驗(yàn)證了結(jié)腸癌核轉(zhuǎn)位后的下游信號(hào)分子[9]。但是CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位機(jī)制尚不明確。
根據(jù)CacyBP/SIP的結(jié)構(gòu)分析,CacyBP/SIP可以和S100蛋白家族、Skp1、tubulin及ERK1/2四個(gè)靶蛋白結(jié)合[17],而S100蛋白是唯一依賴Ca2+結(jié)合CacyBP/SIP的靶蛋白。因此,S100蛋白可能調(diào)控CacyBP/SIP依賴Ca2+濃度的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。FILIPEK[1]最早在小鼠艾氏腹水瘤細(xì)胞中以S100A6的配體形式發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中,給予Ca2+刺激,S100A6可以與CacyBP/SIP結(jié)合。S100A6是分子量為10.5ku的小分子鈣離子結(jié)合蛋白,它可以以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核[18]。S100A6在上皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞及不同的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),功能研究中發(fā)現(xiàn)S100A6參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和腫瘤形成[19]。綜上提示,S100A6可能是在結(jié)腸癌細(xì)胞中引起CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位的靶蛋白。
在本課題中,抑制S100A6與CacyBP/SIP結(jié)合的方法有兩種:①在CacyBP/SIP的S100A6結(jié)合區(qū)構(gòu)建缺失突變體(CacyBP△S1000A6);②利用siRNA沉默S100A6的表達(dá)。為排除因CacyBP/SIP結(jié)構(gòu)改變而影響其核轉(zhuǎn)位的情況,本研究選擇沉默S100A6構(gòu)建siRNA。RNAi可以被誘導(dǎo)(小于22個(gè)堿基片段的RNA,稱為小干擾RNA,siRNA)載入到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中,使RNA雙鏈特異性被降解,導(dǎo)致相應(yīng)的基因沉默,是目前用于沉默同源基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的分子技術(shù)。這種由21個(gè)堿基合成的siRNA可以在細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)基因沉默,并發(fā)現(xiàn)比長(zhǎng)片段(如shRNA)的沉默效率更高,尤其是將siRNA導(dǎo)入觸發(fā)基因沉默的細(xì)胞中效果更明顯,原因是在Dicer酶表達(dá)量低的細(xì)胞中,shRNA的基因沉默功能會(huì)受到削弱,但是siRNA不會(huì)受到影響。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)人S100A6的mRNA,選擇了3條特異性siRNA靶序列,分別構(gòu)建了3組siRNA轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,轉(zhuǎn)染S100A6si-2組抑制mRNA和蛋白的表達(dá)效果最好,表明S100A6siRNA構(gòu)建成功。
本研究將S100A6-siRNA轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,從mRNA和蛋白水平鑒定了S100A6-siRNA沉默了S100A6的表達(dá),為CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位機(jī)制研究提供了有利的工具。
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(編輯卓選鵬)
ConstructionandidentificationofS100A6-siRNA
FENGShan-shan1,YANGBo2,LIUAi-qin2,WUJing2,ZHAIHui-hong2
(1.SurgeryLaboratory; 2.DepartmentofDigestiveDiseases,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)
ObjectiveToinhibittheexpressionofS100A6proteinwithshortinterferingRNA(siRNA)soastoprovideausefultoolforstudyingcalcyclin(S100A6)-binding-protein(CacyBP)/SIPnucleartranslocationmechanism.MethodsThesiRNAsoftheS100A6codingsequenceweredesignedandtransientlytransfectedtohumancoloncancerSW480cellsbyLipo-fectamine2000.Westernblotandsemi-quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)analyseswereusedtoexaminetheexpressionofS100A6inthesetransfectants.ResultsS100A6-siRNAwasconstructedandtransientlytransfectedsuccessfullytohumancoloncancerSW480cellsunderthefluorescencemicroscope.SilentexpressionofS100A6atthemRNAandproteinlevelswasconfirmedbyRT-PCRandWesternblot,respectively(bothP<0.05).TheinhibitoryeffectwasthemostobviousinS100A6si-2group(P<0.05).ConclusionTheavailabletooloftheCacyBP/SIPnucleartranslocationmechanismhasbeenprovidedbyconstructingtheS100A6-siRNA.
coloncancer;S100A6;siRNA;CacyBP/SIP
2016-02-15
2016-05-12
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81072040);寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.NZ0897));寧夏醫(yī)科大學(xué)重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.XZ201413)
翟惠虹.E-mail:zhaihuihong@263.net
R57
A
10.7652/jdyxb201605028
SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81072040),theNaturalScienceFoundationofNingxia(No.NZ0897),andtheKeyResearchFundsofNingxiaMedicalUniversity(No.XZ201413)
優(yōu)先出版:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160805.1016.012.html(2016-08-05)