徐桂利，高新，劉錚鑄，鞏元芳，宋海峰*

(1．軍事醫(yī)學科學院放射與輻射研究所，北京　100850；2．河北科技師范學院 動物科技學院，河北 秦皇島　066004)

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乙肝病毒體內(nèi)外感染模型研究進展

徐桂利1,2，高新1，劉錚鑄2*，鞏元芳2，宋海峰1*

(1．軍事醫(yī)學科學院放射與輻射研究所，北京100850；2．河北科技師范學院 動物科技學院，河北 秦皇島066004)

乙肝病毒是威脅人類健康的重要病原體之一。目前，利用針對乙肝病毒和宿主分別建立的細胞模型和動物模型,廣泛應(yīng)用于乙肝病毒的基礎(chǔ)研究、新藥研發(fā)和新療法的探索。但是，這些模型仍然存在某些方面的缺陷，如感染率低、感染期短，與人存在較大的種屬差異等，最重要的是，這些模型無法完全模擬乙肝病毒自然感染人的過程及產(chǎn)生病理變化。本文對近十五年來主要乙肝病毒體內(nèi)外感染模型及其最新的研究進展進行簡要綜述，為今后建立新型乙肝病毒感染模型提供參考。

乙肝病毒；細胞模型；動物模型

1　前言

乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)會引起肝炎、肝硬化和肝癌等肝臟疾病，最終致人死亡，是嚴重威脅人類健康的病原體之一[1-4]。HBV流行區(qū)分布全球，尤其以亞洲和非洲為主。據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization, WHO)調(diào)查統(tǒng)計，全球超過20億人曾經(jīng)感染過HBV，其中大約3.6億人是慢性HBV感染者。臨床治療中，雖然對急性HBV感染患者的治療效果較佳，但是對慢性HBV感染患者仍缺乏安全而有效的治療手段，全球每年大約100萬人死于HBV感染性肝病[5,6]。

目前，在乙肝研究領(lǐng)域，研究者們根據(jù)各自的研究目的建立了相應(yīng)的乙肝體內(nèi)外模型。雖然這些模型存在各種缺陷，但是它們的應(yīng)用使人們對HBV有了更多的了解，并在研發(fā)、評價防治HBV新型藥物中起到了重要作用。本文就當前HBV感染研究中出現(xiàn)的相關(guān)體內(nèi)外模型及乙肝模型研究進展作簡要的概述，為今后更深入研究HBV相關(guān)內(nèi)容奠定基礎(chǔ)。

2　體內(nèi)外乙肝模型研究現(xiàn)狀

2.1細胞模型

HBV屬于嗜肝DNA病毒，在自然狀態(tài)容易直接感染肝細胞，于是研究者

們建立了HBV感染的原代人肝細胞(PHH)模型[7]；但是來源較少的PHH阻礙了該模型在HBV相關(guān)研究中的廣泛應(yīng)用。隨后，研究發(fā)現(xiàn)，HBV可自然感染原代樹鼩肝細胞(PTH)；這為研究HBV提供了新的模型平臺[8，9]。然而樹鼩與人之間存在的種屬差異將會制約該模型的應(yīng)用，繼續(xù)探索與人肝細胞相似表現(xiàn)的細胞模型成為必然。2010年，Lucifora J等[10]用重組桿狀病毒(Bac-HBV)作為病毒載體，體外成功轉(zhuǎn)染了獼猴肝細胞。原代肝細胞受到HBV感染后能很好地重現(xiàn)病毒感染細胞、復制、組裝和釋放等自然感染過程，但是存在培養(yǎng)難度較大，存活時間較短，不能無限增殖等缺陷，以及在培養(yǎng)過程中還會逐漸喪失一些生理功能，如代謝、膽汁分泌、免疫防御等。Tagawa Y等[11，12]在體外分別建立了鼠胚胎干細胞和人肝癌細胞系(HepG2、Huh7)體外肝組織培養(yǎng)系統(tǒng)(又稱體外肝模型，InVitroLiver Systerm，IVL)。體外肝組織培養(yǎng)系統(tǒng)可以保留體內(nèi)肝細胞所具有的某些生理功能(如鳥氨酸循環(huán)等)和代謝功能，同時延長了細胞體外存活時間。當把HBV基因?qū)朐撓到y(tǒng)細胞時，HBV基因會在肝類細胞內(nèi)復制、表達、組裝和釋放等，因此該系統(tǒng)未來可用于研究HBV的生活周期。

與上述HBV感染細胞模型相比，細胞系模型則更為理想。迄今為止，HepaRG細胞是唯一能被HBV直接感染的細胞系，但是受感染率低；在應(yīng)用時常加入二甲基亞砜(DMSO)來增加HBV對該細胞系的感染率[13-14]。在HBV相關(guān)研究中還常用到HepG2.2.15細胞系和HepAD38細胞系。這兩株細胞系均含有穩(wěn)定復制和表達的HBV基因，在培養(yǎng)過程中可產(chǎn)生高病毒滴度、較強感染力的HBV顆粒[15，16]。在用于研究HBV時兩者各有其獨特性，HepG2.2.15細胞系核內(nèi)可檢測到少量HBV cccDNA，與其相比，HepAD38細胞系則可產(chǎn)生更高病毒滴度的病毒顆粒及具有更快的細胞分化速度；兩者存在的缺陷分別是乙肝表面抗原差異性表達、需要四環(huán)素誘導啟動HBV基因表達。除上述細胞系外，2014年，Yang D等[17]從一名男性丙肝病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染患者的肝腫瘤內(nèi)分離出了肝癌細胞，然后把該癌細胞進行NOD/SCID小鼠荷瘤轉(zhuǎn)化后獲得了一株新的肝癌細胞系—HLCZ01；隨后用HBV對其進行直接感染實驗，結(jié)果顯示該細胞系被HBV感染。該細胞系今后有望成為新的細胞模型。

2012年，李文輝實驗室[18]發(fā)現(xiàn)鈉離子/?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白(Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide，NTCP)是HBV感染肝細胞的功能受體。隨后，在多次驗證這一發(fā)現(xiàn)過程中研究者們把人的NTCP基因穩(wěn)轉(zhuǎn)到HepG2、 Huh7等細胞內(nèi)，再用HBV病毒顆粒直接感染細胞，于是建立了HBV易感的HepG2-hNTCP細胞系、Huh7-hNTCP細胞系等[18-21]。這些模型可用于研究HBV的生活周期、篩選抗HBV藥物及探究影響HBV復制的宿主細胞因子等。

綜上，現(xiàn)階段應(yīng)用的HBV感染細胞模型(見表1.1)極大的促進了對HBV生活周期的研究、抗HBV相關(guān)藥物的篩選和評價及影響HBV復制的宿主細胞因子的探究等，但是仍缺乏與受感染PHH病理變化相似的細胞模型。而NTCP未來可能彌補現(xiàn)有乙肝模型缺陷，成為研究HBV感染機制、抗HBV藥物等的重要靶點。

2.2動物模型

2.2.1非人靈長類模型

黑猩猩是最早且唯一公認易被HBV感染的動物。后相繼報道，長臂猿[22]、熊猴[23]、狒狒[24]和絨毛猴[25，26]等非人靈長類也易被 HBV感染。這些易感動物可用于研究HBV的感染性、自然感染過程和發(fā)病機制及機體對病毒的免疫清除過程等，但是存在病毒感染程度輕微、動物倫理及物種瀕危性等限制性因素[16]。

為了能夠建立與HBV自然感染人相似的動物模型，研究者們從未停止過對獼猴屬的探索性研究。20世紀初，Gheit T等[27]建立了HBV DNA重組質(zhì)粒在體轉(zhuǎn)染叟猴模型；用重組質(zhì)粒點注射肝臟2天后開始在叟猴血清中檢測到乙肝表面抗原(HBsAg)、HBV DNA，且陽性結(jié)果持續(xù)3周以上。上述結(jié)果表明HBV DNA能在猴體內(nèi)正常復制，且存在較長時間。2013年，Dupinay T等[28]在毛里求斯發(fā)現(xiàn)了少量自然狀態(tài)下可感染HBV的獼猴群；該種群的發(fā)現(xiàn)為未來建立HBV感染獼猴模型提供了直接證據(jù)。不久后，冷靜等[29]用人HBV血清分別直接感染幼年和成年食蟹猴，結(jié)果部分幼年食蟹猴被感染，并表現(xiàn)出了類似人急性肝炎的肝組織學反應(yīng)。綜上，這些探索性動物模型在研究HBV感染機制及在感染過程中宿主的免疫反應(yīng)等中發(fā)揮了重要作用，但是規(guī)模極為有限，并缺乏更多的HBV感染驗證性實驗。

2.2.2樹鼩模型

樹鼩屬于屬攀鼩目(Scandentia)樹鼩科(Tupaiidae)，是繼上述靈長類后又發(fā)現(xiàn)的一種能夠易被HBV感染的動物[30]；其被HBV感染后會出現(xiàn)暫時性的病毒血癥、病毒清除過程、HBsAg血清轉(zhuǎn)化現(xiàn)象[7]，感染過程與人類相似，感染周期較短(40d左右)[30-34]，在整個感染過程中表現(xiàn)為一過性感染。近年研究表明，采用HBV感染幼年樹鼩的方法可成功建立慢性HBV感染模型。李瑗實驗室[35-37]用幼年樹鼩被動感染人HBV血清后建立了感染時間較長(可達一年以上)的樹鼩模型。在該類模型中樹鼩多為野外捕獲，感染情況與動物年齡、品種、HBV基因型等有關(guān)，而且目前缺乏針對它的特異性檢測乙肝抗體，因此該模型的可靠性、可控性、重復性以及檢測結(jié)果仍然存在較大爭議[38]。

2.2.3小鼠模型

目前應(yīng)用最多的乙肝模型動物是小鼠，但是HBV卻不能直接感染小鼠。成熟的HBV感染小鼠模型[39]，通常可分為兩類：一類是嵌合型小鼠模型，最常用的模型是接種PHH或PTH的基因(如：編碼尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)基因、編碼延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)基因、重組活化基因2(Rag2)、編碼白細胞介素2 g鏈基因(Il2rg))缺陷小鼠[40-45]。這類動物模型易被HBV感染，主要用于研究由HBV感染所引起的機體免疫應(yīng)答、病毒復制、病毒致病機理等，以及篩選、評價抗HBV藥物，但是存在著繁殖率低、死亡率高，感染HBV過程緩慢及對病毒存在一定免疫耐受性等缺陷。Bility MT等[46]在A2/NSG小鼠(HLA-A2轉(zhuǎn)基因NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ小鼠 )肝內(nèi)注射人CD34+造血干細胞(HSC)和人肝祖細胞后建立了A2/NSG-hu HSC/Hep轉(zhuǎn)基因小鼠；隨后對其用HBV進行了感染實驗，結(jié)果表明大約75%的小鼠被感染，由此使其成為一種新的乙肝模型。2015年，Strick-Marchand H等[47]在BALB/c Rag2-/-IL-2Rγc-/-NOD.sirpa uPAtg/tg(BRGS-uPA)小鼠體內(nèi)建立了人免疫系統(tǒng)與肝細胞嵌合(HIS-HUHEP)的小鼠模型，該模型可維持5個月左右。上述兩個模型可用于研究人機體對HBV的免疫應(yīng)答機理及篩選抗該類病原體的藥物、疫苗，同時也解決了機體免疫耐受問題，更貼近病毒自然感染發(fā)生過程。另一類是轉(zhuǎn)基因小鼠模型，包括轉(zhuǎn)HBV基因和轉(zhuǎn)鈉離子/牛黃膽酸共轉(zhuǎn)運多肽(Na+/taurocholate Cotransporting Polypeptide, NTCP)基因兩類，其中前者應(yīng)用最多。轉(zhuǎn)HBV基因模型大致分為HBV部分序列(主要是HBV復制基因部分)、全長序列、超長序列三種類型。該類模型在研究HBV復制、評價抗HBV藥物和疫苗方面發(fā)揮了重要的作用，但存在著HBV非自然感染和病毒RNA來自于整合的HBV基因組的缺陷，因此不能用于研究病毒早期感染、病毒感染機制，及不適于研究影響cccDNA調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄活性機制和評價針對cccDNA生成的藥物藥效作用[48-50]。

除此之外，還有一類高壓水動力法小鼠模型，即通過給小鼠靜脈注射HBV DNA、HBV cccDNA或者含HBV基因的無包膜病毒載體建立起HBV感染模型[51-56]。HBV DNA通過靜脈注射到小鼠體內(nèi)后會在肝細胞內(nèi)存在較長時間，這更有利于HBV病毒基因在體內(nèi)的復制和表達[51]。利用該技術(shù)可建立HBV急性感染模型，用于研究機體被感染后的免疫應(yīng)答及評價相關(guān)抗病毒藥物、疫苗等[52，53]。據(jù)報道，以HBV cccDNA靜脈注射裸鼠后可成功建立HBV慢性感染模型，其可用于研究人CHB的致病機制及篩選相關(guān)抗CHB藥物[55]。此外，通過高壓水動力法靜脈注射含HBV復制必需DNA序列的慢病毒質(zhì)粒也可以建立HBV持續(xù)感染的小鼠模型[56]。另一種方法是利用高壓水動力靜脈注射法給BALB/c乳鼠接種人HBV 血清建立HBV感染模型[57]。該模型主要依靠乳鼠免疫力低這一特點，在HBV 血清注入后機體不能有效清除HBV顆粒，從而造成HBV的感染；其可用于研究HBV 對機體免疫狀態(tài)的作用。2.2.4其他嗜肝DNA病毒感染模型

HBV屬于嗜肝DNA病毒科，分為正肝病毒屬和禽肝病毒屬。除易感人與非人靈長類的人HBV外，在正肝病毒屬中具有代表性且應(yīng)用最多的是土撥鼠乙型肝炎病毒(WHV)。利用WHV建立的WHV成年動物模型主要用于研究病毒急性感染時機體清除受感染細胞的過程、慢性感染和癌變機理及評價抗HBV藥物、疫苗[58，59]。另有研究發(fā)現(xiàn)，新生的土撥鼠感染W(wǎng)HV后能夠較長時間的表現(xiàn)病態(tài)，最終成為慢性感染者[60，61]；該模型可用于研究HBV自然感染過程等。然而土撥鼠模型所表現(xiàn)出的急/慢性感染癥狀與WHV的基因型和動物年齡有關(guān)，這相對限制了其普遍應(yīng)用[62]。在禽肝病毒屬中應(yīng)用較多的則是鴨乙型肝炎病毒(DHBV)。目前，主要是用DHBV感染1～3日齡雛麻鴨進行建模研究，該模型可用于抗HBV新藥評價及研究細胞表面病毒受體及病毒清除機制等[63-66]。與其他類型的模型相比，該模型的不足在于鴨與人之間存在種屬差異，HBV與DHBV之間結(jié)構(gòu)差別較大，影響建模穩(wěn)定的因素較多，如鴨種類、日齡、病毒來源、批次、感染途徑等。

此外，豬乙型肝炎病毒(SHBV)的發(fā)現(xiàn)為將來建立豬乙肝模型提供了可能。Li W等[29～30]在驗證豬嗜肝病毒的存在時豬血清乙肝標記物的檢測結(jié)果顯示HBsAg的陽性率大于24.8%，之后透射電子顯微結(jié)果顯示在血清、肝臟細胞中存在類似HBV的病毒顆粒；這些結(jié)果證實了SHBV的存在。

總之，各類動物模型(見表1，2)的應(yīng)用為HBV體內(nèi)研究提供了重要支撐。但是這些模型中只有較少的能夠表現(xiàn)出HBV的自然感染過程及在整個感染過程中機體的病理變化。

表1　HBV感染細胞模型

表2　HBV感染動物模型

3　問題與展望

綜上所述，雖然不同類型HBV感染體內(nèi)外模型的應(yīng)用極大推動了HBV生物學特性、感染過程、致病機理等的研究以及抗HBV相關(guān)藥物和疫苗的研發(fā)、評價，但是HBV對組織和種屬感染的特異性使得現(xiàn)有HBV感染模型都不能較好的呈現(xiàn)出與人類相似的HBV感染病理變化及HBV生活周期變化。不過，在不同HBV感染的幼年動物模型中幼年動物表現(xiàn)出不同程度的HBV感染，甚至慢性乙肝癥狀，而且受感染時間較長。這些模型的出現(xiàn)為今后優(yōu)化、新建立乙肝模型提供了重要參考。同時，NTCP新功能的發(fā)現(xiàn)未來可能促進HBV感染模型的發(fā)展，加快HBV相關(guān)研究的進程。

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Recent progress for HBV infection modelinvitroandinvivo

XU Gui-li1,2, GAO Xin1, LIU Zheng-zhu2*, GONG Yuan-fang2, SONG Hai-feng1*

(1. Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medicine Sciences, Beijing 100850, China;2. College of Animal Science and Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao 066004, China)

Hepatitis B virus (HBV) is an important pathogen threatening to human health. Up to date, various of cell infection models and animal models for HBV and the host are widely used in the exploring research of infection mechanism, new drug development and effective therapeutic method for HBV. However, these models have some defects, such as low infection rate, rather short infective stage, and comparatively large species differences with human, and so on. Among them, the biggest problem is that these models cannot completely simulate HBV infection process and pathological changes naturally occurred in human. Herein, the major HBV infection models developed in the past fifteen years, as well as the latest research progress, are presented as a brief review, to provide a reference for constructing novel HBV infection models in the future.

Hepatitis B virus; Cell model; Animal model

徐桂利(1986-)，男，碩士研究生，研究方向：動物分子遺傳。E-mail: 296881485@163.com。

劉錚鑄(1968-)，男，教授，研究方向：動物分子遺傳育種研究。E-mail: liuzhengzhu@163.com。

宋海峰(1972-)，男，教授，研究方向：生物技術(shù)藥物藥理學和藥動學研究。E-mail: bapklab@yahoo.com。

研究進展

R-332

A

1671-7856(2016)09-0093-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.017

2016-04-01