徐偉超,強(qiáng)蘇靜,顧劍潔,葛蓉，3,劉麗均,徐平,4* ,芮榮

(1.上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，上?！?01615；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京　210095；3.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南通 江蘇　226019；4.中科院上海實驗動物中心，上?！?01615)

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小鼠冷凍胚胎、精子常見病原菌快速檢測方法的建立

徐偉超1,2,強(qiáng)蘇靜1,顧劍潔1,葛蓉1，3,劉麗均1,徐平1,4*,芮榮2*

(1.上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，上海201615；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京210095；3.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南通 江蘇226019；4.中科院上海實驗動物中心，上海201615)

目的 建立實驗動物冷凍資源(胚胎、精子等)常見病原菌的微量、快速監(jiān)測方法。 方法 以實驗動物三個常見病原菌(金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和乙型溶血性鏈球菌)為研究對象，分別提取三個陽性菌株的DNA，通過引物設(shè)計和相應(yīng)PCR條件的優(yōu)化，建立三種陽性菌株的PCR檢測方法。然后提取冷凍資源(胚胎、精子等)中的DNA，按照三個陽性菌的PCR條件進(jìn)行檢測，并將一部分樣品DNA用熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測。結(jié)果①成功建立三個陽性菌株的PCR檢測方法。三種病原菌的最低檢測濃度，金黃色葡萄球菌為4.19×10-5ng/μL，肺炎克雷伯氏菌為1.98×10-5ng/μL，乙型溶血性鏈球菌為1.07×10-3ng/μL.②通過普通PCR和熒光定量PCR方法均未檢測出樣品中三種陽性菌的存在。結(jié)論建立了小鼠冷凍胚胎、精子常見病原菌微量、快速檢測方法。

金黃色葡萄球菌；肺炎克雷伯氏菌；乙型溶血性鏈球菌；PCR檢測

金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和乙型溶血性鏈球菌廣泛存在于自然環(huán)境中，是人和動物常見的條件性致病菌[1]。在某些應(yīng)激情況下會引起實驗動物的健康問題或者影響動物實驗的結(jié)果。

目前，實驗動物病原菌的檢測主要是依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定方法，該方法容易得出明確的結(jié)論[2-4]。但是需要一定的樣本量，且耗時、特異性低，需要檢測人員對病原微生物的菌落形態(tài)、理化反應(yīng)性質(zhì)等有準(zhǔn)確的判斷，才能得出正確的結(jié)論[5]。與這些傳統(tǒng)的形態(tài)分析方法相比，病原微生物的基因型比形態(tài)特征更具特異性和精確性，且敏感度高、快速、簡便、樣本量少，它不僅能檢測出活的病原微生物，而且也能檢測出死亡的和難以培養(yǎng)的病原微生物[6]。本研究擬建立一種微量、快速的PCR檢測方法，以用于實驗動物冷凍資源的質(zhì)量控制。

1　材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株

金黃色葡萄球菌(CMCC26003)，肺炎克雷伯氏菌(CMCC46117)和乙型溶血性鏈球菌(CMCC32210)，均來自于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。

1.1.2細(xì)菌培養(yǎng)基

常規(guī)營養(yǎng)肉湯和血瓊脂平板。

1.1.3樣品

隨機(jī)采集保存于實驗室液氮庫中的胚胎、精子、卵子,冷凍復(fù)蘇胚胎所需的各種抗冷凍液、培養(yǎng)液、復(fù)蘇液和液氮等，每個樣品有3個重復(fù)。

1.2主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；GoTaq? Colorless Master Mix 購自普洛麥格(promega)公司；MarkerDL2000和5xGelRed瓊脂糖電泳加樣緩沖液(含核酸染料)購自上海捷瑞生物工程有限公司；引物(正向引物，反向引物)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；熒光定量PCR探針由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

英國Techne T-512型PCR儀、ABI7500 熒光定量PCR儀、Bio-red 泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、超凈工作臺、高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、移液槍及其它輔助設(shè)備。

1.3實驗方法

1.3.1陽性菌株凍干粉的復(fù)蘇保存

金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌均按照標(biāo)準(zhǔn)菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作程序復(fù)蘇并保存。

1.3.2陽性菌株DNA 抽提

按照賽百盛試劑盒說明的方法進(jìn)行抽提。

1.3.3陽性菌株P(guān)CR檢測

通過查閱文獻(xiàn)與touch down PCR篩選，得出了檢測三種病原菌的可用引物序列與PCR條件，引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)體系均為20 μL：2×promega mix colorless10 μL，上下游引物各0.2 μL，DNA模板2 μL，并補(bǔ)足超凈水。反應(yīng)程序相同： 95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃復(fù)性2 min，72℃延伸1 min，循環(huán)40次，最后72℃延伸10 min。

1.3.4陽性菌株P(guān)CR產(chǎn)物測序

三個陽性菌株進(jìn)行引物篩選和PCR條件的優(yōu)化之后，為鑒定引物和條件的可行性，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序并且在測序后進(jìn)行比對。

1.3.5陽性菌PCR靈敏度檢測

將陽性DNA進(jìn)行稀釋，得出PCR檢測的最少檢出量，來確定PCR反應(yīng)的靈敏度，且通過前期預(yù)實驗，只選取部分條帶比較清晰、測序結(jié)果較好的引物進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.6人工污染實驗

將陽性菌株復(fù)蘇后接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，過夜振蕩培養(yǎng)，然后用蒸餾水倍比稀釋，稀釋后接種血平板的同時提取DNA，過夜培養(yǎng)后觀察平板并計數(shù)，以陽性菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得出DNA提取和PCR方法的菌液最低檢測濃度。

1.3.7樣品的檢測

1.3.7.1樣品中細(xì)菌DNA提取

按照上述陽性菌提取方法提取液氮中冷凍資源(精子、卵子和胚胎)、冷凍復(fù)蘇過程中所需要用的培養(yǎng)液和液氮中的DNA。

1.3.7.2樣品中細(xì)菌普通PCR檢測

按照陽性菌的PCR條件和體系對提取的15個樣品DNA進(jìn)行普通PCR檢測。

表1　三種病原菌引物序列

表2　三種病原菌的熒光探針信息

1.3.7.3樣品中細(xì)菌熒光定量PCR檢測

針對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和乙型溶血性鏈球菌的保守序列設(shè)計熒光探針，探針設(shè)計好后以陽性菌株為模板進(jìn)行三個菌株的多重?zé)晒舛縋CR檢測(表2)。反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板8 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸34 s，循環(huán)40次，同時采集熔解曲線。

2　結(jié)果

2.1陽性菌株P(guān)CR檢測結(jié)果

2.1.1金黃色葡萄球菌

通過對金黃色葡萄球菌相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，共尋找到15對引物，用touch down PCR 進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)其中有7對引物用陽性菌株DNA為模板可以擴(kuò)增出目的條帶，并對7對引物進(jìn)行條件優(yōu)化可以得出較亮的目的條帶，產(chǎn)物大小分別為122 bp、132 bp、270 bp、94 bp、127 bp、168 bp、484 bp(圖2A)。

2.1.2肺炎克雷伯氏菌

注：(A～G)金黃色葡萄球菌7對引物PCR產(chǎn)物BLAST結(jié)果;(H,I)肺炎克雷伯氏菌2對引物PCR產(chǎn)物BLAST結(jié)果;(J～N)乙型溶血性鏈球菌5對引物PCR產(chǎn)物BLAST結(jié)果。圖1　細(xì)菌PCR產(chǎn)物BLAST結(jié)果Note.(A～G)The PCR products BLAST results of 7 pairs of primers of Staphylococcus auerus;(H,I)The PCR products BLAST results of 2 pairs of primers of Klebsiella pneumoniae;(J～N)The PCR products BLAST results of 5 pairs of primers of β-hemolytic streptococcus.Fig.1　The BLAST results of the PCR products of the bacteria

通過對肺炎克雷伯氏菌相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，共尋找到14對引物，用touch down PCR 進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)其中有3對引物用陽性菌株DNA為模板可以擴(kuò)增出目的條帶，并對3對引物進(jìn)行條件優(yōu)化，其中2對條帶非常亮，還有1對優(yōu)化后條帶依然較弱(圖2B)，產(chǎn)物大小為368bp、423bp、108bp，后續(xù)實驗只挑選了368bp的引物進(jìn)行實驗。

2.1.3乙型溶血性鏈球菌

通過對乙型溶血性鏈球菌相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，共尋找到11對引物，用touch down PCR 進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)其中有6對引物用陽性菌株DNA為模板可以擴(kuò)增出目的條帶(圖2C)，并對6對引物進(jìn)行條件優(yōu)化可以得出較亮的目的條帶，產(chǎn)物大小分別為71bp、255bp、346bp、170bp、423bp、307bp。

2.2陽性菌株P(guān)CR產(chǎn)物測序

三個病原菌產(chǎn)物測序和比對結(jié)果(圖1A～1N)金黃色葡萄球菌的DNA序列BLAST比對后與文獻(xiàn)報道的金黃色葡萄球菌靶基因序列的同源性>98%；肺炎克雷伯氏菌的同源性>99%；乙型溶血性鏈球菌的同源性>95%。從而證實PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.3陽性菌PCR靈敏度檢測結(jié)果(圖2D～圖2F)

金黃色葡萄球菌(3號引物和6號引物)、肺炎克雷伯氏菌(2號引物)和乙型溶血性鏈球菌(3號引物和5號引物)的最低檢測DNA濃度分別為4.19×10-5ng/μL、1.98×10-5ng/μL和1.07×10-3ng/μL。

2.4人工污染實驗結(jié)果

以陽性菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，金黃色葡萄球菌的菌液檢出濃度為4×105cfu/mL(圖2G)、肺炎克雷伯氏菌的檢出濃度為2.2×106cfu/mL(圖2H)、乙型溶血性鏈球菌的檢出濃度為6×102cfu/mL(圖2I)。

注：(A)金黃色葡萄球菌7對引物的擴(kuò)增條帶;(B) 肺炎克雷伯氏菌3對引物的擴(kuò)增條帶;(C) 乙型溶血性鏈球菌產(chǎn)物6對引物的擴(kuò)增條帶;(D) 金黃色葡萄球菌3號和6號引物結(jié)果;(E) 肺炎克雷伯氏菌2號引物結(jié)果;(F) 乙型溶血性鏈球菌3號和5號引物結(jié)果;(G) 金黃色葡萄球菌陽性菌液檢出濃度;(H) 肺炎克雷伯氏菌陽性菌液檢出濃度;(I) 乙型溶血性鏈球菌陽性菌液檢出濃度。圖2　細(xì)菌DNA的PCR檢測結(jié)果Note.(A) The amplification bands of 7 pairs of primers of Staphylococcus auerus;(B) The amplification bands of 3 pairs of primers of Klebsiella pneumoniae;(C) The amplification bands of 6 pairs of primers of β-hemolytic streptococcus;(D) The results of primer 3 and primer 6 of Staphylococcus auerus;(E) The results of primer 2 of Klebsiella pneumoniae;(F) The results of primer 3 and primer 5 of β-hemolytic streptococcus;(G) The detectable concentration of Staphylococcus auerus positive bateria liquid;(H) The detectable concentration of Klebsiella pneumoniae positive bateria liquid;(I) The detectable concentration of β-hemolytic streptococcus positive bacteria liquid.Fig.2　The PCR detection results of the DNA of the bacteria

2.5樣品的檢測

2.5.1樣品中細(xì)菌普通PCR檢測

按照陽性菌的PCR條件對提取的15個樣品DNA進(jìn)行普通PCR檢測。圖3A～3E顯示，本實驗中的15個樣品DNA中均不含有金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和乙型溶血性鏈球菌。

2.5.2樣品中細(xì)菌熒光定量PCR檢測

2.5.2.1陽性菌株的多重PCR

以陽性菌株為模板，用設(shè)計好的探針進(jìn)行三個菌株的多重?zé)晒舛縋CR檢測，檢測結(jié)果如圖4A，得出設(shè)計的三個熒光探針是正確可用的。

2.5.2.2樣品的熒光定量PCR檢測

由熒光定量PCR結(jié)果(圖4B～4D)得出15個樣品未被三個目標(biāo)菌株污染，15個樣品的三個菌的曲線和陰性對照的曲線一致，未發(fā)生陽性擴(kuò)增。

注：(A,B)樣品中金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果(3、6引物)；(C)樣品中肺炎克雷伯氏菌檢測結(jié)果(2號引物)；(D,E)樣品中乙型溶血性鏈球菌檢測結(jié)果(3、5號引物)。1-15號都未檢測出陽性條帶，其中1號冷凍精子、2號冷凍卵子、3號冷凍胚胎、4號HTF、 5號KSOM、 6號DAP、 7號DMSO、 8號EFS20、 9號EFS40、 10號0.25蔗糖、 11號0.75蔗糖、 12號液氮、 13號M2、 14號M16、 15號R18S3。圖3　樣品中細(xì)菌PCR檢測結(jié)果Note.(A,B) Detection results of Staphylococcus auerus in the sample(primer 3 and primer 6)；(C) Detection results of Klebsiella pneumoniae in the sample(primer 2)；(D,E) Detection results of β-hemolytic streptococcus in the sample(primer 3 and primer 5).The positive bands were not examined in sample NO.1 to sample NO.15. Sample name: NO.1 frozen sperm, NO.2 frozen oocyte, NO.3 frozen embryo, NO.4 HTF, NO.5 KSOM, NO.6 DAP, NO.7 DMSO, NO.8 EFS20, NO.9 EFS40, NO.10 0.25 sucrose, NO.11 0.75 sucrose, NO.12 liquid nitrogen, NO.13 M2, NO.14 M16, NO.15 R18S3.Fig.3　The PCR detection results of the bacteria in the samples

注：(A) 金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和乙型溶血性鏈球菌Taqman qPCR三重擴(kuò)增曲線(按CT值的大小從小到大排列，圖中的曲線分別是肺炎克雷伯菌，金黃色葡萄球菌，乙型溶血鏈球菌)；(B)樣品中金黃色葡萄球菌熒光定量PCR檢測結(jié)果；(C)樣品中肺炎克氏菌熒光定量PCR檢測結(jié)果；(D)樣品中乙型溶血性鏈球菌熒光定量PCR檢測結(jié)果。圖4　細(xì)菌熒光定量PCR檢測結(jié)果Note.(A) Taqman qPCR triple amplification curve of Staphylococcus aueru, Klebsiella pneumoniae and β-hemolytic streptococcus(The CT value increase as follows: Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aueru and β-hemolytic streptococcus)；(B)Realtime pcr detection result of Staphylococcus auerus in the sample；(C)Realtime pcr detection result of Klebsiella pneumoniae in the sample；(D)Realtime pcr detection result of β-hemolytic streptococcus in the sample.Fig.4　Realtime PCR detection results of the bacteria

3　討論

低溫冷凍技術(shù)可以實現(xiàn)實驗動物資源的長期保存, 既安全又能節(jié)省人力和物力[7]。但活體動物若帶有病原微生物，將對生殖細(xì)胞的品質(zhì)、保存及受胎效果等產(chǎn)生影響, 并且可能導(dǎo)致最后獲得的實驗動物中也帶這些病原微生物，最終影響實驗動物質(zhì)量[8]。目前的冷凍操作都不是無菌操作技術(shù)[9]，因此，在冷凍、儲存、復(fù)蘇或者實驗室間的交換等過程中，都有可能被病原微生物污染，所以定期進(jìn)行冷凍資源的微生物檢測是有必要的。

PCR技術(shù)由于具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，快速準(zhǔn)確，自動化程度高等特點，已被廣泛應(yīng)用，應(yīng)用PCR技術(shù)，只需數(shù)小時，就可用電泳法檢測出0.1 mg DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列，用PCR擴(kuò)增細(xì)菌中保守的rDNA片段，還可對那些人工無法培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測[10]。同時，實時熒光 PCR技術(shù)有效解決了傳統(tǒng) PCR中只能終點檢測的局限，并且在封閉的條件下進(jìn)行反應(yīng)和分析，無需電泳等 PCR后處理操作，能有效預(yù)防PCR產(chǎn)物之間的相互污染[11]。并且由于其操作簡便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、假陽性低、可定量檢測、誤差小、穩(wěn)定性好等特點已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品中微生物的檢測[12]。

本研究目的在于通過對實驗動物的三個常見病原菌(金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型溶血性鏈球菌)特異性引物的篩選，陽性菌PCR產(chǎn)物的測序及靈敏度檢測等，擬建立實驗動物冷凍資源(生殖細(xì)胞、胚胎、生殖器官)的微生物質(zhì)量控制快速檢測方法。實驗表明，在所選的引物中，金黃色葡萄球菌有7對(7/15)、肺炎克雷伯菌3對(3/14)、乙型溶血性鏈球菌6對(6/11)引物可以擴(kuò)增出目的條帶。測序結(jié)果表明，其PCR產(chǎn)物的DNA序列與各自的靶基因的同源性均達(dá)到95%以上。靈敏度試驗顯示，三種病原菌的最低檢測濃度，金黃色葡萄球菌為4.19×10-5ng/μL、肺炎克雷伯氏菌為1.98×10-5ng/μL、乙型溶血性鏈球菌為1.07×10-3ng/μL。本實驗中，對冷凍庫內(nèi)的部分冷凍資源進(jìn)行抽樣檢測，從對樣品的處理到檢測結(jié)束大約需要6 h的時間，大大縮短了傳統(tǒng)的國標(biāo)法檢測時間，更加符合快速檢測的要求。檢測結(jié)果顯示本實驗室冷凍保存的小鼠胚胎、精子等均沒有檢測到三種目的病原菌。也有可能由于存在于冷凍資源中的細(xì)菌量很少，提出的DNA量不足以通過PCR方法檢測出來，因此計劃將冷凍資源進(jìn)行復(fù)蘇、移植至SPF級受體母鼠，待出生后的小鼠長至斷奶，對活體進(jìn)行微生物學(xué)檢測，以驗證其是否攜帶這三種病原菌。

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Establishing a rapid monitoring method of common pathogens of frozen embryo and sperm in mice

XU Wei-chao1,2，QIANG Su-jing1, GU Jian-jie1, GE Rong1,3,LIU Li-jun1， XU Ping1,4*, RUI Rong2*

(1.Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.Ltd, Shanghai 201615, China;2. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agriculture University, Nanjing 210095, China;3.College of Life Science，Nantong University, Nantong 226019, China;4. Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS, Shanghai 201615, China)

Objective To establish a rapid monitoring method of the three common bacteria in mice frozen resources, such as embryo, sperm, etc. Methods To extract DNA of the three positive bacteria(Staphylococcus auerus, Klebsiella-pneumoniae and β-hemolyticstreptococcus), and establish PCR monitoring method of the three positive strains through designing primer and refining PCR condition. Then extract total DNA of the frozen resources, detect the DNA according to the PCR condition of the three positive bacteria, some samples were detect by fluorescence quantitative PCR at the same time. Results①successfully establish a PCR detection method of the three positive bacteria, the minimum detectable concentration of Staphylococcus auerus, Klebsiella pneumoniae and β-hemolytic streptococcus is 4.19×10-5ng/μL, 1.98×10-5ng/μL and 1.07×10-3ng/μL.②Proved that the three bacteria doesn’t exist in the sample by normal PCR and fluorescence quantitative PCR methods. ConclusionsEstablising a rapid monitoring method of common pathogens of frozen embryo and sperm in mice.

Staphylococcus auerus; Klebsiella pneumoniae; β-hemolytic streptococcus; PCR detection

國家科技支撐計劃項目(2013BAK11B02)；上海市科委實驗動物專項基金(14140900500)。

徐偉超(1991-)，男，碩士生，研究方向：動物生殖工程和低溫生物學(xué)。E-mail: 932716206@qq.com。

徐平(1964-)，男，研究員，研究方向：實驗動物低溫生物學(xué)和實驗動物遺傳性疾病模型。E-mail： pingxu@sibs.ac.cn；

芮榮(1962-)，男，教授，研究方向：動物生殖調(diào)控與產(chǎn)科疾病。E-mail： rrui@njau.edu.cn。

技術(shù)方法

R-332

A

1671-7856(2016)09-0069-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.013

2016-04-06