祝娟娟　程明亮

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·論著·

IL-22在藍莓益生菌血清干預(yù)肝細胞脂肪變性實驗中的表達

祝娟娟程明亮

目的探討藍莓益生菌血清通過對IL-22表達的影響改善非酒精性脂肪肝的作用機制。方法血清藥理學(xué)方法制備大鼠10%藍莓益生菌低、中、高劑量血清。建立游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)的正常肝細胞株L-02細胞脂肪變性模型，設(shè)立正常組、模型組、藍莓益生菌低、中、高劑量血清組。油紅O染色檢測細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積；定量檢測細胞內(nèi)三酰甘油(TG)含量；RT-PCR檢測各組IL-22 基因表達；Western blot及免疫熒光法檢測各組IL-22蛋白表達。結(jié)果FFA誘導(dǎo)刺激24 h后，模型組細胞內(nèi)可見大量脂質(zhì)沉積，且TG含量明顯高于正常組(P=0.000)，IL-22的基因及蛋白表達均較正常組明顯減弱(P=0.000)；與模型組相比，藍莓益生菌低、中、高劑量血清組的TG逐漸降低(P=0.000)，細胞內(nèi)的脂肪沉積逐漸減輕；高劑量血清組IL-22的基因和蛋白表達較模型組、低劑量血清組、中劑量血清組顯著增強(P=0.000)，但藍莓益生菌低、中劑量血清組之間IL-22的基因表達和蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論藍莓益生菌血清能上調(diào)IL-22的表達，參與改善非酒精性脂肪肝的作用機制。

藍莓益生菌血清；肝細胞；脂肪變性；白介素-22

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為全世界最常見的肝臟疾病之一[1-2]，且呈上升趨勢。該病包括單純性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化等[3]。據(jù)統(tǒng)計，10%～20%的NAFLD患者伴有不同程度的肝細胞炎性反應(yīng)[4]。IL-22是IL-10家族成員中的一員，與IL-10在結(jié)構(gòu)上存在明確的相關(guān)性[5]，是重要的護肝因子，在多種肝臟疾病中呈現(xiàn)保護作用[6-7]。IL-22可通過激活JAK1/STAT3信號通路，下調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白達到治療酒精性脂肪性肝病的目的[8]。目前，臨床尚缺乏治療NAFLD的特效藥物[9]，益生菌作為腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑能有效減輕內(nèi)毒素血癥，改善腸道屏障功能，在NAFLD的治療中能起到一定治療作用[10-11]。中醫(yī)認(rèn)為，“上工治未病”，因此通過飲食調(diào)節(jié)是治療NAFLD的重要手段。藍莓營養(yǎng)成分豐富，富含花青素及多種多酚類物質(zhì)，具有很好的抗氧化性、抗炎性反應(yīng)、增強機體免疫力作用。研究顯示，藍莓具有良好的護肝作用，逆轉(zhuǎn)肝纖維化[12]，并且聯(lián)合益生菌后能有效減輕肝臟炎性反應(yīng)，改善肝細胞脂肪變性[13]。本實驗擬采用混合游離脂肪酸體外誘導(dǎo)正常人肝細胞L-02脂肪變性，并通過藍莓益生菌對IL-22表達的影響來探討二者參與拮抗NAFLD的作用機制。

資料和方法

一、細胞株和實驗動物

正常人肝細胞株L-02購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所細胞庫。Wistar大鼠，雄性，清潔級，體質(zhì)量(180±20)g(購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，合格證號：SCXK-(黔)2012-0001)，分籠普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食，用于制備藍莓益生菌血清。

二、藍莓、益生菌

選用貴州麻江兔眼園蘭藍莓，-20℃凍存，臨用時解凍提取原漿，其成分含量包括花青素、微量元素、類黃酮、維生素等[14]；益生菌干片(嬰兒雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、乳桿菌：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)。

三、主要試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco,批號：C11995500B)，胎牛血清(美國Gibco, 批號：10099141)，青鏈霉素(美國Gibco, 批號：15140122)，0.25%含EDTA 胰蛋白酶(美國Gibco, 批號：25200-056)，油酸(美國Sigma,批號：SLBM2519V)；棕櫚酸(美國Sigma,批號：SLBM2077V)，TG試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號：F001-1)；anti-IL22RA (英國Abcam,批號：ab5984)；β-actin (美國Immuno Way,批號：YT0099)；DAPI(中國solarbio,批號：D8200)；標(biāo)記FITC熒光羊抗兔IgG(北京中杉金橋,批號：121704)；細胞活性檢測試劑(cell counting kit CCK8 日本同仁化學(xué)研究所,批號：SC-45063)；β-actin(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,批號：B661102)、IL-22引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,批號：10441578)；Maxima SYBR Green/ROX qPCR預(yù)混液(美國Thermo Scientific,批號：00330632)；ViiA7 Real-time PCR System(美國；Applied Biosystems)；EPS-601電泳儀(美國；Amersham)；SynergyH4多功能酶標(biāo)儀(美國；biotek)；顯微鏡圖像采集系統(tǒng)Olympus BX41(日本；OLYMPUS)；激光掃描共聚焦顯微鏡(德國；Leica公司)。

四、藍莓益生菌原液制備

益生菌干片磨至粉末狀后加入藍莓原漿中混勻，使益生菌含量達108CFU/mL[15]。

五、藍莓益生菌血清制備

Wistar大鼠隨機分成4組：0.9%氯化鈉溶液對照組、藍莓益生菌低劑量組(0.25 mL/100 g)、藍莓益生菌中劑量組(0.5 mL/100 g)、藍莓益生菌高劑量組(1 mL/100 g)[16]。分別灌胃5 d，2次/d，于末次灌胃后2 h再重復(fù)灌胃1次，第2次灌胃1 h后股動脈取血。3000 r/min離心20 min，混勻同組大鼠血清，50℃水浴30 min滅活補體，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

六、細胞培養(yǎng)與傳代

正常人肝細胞株L-02用培養(yǎng)液(90%DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%青鏈霉素+1%非必需氨基酸)37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長，24 h更換培養(yǎng)液，80%～90%細胞融合度時，用0.25%含EDTA胰蛋白酶收集細胞并傳代。

七、肝細胞脂肪變性模型建立

L-02細胞用含1 mmol/L的混合游離脂肪酸[(油酸(oleic acid，OA)：軟脂酸(palmitic acid，PA)=2∶1)]誘導(dǎo)L-02細胞脂肪變性[17]。

八、實驗分組

將細胞分為正常組、模型組、藍莓益生菌低、中、高劑量血清組。將L-02細胞以1×105個/mL細胞密度接種于六孔板中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基。正常組與模型組加入含0.9%氯化鈉溶液血清培養(yǎng)基，藍莓益生菌低、中、高劑量血清組分別添加含10%相對應(yīng)血清的培養(yǎng)基。各組細胞提前24 h采用相應(yīng)血清進行干預(yù)，然后除正常組外，各組添加1 mmol/L的混合脂肪酸培養(yǎng)24 h。

九、CCK8檢測細胞存活率

將L-02細胞100 μL以1×105個/mL細胞密度接種在96孔培養(yǎng)板中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，每組設(shè)6個平行孔，按上述方法分組處理72 h，每孔加入10 μL CCK8于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 nm讀取吸光度。以對照組細胞增殖活力為100%，其他各組細胞增殖活力=處理組(450)/空白組(450)×100%。

十、油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴變化

將細胞接種于六孔板內(nèi)，同時放入玻片，制作細胞爬片，分組處理細胞72 h，PBS輕洗細胞爬片3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS輕洗3次，加油紅O染液避光染色30 min，60%異丙醇洗去多余染液，蘇木素染核10 s，蒸餾水輕洗3次，甘油明膠封片。顯微鏡下觀察細胞內(nèi)脂滴情況。

十一、細胞內(nèi)TG水平測定

胰蛋白酶消化細胞，1000 r/min，離心5 min收集細胞，經(jīng)反復(fù)凍融，充分裂解細胞，3000 r/min，離心10 min，取上清液，采用TG試劑盒檢測TG，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白含量，結(jié)果表示為每克細胞總蛋白含量中所含的TG量。

十二、免疫熒光法檢測IL-22表達

以1×105個/mL細胞密度接種于六孔板中，放入玻片，制作細胞爬片，分組處理細胞72 h，PBS輕洗細胞爬片，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100室溫通透，3% H2O2孵育30 min，1%BSA室溫封閉，滴加濃度為1∶100的一抗1 mL，4 ℃孵育過夜，次日予冷PBST輕洗后滴加濃度為1∶100標(biāo)記FITC二抗1 mL，避光孵育2 h，冷PBST輕洗后加入0.5 μg/mL DAPI避光孵育，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并采圖。

十三、RT-PCR檢測IL-22基因表達

以1×105個/mL細胞密度接種于六孔板中，按上述方法進行分組處理72 h后，棄培養(yǎng)液，PBS輕洗2次，每孔加入500 μL Trizol提取總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按試劑盒說明書操作。所用引物按參考文獻設(shè)計并在GenBank 進行核對。β-actin 引物：正義鏈，5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′；反義鏈，5′-GGGCCGGACTCGTCATAC -3′。IL-22引物：正義鏈，5′-GCTTGACAAGTCCAACTT-CCA-3′；反義鏈，5′-GCTCACTCATACTGACT-CCGT-3′。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×Es Taq MasterMix 25 μL、正向引物2 μL、反向引物2 μL、模板DNA 2 μL、去核糖核酸酶水19 μL 。反應(yīng)條件：預(yù)變性，94 ℃、2 min；變性，94 ℃、30 s；退火，55 ℃、30 s；延伸，72 ℃、30 s，變性、退火、延伸經(jīng)35個循環(huán)；終延伸，72 ℃、2 min 。qRT-PCR 反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR Green 10 μL、ddH2O 6 μL、引物混合物2 μL、模板cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：第1階段，50 ℃、2 min；第2階段，95 ℃、10 min；第3 階段，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40個循環(huán)。結(jié)果判定：通過β-actin作為內(nèi)參照，瓊脂糖電泳檢測擴增片段；同時比較目的基因與內(nèi)參基因的ct值差異，從而對上述基因在各組中的表達進行相對定量。

十四、Western印跡測定IL-22的蛋白表達

細胞按前述分組方法接種于六孔板中，培養(yǎng)72 h后收集細胞，每孔加入RIPA:PMSF(1：99)150 μL裂解液，抗原蛋白提取后進行蛋白含量測定，取蛋白質(zhì)樣品30 μg，計算蛋白上樣量，8%SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、用IL-22抗體(1∶1000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶20 000)避光孵育2 h，ECL曝光顯影，Gel Doc EQ凝膠成像儀掃描，ImageJ軟件分析結(jié)果。

十五、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)　　果

一、L-02細胞脂肪變性模型建立

正常組細胞可見細胞形態(tài)正常，胞質(zhì)中無脂滴沉積；用含1 mmol/L的混合游離脂肪酸(OA∶PA=2∶1)誘導(dǎo)L-02細胞脂肪變性24 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察到模型組L-02細胞形狀不規(guī)則或成橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)可見大量紅色脂滴，經(jīng)不同劑量的藍莓益生菌血清干預(yù)后，胞質(zhì)內(nèi)的脂滴較模型組明顯減少，且在藍莓益生菌高劑量血清組中減少更為顯著，但低、中劑量血清組間相比脂滴減少無顯著差異，見圖1。

二、CCK8檢測各組L-02細胞增殖活力

設(shè)定正常對照組細胞增殖活力為100%，模型組細胞增殖活力為96.4%，藍莓益生菌低劑量血清組細胞增殖活力為92.5%，藍莓益生菌中劑量血清組細胞增殖活力為91.3%，藍莓益生菌高劑量血清組細胞增殖活力為93.2%。與正常組相比，模型組、藍莓益生菌低、中、高劑量血清組細胞增殖活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1　各組L-02細胞光鏡下形態(tài)(油紅O染色，×200)

三、不同劑量藍莓益生菌血清對FFA誘導(dǎo)L-02細胞脂肪變性后細胞內(nèi)TG含量影響

與正常組比較，模型組的TG含量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，藍莓益生菌低、中、高劑量血清組的TG含量較模型組明顯降低(P<0.01)；與低、中劑量組比較，高劑量血清組TG明顯下降(P<0.01)，見圖2。

四、激光共聚焦觀察各組細胞IL-22表達

正常組細胞輪廓清晰，模型組細胞輪廓消失，胞內(nèi)綠色熒光強度較正常組明顯減弱，經(jīng)不同劑量藍莓益生菌血清干預(yù)后，細胞內(nèi)的綠色熒光強度較模型組明顯增強，其中藍莓益生菌高劑量血清組的綠色熒光強度較低、中劑量組增強明顯，見圖3。

圖2　各組L-02細胞TG含量檢測

圖3　各組L-02細胞免疫熒光觀察IL-22表達(×40)

五、RT-PCR檢測IL22基因表達

(一)瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物與正常組比較，模型組IL-22表達較明顯減少，藍莓益生菌低、中、高劑量血清組IL-22表達較模型組增加，且高劑量血清組增加更為顯著，見圖4。

注：1. 正常組；2. 模型組；3. 藍莓益生菌低劑量組；4. 藍莓益生菌中劑量組；5. 藍莓益生菌高劑量組

圖4各組L-02細胞cDNA擴增產(chǎn)物

(二)qRT-PCR檢測IL-22 mRNA表達與正常組相比，模型組IL-22 mRNA表達量明顯降低(P=0.000),與模型組比較，藍莓益生菌低、中、高劑量血清組IL-22mRNA表達較模型組增加(P=0.000)，且高劑量血清組增加更為顯著(P=0.000)，但低、中劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.382)，見圖5。

圖5　各組L-02細胞IL-22 mRNA表達

六、Western印跡檢測IL-22蛋白表達

與正常組相比，模型組IL-22蛋白表達量明顯降低(P=0.000),與模型組比較，藍莓益生菌低、中、高劑量血清組表達較模型組增加(P=0.000)，且高劑量血清組增加更為顯著(P=0.000)，見圖6，圖7。

注：1. 正常組；2. 模型組；3. 藍莓益生菌低劑量血清組；4. 藍莓益生菌中劑量血清組；5. 藍莓益生菌高劑量血清組

圖6各組IL-22蛋白表達

圖7　各組IL-22蛋白相對表達量

討　　論

近年來免疫炎性反應(yīng)對NAFLD的影響逐漸受到重視，肝內(nèi)多種具有免疫功能的細胞(如KC、NK)受到細菌、病毒、藥物或其他一些代謝產(chǎn)物(如LPS)刺激后，可通過LPS/TLR4信號通路下游的銜接分子MyD88誘導(dǎo)促炎因子(如IL-21、CXCL-10)和抗炎因子(如IL-10)的產(chǎn)生[18]。促炎因子激活相關(guān)信號通路上調(diào)膽固醇調(diào)節(jié)元件蛋白-1c等具有脂肪合成功能的基因表達，導(dǎo)致肝細胞內(nèi)的TG和膽固醇聚集，而發(fā)生NAFLD。IL-22是抗炎因子IL-10家族成員中的一員，與IL-10在結(jié)構(gòu)上存在明確的相關(guān)性[19]，可由多種細胞分泌(如NK細胞、Th17、Th22等)，在控制細菌感染、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境和組織修復(fù)中起到重要作用[20]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，IL-22在多種肝臟疾病中起到保護作用，是重要的護肝因子，主要通過其受體IL-22RA1發(fā)揮生物作用[7，21]。Yang等[22]的研究顯示，IL-22可通過激活STAT3通路下調(diào)TG合成的相關(guān)基因改善因肥胖所致的脂肪肝。Xiao等[23]通過IL-22治療乙醇誘導(dǎo)的肝損傷的研究發(fā)現(xiàn)，IL-22可通過其受體IL-22RA1激活JAK1/STAT3信號通路，下調(diào)FATP表達，達到改善肝細胞脂肪變性的作用。綜上，IL-22對多種肝臟疾病有保護作用，由IL-22參與拮抗NAFLD，其作用機制可能是通過調(diào)控JAK1/STAT3信號通路而實現(xiàn)。

目前臨床上尚無針對NAFLD的特效藥物，益生菌作為腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑可用于NALFD的治療，以改善腸道微生態(tài)環(huán)境，減輕內(nèi)毒素血癥，從而減輕肝細胞炎性反應(yīng)，達到治療非酒精性脂肪性肝病的目的[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，藍莓富含花青素、類黃酮及多酚類等物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等功效[24-25]，且藍莓中的花青素能激活免疫系統(tǒng)，使免疫球蛋白不受自由基的侵害，激活巨噬細胞，增強人體的免疫力。藍莓對急性酒精性脂肪肝有保護作用[26]，其機制可能是藍莓能有效抑制TNF-α，下調(diào)SREBP-1c的表達，合理改善脂代謝，減少脂質(zhì)沉積于肝臟。研究發(fā)現(xiàn)，藍莓對肝星狀細胞活性也有抑制作用，能有效減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，達到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的功效[12]。陸爽等[16]通過應(yīng)用高劑量的藍莓血清能有效促進HSC-T6細胞凋亡，改善肝纖維化。藍莓對益生菌的生長有促進作用，同時，益生菌能增強藍莓的生物活性，二者有協(xié)調(diào)作用[27]。將藍莓與益生菌聯(lián)合，可減輕炎性因子對肝細胞損傷，同時能調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減少肝細胞脂肪變[13,28]。

研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的藍莓益生菌血清能顯著改善混合游離脂肪酸(油酸：軟脂酸)處理的肝細胞脂肪變性程度。油紅染色后可見模型組胞質(zhì)內(nèi)有大量紅色脂滴，而藍莓益生菌低、中、高劑量組胞質(zhì)內(nèi)的脂滴較模型組明顯減少，其中高劑量組的脂滴減少更為顯著，TG檢測后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同劑量藍莓益生菌血清干預(yù)后TG較模型組降低，而高劑量血清組的TG降低最為顯著，結(jié)合CCK8發(fā)現(xiàn)，不同劑量的藍莓益生菌血清干預(yù)后與模型組相比，L-02細胞活性無明顯變化，表明所使用濃度范圍的血清對L-02細胞活性無影響，排除了各組TG差異是由細胞數(shù)量不同所致的可能性。通過不同的方法對IL-22進行檢測發(fā)現(xiàn)藍莓益生菌高劑量血清組的IL-22表達均明顯高于模型組、藍莓益生菌低、中劑量血清組，但低、中劑量血清組間的差異不大。由此可見，IL-22變化隨著血清劑量升高而呈現(xiàn)高表達，結(jié)合TG及油紅O染色，說明藍莓益生菌的聯(lián)合應(yīng)用，能顯著改善肝細胞脂肪變性程度，并能增強IL-22表達。Radaeva等發(fā)現(xiàn)[29]，IL-22激活STAT3信號通路可上調(diào)抗凋亡基因、抗氧化應(yīng)激基因的表達，下調(diào)脂肪生成基因表達(如SREBP-1c)，已達到改善脂肪肝的目的。因此，推測藍莓益生菌增強IL-22表達拮抗NAFLD的作用機制系IL-22激活JAK1/STAT3信號通路，下調(diào)三酰甘油合成相關(guān)基因表達，達到改善NAFLD的目的。

由于藍莓益生菌血清成分復(fù)雜，本文僅初步探討其通過增強IL-22表達推測其參與拮抗NAFLD的作用，具體血清中的哪種成分發(fā)揮了作用，是否還存在其他的作用機制，還有待更深層次的研究。

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(本文編輯：錢燕)

Expression of IL-22 in hepatic steatosis intervened by blueberry probiotic serum

ZHUJuan-juan,CHENGMing-liang.

DepartmentofInfection，thehospitalaffiliatedofGuiZhoumedicaluniversityCorrespondingauthor:

ObjectiveTo investigate mechanism of blueberry probiotic in treating nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) via affecting expression of interlukin-22 (IL-22). MethodsSerum from rats treated with saline, and low, medium and high dose of blueberry probiotic by gavage were collected, respectively. Cell steatosis model was constructed by stimulating normal liver cell line L-02 with free fatty acid (FFA). Serum from different dose blueberry probiotic treated rats were added into cell culture medium as 10% concentration for the L-02 steatosis model, respectively. Intracellular lipid deposition was observed by oil red O staining and level of triglyceride (TG) was quantitatively determined. Gene expression of IL-22 was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and protein expression of IL-22 was detected by western blot and immunofluorescence. ResultsAfter 24-hour FFA stimulation in L-02 cell with serum, a pile of lipid deposition could be observed and TG level was significantly increased (P=0.000), while mRNA and protein levels of IL-22 were decreased (P=0.000). In blueberry probiotic serum groups, TG levels and lipid depositions were negatively correlated with the dose of blueberry probiotic. In high-dose blueberry probiotic serum group, expression of IL-22 was significantly enhanced comparing with the other groups (P=0.000). However, there was no significant difference in expression of IL-22 between the low- and medium-dose serum groups (P>0.05). ConclusionBlueberry probiotic might play a role in treatment of NAFLD by enhancing the expression of IL-22.

Blueberry probiotic serum; Hepatocyte; Steatosis; Interleukin-22

貴州省科技廳社會攻關(guān)(黔科合SY[2010]3017號)；黔東南苗族侗族自治州林業(yè)局科研基金(ZLYJZFCG-2012-7)。

550001貴陽貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科

程明亮，Email: chengml@21cn.com

2016-05-12)