腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性研究*

朱思穎，陳丹琦，梁家銘，李海新，李　蓉，柯德森

(廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東　廣州　510006)

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腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性研究*

朱思穎，陳丹琦，梁家銘，李海新，李蓉，柯德森

(廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006)

在不同溫度、供氧量、鹽度及處理時間條件下，對腐爛龍須菜的還原糖含量、瓊膠酶活力及分子量進(jìn)行分析，以探究龍須菜腐爛過程中自水解生產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性，并分析影響其水解程度因素。實驗表明，腐爛龍須菜中有一種活性物質(zhì)能降解瓊膠生產(chǎn)瓊膠寡糖。35 ℃、淡水半?yún)捬酢⒏癄€處理96 h時的龍須菜產(chǎn)瓊膠寡糖含量為“完好”樣品近6倍，酶活力是0 h酶活力的約8.2倍。該條件下處理48 h的腐爛龍須菜的小分子瓊膠寡糖的相對含量達(dá)98.71%。

龍須菜；腐爛；瓊膠酶；瓊膠寡糖；分子量

瓊膠在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛，卻不能人工合成，只能從產(chǎn)瓊膠紅藻中提取。而龍須菜是江蘺屬海藻中提取瓊膠質(zhì)量最好的種類之一，其瓊膠含量達(dá)20%～25%，瓊膠凝膠強(qiáng)度可達(dá)1000 g·cm-2以上。

瓊膠在食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、日用化工、輕工業(yè)等方面有廣泛的應(yīng)用[1]。但由于瓊膠凝動性強(qiáng)，不容易被吸收，因此在應(yīng)用方面受到很大限制。而瓊膠經(jīng)酸水解后主要形成由瓊二糖的重復(fù)單位連接而成的寡糖，即瓊膠寡糖，水溶性好，有利于人體吸收，是一種新型的海洋功能性低聚糖[2]，因此瓊膠寡糖的研究成為新的熱點。

目前瓊膠寡糖雖然在食品、醫(yī)藥、生物等許多方面有廣闊應(yīng)用前景，但瓊膠寡糖至今還沒有進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)[3-4]。而到目前為止，實現(xiàn)降解瓊膠生產(chǎn)瓊膠寡糖的瓊膠酶工業(yè)化生產(chǎn)的菌株只有大西洋假單胞菌，其產(chǎn)品來自于Sigma公司，價格昂貴，而我國尚沒有瓊膠酶的產(chǎn)品[5-8]。

本實驗充分利用低成本的腐爛龍須菜，用單因素法探究腐爛龍須菜的天然瓊膠酶降解瓊膠產(chǎn)瓊膠寡糖的可行性及將腐爛龍須菜不同溫度、供氧量、海水與淡水、時間等條件腐爛處理下對瓊膠寡糖含量進(jìn)行對比研究，目的是探究較高產(chǎn)量的應(yīng)用價值高的瓊膠寡糖生產(chǎn)的最適條件，因此經(jīng)濟(jì)利用價值十分高。

1　實　驗

1.1實驗材料和試劑

新鮮龍須菜：2016年1月購于廣東省南澳島，用清水沖洗干凈后用海水浸泡、氧氣泵供氧備用。海水[9]：每100 mL水含3.5 g海鹽配制。3,5-二硝基水楊酸[10-11]：精確稱取3,5-二硝基水楊酸40 g，溶于800 mL濃度為2 mol·L-1的NaOH溶液中，加入2000 mL蒸餾水，再加入1200 g的酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至4000 mL。Tris-HCl緩沖液。0.2%瓊膠溶液：瓊脂粉，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，Tris-HCl緩沖液溶解。

1.2培養(yǎng)環(huán)境因素對腐爛龍須菜的處理

1.2.1溫度處理

稱取120 g新鮮龍須菜用蒸餾水稍微沖洗，用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜(100次)，平均分成3份均勻置于3個大小一致干凈燒杯中，分別標(biāo)志為：“損傷25 ℃”、“損傷35 ℃”、“損傷45 ℃”。隔24 h測一次還原糖含量，共測3次。(對照為海水浸泡、氧氣泵供氧的備用龍須菜，測量時標(biāo)志為“完好”，以下簡寫為“完好”龍須菜。)

1.2.2供氧量、海水與淡水處理

在溫度處理的結(jié)果的基礎(chǔ)上，選出合適的溫度進(jìn)行如下操作：稱取240 g新鮮龍須菜用蒸餾水稍微沖洗，用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜(200次)，平均分成6份后均勻置于6個大小一致的干凈燒杯中，其中3個燒杯中加入600 mL淡水，另外3個加入配制好的600 mL海水，從海水和淡水處理的燒杯中各取3個燒杯分別用保鮮膜密封、敞開、用氧氣泵供氧，用于提供利于海水厭氧、淡水厭氧、海水半?yún)捬酢⒌雲(yún)捬?、海水好氧、淡水好氧的微生物生長環(huán)境。測定腐爛培養(yǎng)24 h和48 h的還原糖含量以確定最適條件。(對照 “完好”龍須菜)

1.2.3最適培養(yǎng)時間實驗

以上兩實驗得出的最適條件為基礎(chǔ)，重新稱取120 g新鮮龍須菜用蒸餾水稍微沖洗，用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜(100次)后適宜條件培養(yǎng)，在腐爛培養(yǎng)時間為15 h、24 h、40 h、49 h、64 h、73 h、87 h、96 h時測定腐爛龍須菜樣品和“完好”龍須菜還原糖含量。(對照為 “完好”龍須菜)

1.3腐爛龍須菜提取液的天然瓊膠酶活力測量[12]

稱取約100 g新鮮龍須菜材料用蒸餾水沖洗，用酒精消毒后的小刀切斷龍須菜，置于干凈的燒杯中，加淡水浸泡龍須菜至剛好覆蓋，分別在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、64 h、96 h、108 h、120 h、132 h取提取液與瓊膠溶液混合(提取液:0.2%瓊膠溶液=8:2)后，馬上取0.5 mL提取液與瓊膠溶液的混合液于3支有刻度的試管中，測定還原糖OD值。剩下的混合液置于培養(yǎng)箱中酶解24 h后測定酶解后的還原糖OD值。以酶解前后還原糖OD值的變化量衡量酶活力的大小。

還原糖OD值測定方法如下：取0.5 mL溶液，加入0.5 mL蒸餾水后加入2 mL DNS，煮沸10 min，冷卻，定容到7.5 mL，在520 nm下測吸光度，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算粗酶活。以反應(yīng)體系中1 min產(chǎn)生0.001 μg還原糖所加入的酶量為一個活力單位。

1.4龍須菜還原糖含量的測定[10-11]

將龍須菜分別稱取10 g于燒杯中，用75%酒精消毒過的剪刀剪碎至各份龍須菜的剪碎程度接近，用研缽研磨充分形成漿，分別加入100 mL蒸餾水。置于100 ℃水浴鍋水浴30 min，攪拌，真空抽濾，保留濾液。每一份濾液取分別取1 mL至3支有刻度的試管中，并加入2 mL DNS溶液，100 ℃水浴煮沸10 min以后，定容到7.5 mL，用分光光度計在520 nm波長下比色測定光密度。

1.5還原糖的分子量鑒定[13-18]

取樣品5 mL，加入50 mL蒸餾水稀釋，加熱并攪拌使其充分溶解，冷卻至室溫后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾備用。利用凝膠過濾GPC-HPLC (島津LC20A，日本島津公司)進(jìn)行分子量范圍測定，GPC色譜柱RBL2054；流動相為純凈水，使用前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃，示差折光檢測器溫度30 ℃；進(jìn)樣量：9 μL。

1.6實驗數(shù)據(jù)處理

以上實驗重復(fù)次數(shù)均為3，取平均值并計算標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)，實驗結(jié)果表示為：平均值 ±SE。

2　結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)溫度對龍須菜還原糖產(chǎn)量的影響

圖1可知，任一時刻下25 ℃、35 ℃、45 ℃下腐爛龍須菜的還原糖含量均比無損傷腐爛處理的龍須菜的還原糖含量高，且35 ℃與45 ℃下培養(yǎng)下的還原糖含量更高，這與梅建鳳等[3]的研究結(jié)果接近，其中45 ℃培養(yǎng)的腐爛龍須菜24～72 h時還原糖含量上升較快，72 h時還原糖含量為24 h時的2.8倍，25 ℃、35 ℃下培養(yǎng)的腐爛龍須菜在48～72 h之間還原糖含量呈明顯上升趨勢；猜測與產(chǎn)瓊膠酶的微生物生長繁殖的最適溫度以及酶活性發(fā)揮的最適溫度有關(guān)?？紤]到生產(chǎn)成本的因素，故選取35 ℃溫度下，進(jìn)行不同氧氣和水條件處理龍須菜的還原糖含量的環(huán)境條件探究。

圖1　腐爛龍須菜在不同溫度下還原糖含量隨時間的變化曲線Fig.1　Change of reducing sugar content in rotten asparagus at different temperaturesvaried with time 注：圖中數(shù)據(jù)為三組平行實驗的平均值， 其中垂直短線表示實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2溶氧量和水的鹽度對還原糖含量的影響

圖2　不同氧氣和水條件處理還原糖含量隨時間的變化Fig.2　Change of reducing sugar content in different oxygen and water conditions

由圖2可知，損傷腐爛處理的龍須菜培養(yǎng)48 h的還原糖含量均比24 h高，且條件為淡水、半?yún)捬鯒l件處理的腐爛龍須菜的還原糖含量最高，而淡水厭氧條件處理的腐爛龍須菜還原糖含量次之，可初步確定產(chǎn)瓊膠酶的微生物適于生長在淡水、半?yún)捬鯒l件，為半?yún)捬跷⑸?。因此選取淡水、半?yún)捬鯒l件為最適條件。

2.3培養(yǎng)時間對龍須菜還原糖含量的影響

圖3結(jié)果可知，35 ℃、淡水、半?yún)捬鯒l件下培養(yǎng)的腐爛龍須菜上還原糖含量明顯比對照的“完好”樣品的還原糖含量高；在15～40 h時，還原糖含量呈指數(shù)上升，64 h后趨于平穩(wěn)上升，在實驗時間內(nèi)，培養(yǎng)時間為96 h的腐爛龍須菜上還原糖含量是對照樣品近6倍。因此35 ℃、淡水半?yún)捬醯臈l件更利于腐爛龍須菜上還原糖的積累。

圖3　35 ℃、淡水、半?yún)捬跆幚砀癄€龍須菜還原糖含量隨時間的變化Fig.3　Changes of reducing sugar content at 35 ℃ in fresh water and half rotten asparagus anaerobic treatment with time

2.4腐爛龍須菜天然瓊膠酶活力驗證

根據(jù)圖4結(jié)果可見，腐爛龍須菜的瓊膠酶活力在龍須菜腐爛0～96 h呈上升趨勢，96 h時酶活力達(dá)到最大后開始下降，其上升趨勢與圖3所示結(jié)果相吻合。培養(yǎng)時間為96 h提取液酶活力是0 h時約8.2倍。對0 h、48 h和96 h的酶活力進(jìn)行單因素方差分析，計算結(jié)果顯示，說明龍須菜腐爛處理0 h、48 h、96 h之間酶活力差異達(dá)極顯著水平， 96 h時的酶活力極顯著大于0 h和48 h，結(jié)果證明腐爛龍須菜的提取液中存在具瓊膠酶活性物質(zhì)，促進(jìn)瓊膠水解產(chǎn)生瓊膠寡糖。

圖4　腐爛龍須菜酶活力隨時間變化圖Fig.4　Gracilaria decay of enzyme activity over time

2.5還原糖分子量測定結(jié)果

將GPC高效液相色譜法所測還原糖的保留時間劃分為3部分：其中保留時間為3～6 min為大分子量，保留時間為7～10 min為中分子量，保留時間11～14 min部分為小分子量。其中，小分子量的還原糖可初步認(rèn)為是瓊膠寡糖。以各部分峰面積占總波峰面積的百分比(%)近似表示該部分分子量的可溶性糖的相對含量，結(jié)果如表1所示。對“完好”、海水半?yún)捬?、淡水半?yún)捬醯男》肿恿肯鄬窟M(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果為P=4×10-15<<0.01，說明不同條件處理腐爛龍須菜所得小分子量的相對含量的差異達(dá)極顯著水平，其中淡水半?yún)捬跆幚項l件下小分子量達(dá)到98.71%,為未經(jīng)處理的“完好”龍須菜的近8倍，證明淡水、半?yún)捬鯒l件下培養(yǎng)腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)的瓊膠寡糖最多，與上述實驗結(jié)果均吻合。

表1　液相色譜法測定不同條件處理腐爛龍須菜 所得分子量分布表Table 1　Liquid Chromatography different processing conditions rotting asparagus dish molecular weight distribution of the resulting table

3　結(jié)　論

本實驗探究了腐爛龍須菜是否能通過自水解生產(chǎn)應(yīng)用價值高的瓊膠寡糖，實驗證實了在適宜條件下，腐爛龍須菜能產(chǎn)生一種活性物質(zhì)，這種活性物質(zhì)使腐爛龍須菜自水解生產(chǎn)海洋功能性低聚糖——瓊膠寡糖。

本實驗通過改變溫度、溶氧量、水鹽度、培養(yǎng)時間等條件，測定腐爛龍須菜上還原糖的含量(通過測定還原糖OD值并繪制還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=2.1802x，R2=0.9927)初步確定損傷腐爛處理能增大瓊膠寡糖的產(chǎn)量，進(jìn)一步通過腐爛龍須菜提取液的天然瓊膠酶活力驗證，證實了腐爛龍須菜能產(chǎn)生一種活性物質(zhì)，這種活性物質(zhì)可能是一種瓊膠酶，能促進(jìn)水解瓊膠生產(chǎn)還原糖，而這種還原糖最終通過還原糖的分子量測定初步鑒定為瓊膠寡糖。本實驗探索并得到腐爛龍須菜生產(chǎn)瓊膠寡糖的相對合適條件，推測該條件適合產(chǎn)瓊膠酶的微生物的生長并使其產(chǎn)生的瓊膠酶活性更高。實驗結(jié)果表明：在35 ℃左右、淡水、半?yún)捬鯒l件下，瓊膠寡糖在腐爛龍須菜培養(yǎng)時間小于96 h時產(chǎn)量呈上升趨勢，15～40 h時呈指數(shù)增長，64～96 h平穩(wěn)上升且96 h時產(chǎn)量達(dá)到最高，為對照的“完好”樣品的近6倍；龍須菜腐爛處理時間為96 h提取液的酶活力是0 h提取液酶活力約8.2倍，而被小分子量瓊膠寡糖相對含量在淡水半?yún)捬跆幚硐聻槲唇?jīng)處理的“完好”龍須菜的近8倍。此結(jié)果對將來進(jìn)一步放大生產(chǎn)瓊膠寡糖具有重要的參考價值。

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Feasibility Study of Agar Oligosaccharide Production by Self Hydrolysis during Decay Process inGracilariaLemaneiformis*

ZHUSi-ying,CHENDan-qi,LIANGJia-ming,LIHai-xin,LIRong,KEDe-sen

(School of Life Sciences, Guangzhou University, Guangdong Guangzhou 510006, China)

Under the conditions of different temperature, the amount of oxygen, salinity and treatment time, the content and the molecular weight of reducing sugar were measured, as well as the agarase activity inGracilarialemaneiformiswas analyzed during decay process. The feasibility study of agar oligosaccharide production by self hydrolysis during decay process inGracilarialemaneiformiswas studied and the related factors affecting the degree of hydrolysis were analyzed. The results showed that the agar could be degraded to produce agaro oligosaccharides during decay process inGracilarialemaneiformis. The agar oligosaccharide content in 96 h was 6 times as much as that of the natural species. The enzyme activity in 96 h was 8.2 times as much as that in 0 h. The small molecule agarose content could reached 98.71% when Gracilaria rotted in fresh water at 35 ℃ for 48 h.

Gracilarialemaneiformis; rot; agarase; agar oligosaccharide; molecular weight

廣東省自然科學(xué)基金項目(2014A030313531)；廣州市科技計劃項目(201510010108)；廣東省專業(yè)綜合改革試點項目(生物工程, 粵教高函[2013]113號)；2016廣東省級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(教務(wù)〔2016〕58號)；第十五屆全國“挑戰(zhàn)杯”競賽立項(2016：瓊膠寡糖)。

朱思穎(1993-)，本科生。

柯德森(1966-)，博士，教授。

S985.4+9

B

1001-9677(2016)018-0052-04