藍(lán)江林，栗　豐，2，劉　波*，史　懷，黃素芳

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建　福州　350003；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福建　福州　350108)

?

養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料微生物類群結(jié)構(gòu)特性分析

藍(lán)江林1，栗豐1，2，劉波1*，史懷1，黃素芳1

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建福州350003；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州350108)

采用定點(diǎn)取樣、平板分離的方法，分析養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料微生物的結(jié)構(gòu)特性。結(jié)果表明，在30個(gè)樣點(diǎn)5次取樣過程中，微生物含量總體為細(xì)菌>放線菌>真菌。細(xì)菌含量變化幅度最大[(33.72～197.23)×105cfu·g-1]，真菌含量變化相對較小[(7.87～48.64)×103cfu·g-1]，而放線菌含量變化穩(wěn)定[(20.14～33.18)×104cfu·g-1]。細(xì)菌含量類群Ⅰ(大于70.00×105cfu·g-1)平均9.2個(gè)樣點(diǎn)、占總樣點(diǎn)的28.67%；類群Ⅲ(小于30.00×105cfu·g-1)平均為8.6個(gè)樣點(diǎn)，占總樣點(diǎn)的30.67%；類群Ⅱ[(30.00～70.00)×105cfu·g-1]平均為12.2個(gè)樣點(diǎn)，所占比例最大，為40.67%。真菌類群Ⅰ(大于70.00×103cfu·g-1)平均僅3.8個(gè)樣點(diǎn)，所占比例最低，為12.67%；類群Ⅱ[(30.00～70.00)×103cfu·g-1]平均為6.4個(gè)樣點(diǎn)，所占比例為21.33%；類群Ⅲ(小于30.00×103cfu·g-1)平均19.8個(gè)樣點(diǎn)，所占比例高達(dá)66.00%。放線菌3種類群所占比例與真菌類似，類群Ⅰ(大于70.00×104cfu·g-1)平均僅1.4個(gè)樣點(diǎn)，所占比例最低，僅為4.67%；類群Ⅱ[(30.00～70.00)×104cfu·g-1]平均8.4個(gè)樣點(diǎn)，所占比例為28.00%；類群Ⅲ(小于30.00×104cfu·g-1)平均20.2個(gè)樣點(diǎn)，所占比例高達(dá)67.33%。

發(fā)酵床墊料；微生物類群；空間結(jié)構(gòu)

發(fā)酵床養(yǎng)豬是將微生物發(fā)酵技術(shù)和養(yǎng)殖技術(shù)相結(jié)合，利用墊料吸收養(yǎng)殖過程中排泄的豬糞尿，通過微生物進(jìn)行原位發(fā)酵，分解消納，去污除臭，實(shí)現(xiàn)了畜禽養(yǎng)殖的清潔環(huán)保[1]。生豬排泄的糞尿和發(fā)酵床墊料充分混合，發(fā)酵分解過程實(shí)質(zhì)上是微生物的物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)化過程，因此微生物群落組成與空間分布的研究是揭示發(fā)酵床墊料中微生物多樣性產(chǎn)生和維持機(jī)制的必要前提，對及時(shí)了解發(fā)酵進(jìn)程、有效控制發(fā)酵過程、優(yōu)化發(fā)酵條件、提高糞污降解效率都具有很重要的作用。在糞便腐熟發(fā)酵過程中，無論是常溫型還是高溫型，細(xì)菌的數(shù)量占了絕對的優(yōu)勢，升溫期各種微生物數(shù)量均有增加。進(jìn)入高溫期只有高溫細(xì)菌和高溫放線菌的數(shù)量繼續(xù)上升，在腐熟期細(xì)菌數(shù)量下降，但放線菌和霉菌數(shù)量明顯上升[2]。劉波等[3-4]運(yùn)用脂肪酸生物標(biāo)記法研究了零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落的多樣性，并提出了微生物群落分布的特征指標(biāo)，構(gòu)建發(fā)酵指數(shù)指示基質(zhì)墊層的發(fā)酵特性。畢泗偉等[5]采用16S rDNA 基因文庫技術(shù)分析發(fā)酵床細(xì)菌群落，結(jié)果表明，各層墊料細(xì)菌均分布在數(shù)十個(gè)已知細(xì)菌種屬里，中層和深層墊料中具有明顯的與分解氮等有機(jī)物相關(guān)的優(yōu)勢菌株。養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料的微生物組成種類較多, 呈現(xiàn)出很高的微生物多樣性。在同一個(gè)豬舍內(nèi)，其管理方式較為一致，養(yǎng)殖環(huán)境基本相同，但各飼養(yǎng)欄內(nèi)豬只的生長狀況、生活習(xí)慣等均存在差異，會(huì)造成墊料中微生物優(yōu)勢種類，種群結(jié)構(gòu)等也存在差異。本研究采集相同豬舍內(nèi)不同飼養(yǎng)欄內(nèi)的發(fā)酵床墊料，采用平板分離方法，分析研究墊料中細(xì)菌、真菌和放線菌的多態(tài)性，不同類群微生物的分布狀態(tài)，從微生態(tài)角度進(jìn)一步闡明發(fā)酵床墊料中微生物的變化動(dòng)態(tài)。研究結(jié)果將進(jìn)一步豐富微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)理論體系，也為該項(xiàng)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1采樣環(huán)境

采樣地點(diǎn)為福州新店養(yǎng)豬場，飼養(yǎng)“杜×長×大”商品豬，采用接觸式微生物發(fā)酵床飼養(yǎng)模式[1]。本研究樣品采集自飼養(yǎng)第2批生豬起取樣，取樣期間室外氣溫為26～38℃，豬舍采用風(fēng)機(jī)配合水簾降溫，舍內(nèi)溫度27～32℃。

1.2樣品采集

樣點(diǎn)位置分布見圖1。每個(gè)豬欄發(fā)酵床面積為6 m×8 m=48 m2，基質(zhì)墊層厚度80 cm，主要配料為谷殼和鋸末，基本配比為體積比1∶1，飼養(yǎng)25 kg左右的生豬40頭。在豬欄縱向中軸線上距欄邊沿1、3、5 m處設(shè)3個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)直徑約40 cm，將墊料上下縱深翻勻，取樣500 g待用，采樣10個(gè)豬欄共30個(gè)樣品，按照欄位樣點(diǎn)順序編號(hào)為1、2、3、…、30。從第2批生豬進(jìn)欄舍起，每間隔15 d取樣一次，共取樣5個(gè)批次。

1.3發(fā)酵床墊料可培養(yǎng)微生物分離檢測[6]

采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)培養(yǎng)細(xì)菌，馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)真菌，高氏培養(yǎng)基(改良)培養(yǎng)放線菌。稱取10 g樣品加入100 mL無菌水中，搖床振蕩15 min，使之充分混勻，梯度稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5。每個(gè)濃度每種培養(yǎng)基平板涂布3塊，每塊平板涂布菌懸液200 μL。靜置20 min，倒置于恒溫箱中培養(yǎng)。細(xì)菌30℃，1～2 d；真菌25℃，2～6 d；放線菌28℃，5～7 d。統(tǒng)計(jì)菌落種類和數(shù)量，計(jì)算對應(yīng)樣品微生物的含量。

1.4發(fā)酵床墊料微生物生態(tài)分布多態(tài)性分析

以樣點(diǎn)為樣本，以墊料中微生物含量為指標(biāo)，進(jìn)行聚類分析，將30個(gè)樣點(diǎn)根據(jù)微生物含量(細(xì)菌、真菌、放線菌)分為高含量、中含量和低含量3個(gè)類群。繪制細(xì)菌/真菌/放線菌樣點(diǎn)生態(tài)分布格局平面圖，類群Ⅰ(高含量)，圖中以黑色標(biāo)示；類群Ⅱ(中含量)，圖中以灰色標(biāo)示；類群Ⅲ(低含量)，圖中以白色標(biāo)示。

2　結(jié)果與分析

2.1微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料微生物的數(shù)量分布多態(tài)性

發(fā)酵床墊料微生物的數(shù)量分布多態(tài)性結(jié)果見表1。由于各欄圈生豬的生長狀況、行為習(xí)慣均以及人為操作管理均存在差異，采樣期間各墊料樣品的微生物的含量及結(jié)構(gòu)也存在顯著差異。整體取樣30個(gè)樣點(diǎn)中5次取樣過程中，微生物含量總體為細(xì)菌>放線菌>真菌。細(xì)菌含量最低為5.23×105cfu·g-1，最高達(dá)1 930.00×105cfu·g-1；放線菌含量最低為3.50×104cfu·g-1，最高達(dá)122.00×104cfu·g-1；真菌含量最低為0.75×103cfu·g-1，最高達(dá)277.5×103cfu·g-1。從各次取樣總體平均值來看，細(xì)菌含量變化幅度最大[(33.72～197.23)×105cfu·g-1]，真菌含量變化相對較小[(7.87～48.64)×103cfu·g-1]，而放線菌含量變化相對穩(wěn)定[(20.14～33.18)×104cfu·g-1]。

表1　微生物含量統(tǒng)計(jì)

2.2微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料微生物空間分布多態(tài)性

2.2.1微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料細(xì)菌空間分布多態(tài)性根據(jù)細(xì)菌含量為指標(biāo)，將30個(gè)樣點(diǎn)分為3類：類群Ⅰ為高含量，大于70.00×105cfu·g-1，類群Ⅱ?yàn)橹泻?，?30.00～70.00)×105cfu·g-1，類群Ⅲ為低含量，小于30.00×105cfu·g-1。根據(jù)各樣點(diǎn)細(xì)菌的含量類別，繪制樣點(diǎn)分布格局平面圖2。第1批取樣(圖2-A)細(xì)菌類群Ⅰ僅包括1個(gè)樣點(diǎn)10，細(xì)菌含量為70.25×105cfu·g-1；類群Ⅱ包括16個(gè)樣點(diǎn)，分別為樣點(diǎn)1、2、3、4、13、15、17、18、21、22、24、26、28、29和30，含量為(30.00～60.00)×105cfu·g-1；余下的13個(gè)樣點(diǎn)均屬于類群Ⅲ，含量低于30.00×105cfu·g-1，其中樣點(diǎn)16含量最低為5.53×105cfu·g-1。第2批取樣(圖2-B)類群Ⅰ包括10個(gè)樣點(diǎn)，分別為樣點(diǎn)1、2、4、5、19、、22、23、24、25和29，其中樣點(diǎn)5含量最高為164.75×105cfu·g-1；類群Ⅱ包括13個(gè)樣點(diǎn)，分別為樣點(diǎn)3、7、9、10、11、14、16、18、20、21、26、27和28，含量為(30.50～69.50)×105cfu·g-1；類群Ⅲ包括余下的7個(gè)樣點(diǎn)，其中樣點(diǎn)15含量最低為8.25×105cfu·g-1。第3批取樣(圖2-C)類群Ⅰ包括11個(gè)樣點(diǎn)，分別為樣點(diǎn)1、2、7、10、13、14、22、24、25、28和30，其中樣點(diǎn)10細(xì)菌數(shù)量最高為865.00×105cfu·g-1；類群Ⅱ包括13個(gè)樣點(diǎn)，分別為樣點(diǎn)3、4、5、8、9、12、15、17、20、21、23、26和27，含量為(34.50～66.50)×105cfu·g-1；類群Ⅲ包括其余6個(gè)樣點(diǎn)，其中樣點(diǎn)18含量最低為8.25×105cfu·g-1。第4批取樣(圖2-D)類群Ⅰ包括15個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)1、13、16、18、19、20、21、22、23、24、26、27、28、29和30，其中樣點(diǎn)1細(xì)菌含量最高為1930.00×105cfu·g-1；類群Ⅱ中包括7個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)2、4、5、7、9、12和25，含量為(32.00～64.75)×105cfu·g-1；類群Ⅲ包括其余8個(gè)樣點(diǎn)，其中樣點(diǎn)1含量最低為13.00×105cfu·g-1。第5批取樣(圖2-E)類群Ⅰ包括9個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)2、3、4、6、23、27、28、29和30，其中樣點(diǎn)3細(xì)菌含量最高為602.50×105cfu·g-1；類群Ⅱ包括13個(gè)樣點(diǎn)，分別是1、5、7、8、9、12、13、14、15、19、22、24和26，細(xì)菌含量為(38.25～68.00)×105cfu·g-1；類群Ⅲ包括8個(gè)樣點(diǎn)，分別為樣點(diǎn)10、11、16、17、18、20、21和25，其中樣點(diǎn)11細(xì)菌含量最低為10.10×105cfu·g-1。

2.2.2微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料真菌空間分布多態(tài)性根據(jù)真菌含量將30個(gè)樣點(diǎn)分類分為3類：類群Ⅰ為高含量，大于70.00×103cfu·g-1；類群Ⅱ?yàn)橹泻?，?30.00～70.00)×103cfu·g-1；類群Ⅲ為低含量，小于30.00×103cfu·g-1。根據(jù)各樣點(diǎn)真菌含量的類別，繪制樣點(diǎn)分布格局平面圖3。第1批取樣(圖3-A)類群Ⅰ包括樣點(diǎn)2、5和9，真菌含量高于80.00×103cfu·g-1，其中樣點(diǎn)9最高為102.50×103cfu·g-1；類群Ⅱ包括11個(gè)樣點(diǎn)，分別為樣點(diǎn)1、3、6、7、8、14、15、17、25、26、27，含量為(31.50～60.00)×103cfu·g-1；類群Ⅲ包括其余16個(gè)樣點(diǎn)，含量為(1.05～26.50)×103cfu·g-1，其中樣點(diǎn)12真菌含量最低為1.05×103cfu·g-1。第2批取樣(圖3-B)類群Ⅰ包括8個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)4、5、9、14、25、26、27、28，其中樣點(diǎn)26真菌含量最高為192.50×103cfu·g-1；類群Ⅱ中包括6個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)1、6、7、8、13和15，含量為(32.50～67.55)×103cfu·g-1；類群Ⅲ包括其余16個(gè)樣點(diǎn)，含量為(1.05～27.75)×103cfu·g-1，其中樣點(diǎn)12含量最低為1.05×103cfu·g-1。第3批取樣(圖3-C)類群Ⅰ包括樣點(diǎn)19、20、21和25，其中樣點(diǎn)19真菌含量最高為277.50×103cfu·g-1；類群Ⅱ中包括10個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)1、2、7、9、13、14、15、17、26、27和28，真菌含量為(30.00～62.50)×103cfu·g-1；其余16個(gè)樣點(diǎn)屬于類群Ⅲ，真菌含量變化范圍為(2.75～25.00)×103cfu·g-1，其中樣點(diǎn)12最低為2.75×103cfu·g-1。第4批取樣(圖3-D)類群Ⅰ包括樣點(diǎn)16、18和19，其中樣點(diǎn)19真菌含量最高為162.50×103cfu·g-1；類群Ⅱ中樣點(diǎn)13、15、20和21，含量范圍為(32.50～57.50)×103cfu·g-1；其余23個(gè)樣點(diǎn)屬于類群Ⅲ，含量變化范圍為(1.50～25.00)×103cfu·g-1，其中樣點(diǎn)24含量最低為1.50×103cfu·g-1。第5批取樣(圖3-E)。類群Ⅰ僅包括1個(gè)樣點(diǎn)18，真菌含量為80.00×103cfu·g-1；類群Ⅱ僅包括1個(gè)樣點(diǎn)17，含量為35.00×103cfu·g-1；其余28個(gè)樣點(diǎn)均屬于類群Ⅲ，真菌含量為(0.75～10.00)×103cfu·g-1，其中樣點(diǎn)10含量最低為0.75×103cfu·g-1。在5批采樣過程中，樣點(diǎn)10、11、12、22、23、24、29和30真菌含量穩(wěn)定，屬于類群Ⅲ。

2.2.3微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料放線菌空間分布多態(tài)性根據(jù)放線菌含量將30個(gè)樣點(diǎn)分類分為3類：類群Ⅰ為高含量，大于70.00×104cfu·g-1，類群Ⅱ?yàn)橹泻?，?30.00～70.00)×104cfu·g-1，類群Ⅲ為低含量，小于30.00×104cfu·g-1。根據(jù)各樣點(diǎn)放線菌含量的類別，繪制樣點(diǎn)分布格局平面圖4。第1批取樣(4-A)類群Ⅰ包括僅1個(gè)樣點(diǎn)2，放線菌含量為78.00×104cfu·g-1；類群Ⅱ中包括9個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)7、8、9、12、13、15、17、18和24，含量為(32.00～66.50)×104cfu·g-1；類群Ⅲ包括其余20個(gè)樣點(diǎn)，含量為(3.50～28.00)×104cfu·g-1，其中樣點(diǎn)5和30含量最低為3.50×104cfu·g-1。第2批取樣(圖4-B)類群Ⅰ僅包括1個(gè)樣點(diǎn)26，放線菌含量為73.00×104cfu·g-1；類群Ⅱ中包括8個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)7、8、 9、14、15、25、27和30，含量為(35.00～59.75)×104cfu·g-1；類群Ⅲ包括其余21個(gè)樣點(diǎn)，放線菌含量變化范圍為(11.00～29.75)×104cfu·g-1，其中樣點(diǎn)4含量最低為11×104cfu·g-1。第3批取樣(圖4-C)類群Ⅰ包括樣點(diǎn)9、19和21，其中樣點(diǎn)19放線菌含量最高為122.00×104cfu·g-1；類群Ⅱ中包括9個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)7、13、14、15、17、20、25、26和30，含量為(35.50～54.50)×104cfu·g-1；類群Ⅲ包括其余18個(gè)樣點(diǎn)，含量變化范圍為(1.75～28.50)×104cfu·g-1，其中樣點(diǎn)1含量最低為1.75×104cfu·g-1。第4批取樣(圖4-D)類群Ⅰ僅包括1個(gè)樣點(diǎn)3，放線菌含量為83.00×104cfu·g-1；類群Ⅱ中包括7個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)2、4、5、6、7、8和9，含量范圍為(30.50～49.75)×104cfu·g-1；類群Ⅲ包括其余22個(gè)樣點(diǎn)，放線菌含量范圍為(0.70～28.50)×104cfu·g-1，其中樣點(diǎn)30含量最低為0.70×104cfu·g-1。第5批取樣(圖4-E)類群Ⅰ僅包括1個(gè)樣點(diǎn)28，放線菌含量為85.00×104cfu·g-1；類群Ⅱ中包括9個(gè)樣點(diǎn)，分別是樣點(diǎn)2、8、14、15、16、18、23、29和30，含量為(30.00～61.00)×104cfu·g-1；類群Ⅲ包括其余20個(gè)樣點(diǎn)，含量變化范圍為(3.45～28.50)×104cfu·g-1，其中樣點(diǎn)1含量最低為3.45×104cfu·g-1。

在整個(gè)取樣過程中，放線菌含量類群Ⅰ樣點(diǎn)分布很少，第30 d類群Ⅰ有3個(gè)樣點(diǎn)，其余時(shí)間均為1個(gè)樣點(diǎn)，類群Ⅲ比較多，多于18個(gè)樣點(diǎn)；樣點(diǎn)10和11放線菌分布比較穩(wěn)定，屬于類群Ⅲ。

2.3微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料微生物時(shí)間分布多態(tài)性

2.3.1微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料細(xì)菌類群時(shí)間分布多態(tài)性微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料細(xì)菌類群分布比例見圖5。高含量類群Ⅰ在5個(gè)批次中樣點(diǎn)數(shù)量分別為1、10、11、15、9個(gè)，平均為9.2個(gè)。在總體30個(gè)樣點(diǎn)比例趨勢為先升后降，為3.33% → 33.33% → 36.67% → 50% → 30.00%，變化趨勢符合函數(shù)：y=-0.1667x3-0.4286x2+ 9.7381x-7.8，R2=0.9215。細(xì)菌含量類群變化趨勢函數(shù)生物學(xué)意義為：y為各批次本特征樣點(diǎn)的數(shù)量，x代表采樣的批次(每15 d 1次)，通過函數(shù)計(jì)算出下批次樣點(diǎn)中細(xì)菌高含量樣點(diǎn)的數(shù)量，進(jìn)而評估墊料發(fā)酵狀況。

類群Ⅱ在5個(gè)批次中樣點(diǎn)數(shù)量分別為16、13、13、6、13個(gè)，平均為12.2個(gè)。在總體樣點(diǎn)數(shù)量所占比例變化與類群Ⅰ相反，為先降后升，為53.33% → 43.33% → 43.33%→ 20.00% → 43.33%，變化趨勢符合函數(shù)：y=0.75x3-5.8929x2+ 11.357x+ 9.4，R2=0.7589。

類群Ⅲ在5個(gè)批次中樣點(diǎn)數(shù)量分別為13、7、6、9、8個(gè)，平均為8.6個(gè)。所占樣點(diǎn)比例總體變化與與類群Ⅱ相似，為先降后升，為43.33% → 23.33% → 20.00% → 30.00% → 26.67%，變化趨勢符合函數(shù)：y=-0.5833x3+ 6.3214x2-21.095x+ 28.4，R2=0.9956。

2.3.2微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料真菌類群時(shí)間分布多態(tài)性微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料真菌類群分布見6。類群Ⅰ在5個(gè)批次中樣點(diǎn)數(shù)量分別為3、6、4、3、1個(gè)，平均為3.8個(gè)。所占樣點(diǎn)比例總體為先升后降，10.00%→26.67%→13.33%→ 10.00%→3.33%，變化趨勢符合函數(shù)：y=0.6667x3-6.7857x2+ 19.548x-10.2，R2=0.8635。

類群Ⅱ在5個(gè)批次中樣點(diǎn)數(shù)量分別為11、6、10、4、1個(gè)，平均為6.4個(gè)。所占樣點(diǎn)比例總體為先降后升，為36.67%→20.00%→ 33.33%→13.33%→3.33%，變化趨勢符合函數(shù)：y=-0.5x3+ 4.0714x2-11.429x+ 18.4，R2=0.7886。

類群Ⅲ在5個(gè)批次中樣點(diǎn)數(shù)量分別為16、16、16、23、28個(gè)，平均為19.8個(gè)。所占樣點(diǎn)比例總體為平穩(wěn)上升，為53.33%→53.33%→53.33%→76.67%→93.33%)，變化趨勢符合函數(shù)：y=-0.1667x3+ 2.7143x2-8.119x+ 21.8，R2=0.9697。

2.3.3微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料放線菌類群時(shí)間分布多態(tài)性微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料放線菌類群分布見圖7。類群Ⅰ在5個(gè)批次中樣點(diǎn)數(shù)量分別為1、1、3、1、1個(gè)，平均為1.4個(gè)。所占樣點(diǎn)比例總體為先升后降，3.33%→3.33%→10%→ 3.33%→3.33%，變化趨勢符合函數(shù)：y=0.5x4-6x3+ 24.5x2-39x+ 21，R2=1。

類群Ⅱ在5個(gè)批次中樣點(diǎn)數(shù)量分別為9、8、9、7、9個(gè)，平均為8.4個(gè)。所占樣點(diǎn)比例相當(dāng)較為平穩(wěn)，為30.00%→26.67%→ 30.00%→23.33%→30.00%，變化趨勢符合函數(shù)：y=0.5x4-5.8333x3+ 23.5x2-38.167x+ 29，R2=1。

類群Ⅲ在5個(gè)批次中樣點(diǎn)數(shù)量分別為20、21、18、22、20個(gè)，平均為20.2個(gè)。所占樣點(diǎn)比例較高，但數(shù)量比例相當(dāng)平穩(wěn)，為66.67%→70.00%→60.00%→73.33%→66.67%，變化趨勢符合函數(shù)：y=-1x4+ 11.833x3-48x2+ 77.167x-20，R2=1。

2.4微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料微生物類群分布多態(tài)性

5個(gè)批次樣品中，細(xì)菌高含量類群Ⅰ和低含量類群Ⅲ所占樣點(diǎn)比例相近，類群Ⅰ平均9.2個(gè)樣點(diǎn)、占比28.67%；類群Ⅲ平均為8.6個(gè)樣點(diǎn)，占比30.67%；類群Ⅱ平均為12.2個(gè)樣點(diǎn)，所占比例最大為40.67%。

真菌則類群Ⅰ平均僅3.8個(gè)樣點(diǎn)，所占比例最低，為12.67%；類群Ⅱ平均為6.4個(gè)樣點(diǎn)，所占比例為21.33%；類群Ⅲ平均19.8個(gè)樣點(diǎn)，所占比例高達(dá)66.00%。

放線菌3種類群所占比例與真菌類似，類群Ⅰ平均僅1.4個(gè)樣點(diǎn)，所占比例最低，僅為4.67%；類群Ⅱ平均8.4個(gè)樣點(diǎn)，所占比例為28.00%；類群Ⅲ平均20.2個(gè)樣點(diǎn)，所占比例高達(dá)67.33%。

3　討論與結(jié)論

糞污的降解是通過微生物完成的，微生物良好的發(fā)酵狀態(tài)是發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)的核心，了解墊料各種狀態(tài)下微生物的空間分布狀況是評價(jià)養(yǎng)殖墊料發(fā)酵程度的重要研究手段。劉云浩等[7]通過對比6種關(guān)于養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料微生物總DNA的提取方法，表明SDS-CTAB結(jié)合法是一種高效、可靠的墊料微生物總DNA提取方法，有利于進(jìn)行下游的分子生態(tài)學(xué)研究。郭艷等[8]研究了豬糞堆肥升溫期細(xì)菌的分子生態(tài)學(xué)，表明堆肥樣品都具有較豐富的微生物種群多樣性，同時(shí)存在著明顯的優(yōu)勢種群結(jié)構(gòu)變化，中層多樣性最為豐富。王瀟娣等[9]采集不同年齡階段豬只腸道內(nèi)容物及不同飼養(yǎng)階段發(fā)酵床墊料進(jìn)行細(xì)菌分離，研究表明不同年齡豬腸道以及發(fā)酵床分離細(xì)菌種類相同，但是細(xì)菌含量存在差異。主要分離菌有大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌、鏈球菌、黏液性枯草芽孢桿菌、普通枯草芽孢桿菌。李婧[10]通過Real-Time PCR技術(shù)對不同深度中發(fā)酵床墊料中大腸桿菌、乳酸桿菌、產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行定量分析。發(fā)酵床墊料中表層大腸桿菌數(shù)量最多，達(dá)到9.68×105CFU·g-1，隨著深度遞增，大腸桿菌數(shù)量減少，40 cm深度處數(shù)量最少。乳酸桿菌存在于表層數(shù)量少，僅為3.69×103CFU·g-1。隨著深度的增加，乳酸桿菌數(shù)量呈上升趨勢，15 cm處達(dá)到最高值6.08×103CFU·g-1。40 cm處乳酸桿菌數(shù)量最低，為1.16×102CFU·g-1。本研究采集10個(gè)豬欄30個(gè)樣點(diǎn)5個(gè)批次的樣品，采用平板分離法研究其中細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)，期間30個(gè)墊料樣品的微生物的含量及結(jié)構(gòu)也存在顯著差異，微生物含量總體為細(xì)菌>放線菌>真菌。其中細(xì)菌含量變化幅度最大[(33.72～197.23)×105cfu·g-1]，真菌含量變化相對較小[(7.87～48.64)×103cfu·g-1]，而放線菌含量變化相對穩(wěn)定[(20.14～33.18)×104cfu·g-1]。

空間分布是同類空間事物的群體定位信息的反應(yīng)，特定分布區(qū)域中的分布對象是單一性質(zhì)的?？臻g對象按空間實(shí)體的幾何形態(tài)劃分為點(diǎn)、線、面，不同的空間分布對象具有不同的空間分布特征，并且具有各自相應(yīng)的空間分布參數(shù)。Hao X等[11]研究了弱酸性電解質(zhì)水對豬舍內(nèi)環(huán)境空間的影響，結(jié)果表明，空氣中的細(xì)菌和真菌的數(shù)量顯著下降(P<0.05)。劉波等運(yùn)用脂肪酸生物標(biāo)記法研究了零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落的多樣性，結(jié)果表明不同生物標(biāo)記多樣性指數(shù)在基質(zhì)墊層不同層次分布不同，提出了微生物群落分布的特征指標(biāo)，構(gòu)建發(fā)酵指數(shù)指示基質(zhì)墊層的發(fā)酵特性[4-5]。本研究的30個(gè)樣點(diǎn)5批次取樣分析中，細(xì)菌高含量(大于70.00×105cfu·g-1)、中含量[(30.00～70.00)×105cfu·g-1]、低含量(小于30.00×105cfu·g-1)的樣點(diǎn)數(shù)量平均分別為9.2、12.2、8.6個(gè)，占總樣點(diǎn)比例分別為30.67%、40.67%和28.67%。真菌高含量(大于70.00×103cfu·g-1)平均樣點(diǎn)為3.8個(gè)，占總樣點(diǎn)數(shù)的12.67%；中含量[(30.00～70.00)×103cfu·g-1]樣點(diǎn)數(shù)平均為6.4個(gè)，占總樣點(diǎn)數(shù)的21.33%；低含量(小于30.00×103cfu·g-1)的樣點(diǎn)數(shù)量則為19.8個(gè)，占總樣點(diǎn)數(shù)的66%；即整個(gè)研究階段，真菌數(shù)量相對較低。而放線菌高含量(大于70.00×104cfu·g-1)平均樣點(diǎn)為1.4個(gè)，占總樣點(diǎn)數(shù)的4.67%；中含量[(30.00～70.00)×104cfu·g-1]樣點(diǎn)數(shù)平均為8.4個(gè)，占總樣點(diǎn)數(shù)的28%；低含量(小于30.00×104cfu·g-1)的樣點(diǎn)數(shù)量則為20.2個(gè)，占總樣點(diǎn)數(shù)的67.33%。

研究表明很多放線菌可產(chǎn)生多種抗生素和酶，在微生物產(chǎn)生的新生物活性物質(zhì)中，放線菌產(chǎn)生的就占到了74%[12]。植物土傳病害逐漸嚴(yán)重伴隨著根系微生物區(qū)系的失調(diào)，表現(xiàn)在真菌的增長幅度大，而細(xì)菌和放線菌的比例呈下降或小幅增長趨勢，細(xì)菌性土壤變?yōu)檎婢酝寥?，結(jié)果造成土壤理化性質(zhì)改變，增加了植物病蟲害的侵染程度[12-15]。在微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬過程中，墊料中的微生物(細(xì)菌、真菌、放線菌)在生豬的活動(dòng)和管理操作的影響下隨時(shí)變化。從本研究的30個(gè)樣點(diǎn)微生物的分布狀況來看，細(xì)菌各類群的分布呈現(xiàn)隨機(jī)的特性，沒有明顯的規(guī)律，但總體上含量是遠(yuǎn)高于真菌和放線菌。放線菌在各樣點(diǎn)的分布也是以低含量為主，其中樣點(diǎn)10、11、22在整個(gè)采樣分析期間均處于低含量分布。真菌的含量最少，各樣點(diǎn)以低含量分布為主，其中樣點(diǎn)10、11、12、22、23、24、29和30這8個(gè)樣點(diǎn)在5次采樣分析中均處于低含量分布。在土壤真菌中，植物的病原真菌的比例顯著高于細(xì)菌和放線菌，有機(jī)無機(jī)肥配施相對增加了土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，可能減少土壤中的病原真菌數(shù)量[16-19]。發(fā)酵床墊料類似于土壤的體系，因此，從研究結(jié)果判斷，發(fā)酵床墊料處于一個(gè)較好的發(fā)酵狀態(tài)，能夠及時(shí)分解消納生豬排泄的糞污。

微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬是一項(xiàng)應(yīng)用不久的技術(shù)，對于墊料發(fā)酵狀況、評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等尚缺乏系統(tǒng)的研究。本研究對墊料中可培養(yǎng)的微生物(細(xì)菌、真菌、放線菌)數(shù)量分布動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究，研究結(jié)果僅揭示了墊料中微生物群落動(dòng)態(tài)的部分信息。對于全面了解墊料中微生物的動(dòng)態(tài)信息，尚需要輔助更先進(jìn)的、多樣化的研究手段。

[1]劉波，朱昌雄．微生物發(fā)酵床零污染養(yǎng)豬技術(shù)研究與應(yīng)用[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2009.

[2]凌云，路葵，徐亞同．禽畜糞便堆肥中優(yōu)勢菌株的分離及對有機(jī)物質(zhì)降解能力的比較[J]．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(1)：36-39.

[3]劉波，鄭雪芳，朱昌雄，等．脂肪酸生物標(biāo)記法研究零排放豬舍基質(zhì)墊層微生物群落多樣性[J]．生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，28(12)：1-11.

[4]鄭雪芳，劉波，林營志，等．利用磷脂脂肪酸生物標(biāo)記分析豬舍基質(zhì)墊層微生物亞群落的分化[J]．環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(11)：2306-2317.

[5]畢泗偉，吳祖芳，虞耀土．16S rDNA 基因文庫技術(shù)分析發(fā)酵床細(xì)菌群落的多樣性[J]．寧波大學(xué)學(xué)報(bào)：理工版，2013，26(1)：18-22.

[6]許光輝．鄭洪元．土壤微生物分析方法手冊[M]．北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986.

[7]劉云浩，藍(lán)江林，劉波，等．微生物發(fā)酵床墊料微生物DNA提取方法的研究[J]．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，26(2)：153-158.

[8]郭艷，張進(jìn)良，鄧昌彥，等．豬糞堆肥升溫期細(xì)菌分子生態(tài)學(xué)研究[J]．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，(9)：74-82.

[9]王瀟娣，廖春燕，朱玲．發(fā)酵床養(yǎng)豬模式中墊料的主要菌群分析[J]．養(yǎng)豬，2012，(3)：69-72.

[10]李婧．發(fā)酵床不同深度墊料中微生物與溫室氣體的分布特征[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[11]HAO X，CAO W，LI B，et al．Slightly acidic electrolyzed water for reducing airborne microorganisms in a layer breeding house[J]．J Air Waste Manag Assoc, 2014， 64(4)：494-500.

[12]文孟良，李銘剛，李一青．從放線菌次生代謝產(chǎn)物創(chuàng)制生物農(nóng)藥[C]//第五屆新農(nóng)藥創(chuàng)制交流會(huì)論文集． 北京：中國化工學(xué)會(huì)，2003：146-147.

[13]李瓊芳．不同連作年限麥冬根系微生物區(qū)系動(dòng)態(tài)研究[J]．土壤通報(bào)， 2006，37(3) ：563-565.

[14]田苗，房敏鋒，黃建新，等．根系土壤微生物變化對西洋參種植的影響[J]．生物學(xué)雜志，2011，28(5) ：38 -42.

[15]邸寧，劉志民，馬煥普．拮抗放線菌G19 對monica 再植毛桃根際微生物多樣性的影響[J]．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2011， 27(28) ：225-230.

[16]陳堯，鄭華，石俊雄，等．施用化肥和菜籽粕對烤煙根際微生物的影響[J]．土壤學(xué)報(bào)，2012，49(1) ： 208-213.

[17]劉恩科，趙秉強(qiáng)，李秀英，等．不同施肥制度土壤微生物量碳氮變化及細(xì)菌群落16S rDNA V3 片段PCR 產(chǎn)物的DGGE 分析[J]．生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27(3) ：1079-1085.

[18]FROSTEGARD A，BAATH E，TUNLIID A．Shift in the structure of soilmicrobial communities in limed forests as revealed by phospholipids fatty acid analysis[J]．Soil Biol Biochem，1993，25(6) ：723-730.

[19]ZELLES L．Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterization of micro-bialcommunities in soil：a review[J]．Biol Fert Soils，1999，29：111-129.

(責(zé)任編輯：林海清)

Analysis on Spatial Distribution of Microbes Population in the Fermentation Bed

LAN Jiang-lin1,LI Feng1，2, LIU Bo1*,SHI Huai1,HUANG Su-fang1

(1.AgriculturalBioresourceResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350003,China;2.FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350108,China)

Spatial distribution of microbes in the fermentation bed was analyzed by sampling and culturing, the results indicated that the amount of bacterium was highest, the second was actinomycete, the amount of fungi was lowest. In all of the samples，amplitude of variation of bacterial content was the biggest with(33.72～197.23)×105cfu·g-1, fungal content changes are relatively small with(7.87～48.64)×103cfu·g-1, and Actinomyces content was stability with(20.14～33.18)×104cfu·g-1. GroupⅠ(more than 70.00×105cfu·g-1)of bacteria content was averaged 9.2 sample points, accounting for 28.67% of the total sample; group III(less than 30.00×105cfu·g-1)was averaged 8.6 points, accounting for 30.67% of the total sample. Group II (30.00～70.00)×105cfu·g-1was averaged 12.2 points, accounted for the largest proportion of 40.67%. Fungal group I(more than 70.00×103cfu·g-1)was averaged only 3.8 points, the lowest proportion for 12.67%, Group II(30.00～70.00)×103cfu·g-1was averaged 6.4 points, the proportion was 21.33%, group III (less than 30.00×103cfu·g-1) was averaged 19.8 points, a whopping 66.00%.The proportion of actinomyces was similar to type of fungi, group I (more than 70.00×104cfu·g-1)was averaged just1.4 sample points, the lowest proportion, only 4.67%.Group II(30.00～70.00)×104cfu·g-1was averaged 8.4 points and percentage 28%, Group III(less than 30.00×104cfu·g-1)was averaged 20.2 sample points, a whopping 67.33%.

litter in fermentation bed；microbes populationg；spatial distribution

藍(lán)江林，栗豐，劉波，等.養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料微生物類群結(jié)構(gòu)特性分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(6)：649-656.

LAN J-L，SU F，LIU B，et al.Analysis on Spatial Distribution of Microbes Population in the Fermentation Bed[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：649-656.

2016-01-29初稿；2016-04-11修改稿

藍(lán)江林(1972-)，女，博士，研究員，主要從事應(yīng)用微生物研究(E-mail：lanfz2008@163.com)

劉波(1957-)，男，博士，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)微生物研究(E-mail：liubofaas@163.com)

國家科技支撐計(jì)劃(2012BAD14B15)；福建省科技重大專項(xiàng)(2012NZ0002)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303094)

S 828

A

1008-0384(2016)06-649-08