金杭霞，董德坤，王　偉，楊清華，朱丹華，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所，浙江 杭州 310021；2.蕭山區(qū)種子管理站，浙江 杭州 311201)

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SgP5CS基因克隆和生物信息學(xué)分析

金杭霞1，董德坤1，王偉2，楊清華1，朱丹華1，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所，浙江 杭州 310021；2.蕭山區(qū)種子管理站，浙江 杭州 311201)

利用同源克隆的方法，獲得了堿蓬P5CS基因全長(zhǎng)ORF，命名為SgP5CS。SgP5CS ORF全長(zhǎng)2 151 bp，生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)其編碼716個(gè)氨基酸組成的多肽，相對(duì)分子量為77 431.8 u，等電點(diǎn)為5.71，為穩(wěn)定的親水性蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。ClustalX多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)SgP5CS編碼的氨基酸序列與鹽角草P5CS相似性為93%，與鹽角草P5CS的親緣關(guān)系最近，其次是甜菜。脯氨酸是生物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)劑，而Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶則是植物合成脯氨酸的關(guān)鍵酶之一，SgP5CS的克隆將為進(jìn)一步的功能分析鑒定基礎(chǔ)。

堿蓬；P5CS；脯氨酸

脯氨酸在植物體內(nèi)起重要作用，不僅作為一種氨基酸構(gòu)成了蛋白結(jié)構(gòu)，還能以滲透調(diào)節(jié)劑身份起到維持細(xì)胞內(nèi)水分、穩(wěn)定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等作用。在植物體中，目前已知的脯氨酸合成途徑有谷氨酸和鳥氨酸兩條途徑，而在植物遭受逆境環(huán)境時(shí)，谷氨酸途徑是脯氨酸合成的主要途徑[1-2]。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS，EC 2.7.2.11/ 1.2.1.41)是谷氨酸合成途徑中的限速酶，當(dāng)植物受到脅迫誘導(dǎo)時(shí)，P5CS的反饋調(diào)節(jié)在控制植物脯氨酸的水平中起著重要作用[3-4]。目前已從煙草[5]、羊草[6]、桑樹[7]、苜蓿[8]、苧麻[9]、高粱[10]等多種植物中克隆到編碼該酶的基因，并且在擬南芥[11]、苜蓿[12]、小麥[13]、煙草[5]等植物中發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)P5CS基因能提高轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)脯氨酸含量，進(jìn)而提高植物抗旱耐鹽性能。堿蓬是一種能生長(zhǎng)于海邊灘涂的鹽生植物，是研究植物耐鹽機(jī)制、挖掘耐鹽抗旱基因極好的材料。本研究利用同源克隆方法首次從堿蓬中獲得了SgP5CS基因的完整ORF序列，并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息分析，這將為后期該基因的功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)，有利于更清晰地認(rèn)識(shí)P5CS基因功能和調(diào)控機(jī)制，最終為植物基因工程提供有效耐逆基因。

1　材料與方法

1.1材料與處理

堿蓬植株收集于浙江慈溪沿海灘涂，Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培至植株高為20 cm左右時(shí)，采用200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)處理1 d。

1.2方法

1.2.1堿蓬總RNA提取

采集200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)處理1 d后的堿蓬嫩葉，采用Trizol(Solomon Biotechnology)法[14]提取總RNA，-70℃保存。

1.2.2堿蓬P5CS ORF全長(zhǎng)序列的克隆

GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)查找已發(fā)表的擬南芥等物種的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶序列，Clustalw2多序列比對(duì)后設(shè)計(jì)包含完整ORF的簡(jiǎn)并引物SgP5CS-F和SgP5CS-R(表1)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一條鏈。Pfu酶(TRANSGEN BIOTECH公司)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶并割膠回收，AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，回收目的片段連接到pEASY-Blunt載體(TRANSGEN BIOTECH公司)上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，IPTG和X-gal藍(lán)白斑篩選，挑取白斑接種于5 mL LB(含 50 μg·mL-1氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆送至上海英駿公司測(cè)序。

表1堿蓬P5CS克隆所用引物序列

Table 1Primer sequences used in gene cloning of Suaeda glauca P5CS gene

引物名稱引物序列(5'→3')作用SgP5CS-FATGGACGCKWCTAGAGYYTTCGTcDNA全長(zhǎng)克隆SgP5CS-RAGGCAGCGGGAGAGAGGACAAGAAcDNA全長(zhǎng)克隆

1.2.3堿蓬P5CS的生物信息學(xué)分析

利用NCBI的ORF Finder在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找 P5CS的開放式閱讀框，并翻譯成氨基酸。在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLASTp同源性分析；用ClustalX2 進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)分析，用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。Expasy軟件包中的 ProtParam 工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；CFSSP(http://cho-fas.sourceforge.net/index.php#)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu);SWISS-MODEL工具(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2　結(jié)果與分析

2.1堿蓬P5CS完整ORF的擴(kuò)增

簡(jiǎn)并引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示(圖1) ，在大約2 100 bp 位置有一條清晰的條帶，與預(yù)計(jì)目的條帶大小相符，經(jīng)測(cè)序獲得2 151 bp的核苷酸序列，BLAST對(duì)比其他植物P5CS基因序列相似度較高，ORF Finder軟件確定其為完整ORF。堿基序列翻譯后與鹽角草、甜菜、雷蒙德氏棉等P5CS蛋白的氨基酸相似性達(dá)到80%以上，且氨基酸數(shù)量相同，確定克隆到的為堿蓬P5CS基因的完整ORF。

1:DNA Marker； 2:SgP5CS 基因cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1　SgP5CS PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1　Electrophoresis of PCR amplification products of SgP5CS

2.2堿蓬P5CS基因編碼產(chǎn)物的相似性和進(jìn)化樹分析

將堿蓬P5CS和鹽角草、甜菜、葡萄和可可樹氨基酸相似性達(dá)到79%以上的植物的P5CS蛋白進(jìn)行相似性比對(duì)(圖2)，結(jié)果表明：在氨基酸水平上堿蓬P5CS與藜科植物鹽角草高度相似，相似性達(dá)到93%，與其他植物的相似性也很高(79%～82%)。

用MEGA 5軟件構(gòu)建氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，從中可以發(fā)現(xiàn)，在氨基酸水平上，堿蓬P5CS與鹽角草P5CS的親緣關(guān)系最近，其次是甜菜，而與水稻、棉花等關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)，這與植物分類學(xué)上的親緣關(guān)系一致，堿蓬與鹽角草、甜菜同屬藜科植物。

2.3堿蓬P5CS基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

NCBI的ORF Finder分析堿蓬P5CS基因的ORF序列發(fā)現(xiàn)其編碼716個(gè)氨基酸，ProtParam軟件預(yù)測(cè)其分子式為 C3407H5561N959O1046S23，原子總數(shù)為10 996，相對(duì)分子量為77 431.8 u，等電點(diǎn)為5.71，不穩(wěn)定系數(shù)為35.36。因此，該蛋白分類為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)104.61，親水性評(píng)估為-0.044，依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)的規(guī)律，該蛋白應(yīng)為親水性蛋白。

圖2　堿蓬P5CS氨基酸序列與其他物種氨基酸序列的多重序列比對(duì)Fig.2　Multialignment of amino acid sequences of SgP5CS and other P5CSs

圖3　堿蓬SgP5CS蛋白的進(jìn)化樹Fig.3　Phylogenetic tree of the SgP5CS of Suaeda glauca

堿蓬SgP5CS三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示。TMHMM軟件檢索發(fā)現(xiàn)SgP5CS蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，意味著SgP5CS不是跨膜蛋白。通過(guò)CFSSP在線工具預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，SgP5CS編碼的氨基酸殘基有 80.3%構(gòu)成α-螺旋，33.8%構(gòu)成β-折疊 ，12.8%構(gòu)成無(wú)規(guī)則卷曲。

圖4　堿蓬P5CS的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4　Three-dimensional constitution of the P5CS of Suaeda glauca

3　討論

脯氨酸是植物對(duì)抗逆境時(shí)有效的滲透調(diào)節(jié)劑，因此P5CS酶作為脯氨酸合成的關(guān)鍵酶之一，其編碼基因被認(rèn)為是植物重要的抗逆基因。在植物基因組內(nèi)插入外源P5CS基因能提高植物非生物逆境下的抗性。徐博[14]從朝鮮堿茅(Puccinellia chinampoensis)中分離到PuP5CS基因，將其轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)，在受到高鹽和低溫脅迫時(shí)，能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量，以及葉綠素含量和可溶性糖含量。李鴻雁等[15]在羽衣甘藍(lán)中過(guò)表達(dá)擬南芥AtP5CS1基因，明顯改善了轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性。張霞等[16]在煙草中過(guò)表達(dá)OsP5CS基因，顯著增加了轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量及其非生物脅迫抗性。Zheng等[5]將AtP5CS和NtP5CS基因在大腸埃希菌中過(guò)來(lái)表達(dá)，均能提高大腸埃希菌對(duì)高鹽、堿性、干旱、高溫與冷害環(huán)境下的抗性。Chen等[17]將菜豆PvP5CS1和PvP5CS2基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥中，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株比野生型積累更多的脯氨酸，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鹽性。Verdoy等[12]將豇豆的P5CS基因轉(zhuǎn)入苜?；蚪M中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株組織中脯氨酸含量明顯，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性顯著優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因植株。目前已發(fā)表的文獻(xiàn)表明，已克隆的P5CS基因在多種植物中都能發(fā)揮其增強(qiáng)植物非生物抗性的作用。這些研究結(jié)果將為轉(zhuǎn)P5CS基因的抗旱耐鹽植物真正運(yùn)用于大田生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)克隆了堿蓬P5CS酶的編碼基因ORF片段，并獲得了SgP5CS基因的重要的生物學(xué)信息。在今后的研究工作中，將通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行耐鹽抗旱的生理生化分析，為進(jìn)一步研究SgP5CS基因功能和作用機(jī)制，以及能否應(yīng)用于改良高等植物的耐鹽性方面提供理論依據(jù)。

[1]NALIWAJSKI M R,SKLODOWSKA M.Proline and its metabolism enzymes in cucumber cell cultures during acclimation to salinity [J].Protoplasma,2014,251(1):201-209.

[2]RAI A N,PENNA S.Molecular evolution of plant P5CS gene involved in proline biosynthesis [J].Molecular Biology Reports,2013,40(11):6429-6435.

[3]HU C A,DELAUNEY A J,VERMA D P.A bifunctional enzyme (delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase) catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1992,89(19):9354-9358.

[4]WANG G,ZHANG J,WANG G,et al.Proline responding1 plays a critical role in regulating general protein synthesis and the cell cycle in maize [J].The Plant Cell,2014,26(6):2582-2600.

[5]ZHENG L,DANG Z,LI H,et al.Isolation and characterization of a Delta1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (NtP5CS) from Nitraria tangutorum Bobr.and functional comparison with its Arabidopsis homologue [J].Molecular Biology Reports,2014,41(1):563-572.

[6]張樂(lè)新,蘇蔓,馬甜,等.羊草Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(LcP5CS1)基因的克隆與分析 [J].草業(yè)學(xué)報(bào),2013,22(4):197-204.

[7]童偉.桑樹干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和P5CS基因的克隆及表達(dá)分析 [D].鎮(zhèn)江：江蘇科技大學(xué),2013.

[8]KIM G B,NAM Y W.A novel Delta(1)-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene of Medicago truncatula plays a predominant role in stress-induced proline accumulation during symbiotic nitrogen fixation [J].Journal of Plant Physiology,2013,170(3):291-302.

[9]周精華,邢虎成,揭雨成,等.苧麻Δ～1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表達(dá)分析 [J].作物學(xué)報(bào),2012,38(3):549-555.

[10]SU M,LI X F,MA X Y,et al.Cloning two P5CS genes from bioenergy sorghum and their expression profiles under abiotic stresses and MeJA treatment [J].Plant Science,2011,181(6):652-629.

[11]SZEKELY G,ABRAHAM E,CSEPLO A,et al.Duplicated P5CS genes of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and developmental control of proline biosynthesis [J].The Plant Journal,2008,53(1):11-28.

[12]VERDOY D,COBA DE LA PENA T,REDONDO F J,et al.Transgenic Medicago truncatula plants that accumulate proline display nitrogen-fixing activity with enhanced tolerance to osmotic stress [J].Plant,Cell &Environment,2006,29(10):1913-23.

[13]VENDRUSCOLO E C,SCHUSTER I,PILEGGI M,et al.Stress-induced synthesis of proline confers tolerance to water deficit in transgenic wheat [J].Journal of Plant Physiology,2007,164(10):1367-1376.

[14]徐博.朝鮮堿茅P5CS基因的克隆及其轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的研究 [D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2012.

[15]李鴻雁,李大紅.轉(zhuǎn)擬南芥P5CS1基因增強(qiáng)羽衣甘藍(lán)的耐旱性 [J].植物生理學(xué)報(bào),2014,50(7):1009-1013.

[16]張霞,唐維,劉嘉,等.過(guò)量表達(dá)水稻OsP5CS1和OsP5CS2基因提高煙草脯氨酸的生物合成及其非生物脅迫抗性(英文) [J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2014,20(4):717-722.

[17]CHEN J B,YANG J W,ZHANG Z Y,et al.Two P5CS genes from common bean exhibiting different tolerance to salt stress in transgenic Arabidopsis [J].Journal of Genetics,2013,92(3):461-469.

(責(zé)任編輯張韻)

Molecular cloning and bioinformatics analysis ofSgP5CS gene in Suaeda glauca

JIN Hang-xia1，DONG De-kun1，WANG Wei2，YANG Qing-hua1，ZHU Dan-hua1，*

(1.Institute of Crops and Nuclear Technology Utilization，Zhejiang Academy of Agricultural Science，Hangzhou 310021，China；2.Seed Management Station of Xiaoshan District，Hangzhou 311201，China)

A new gene，named asSgP5CS，was cloned by homologous cloning method from Suaeda glauca.Bioinformatics analysis showed that the open reading frame ofSgP5CS gene was 2 151 bp，encoding 716 amino acids.The isoelectric point and the relative molecular weight of coded protein were 5.71 and 77 431.8 u，respectively.Hydrophobic analysis indicated thatSgP5CS was a hydrophilic protein and had no transmembrane domain.Nucleotide sequence Blast by ClustalX indicated that the coded protein ofSgP5CS shared an identity of 93% with P5CS of Salicornia europaea.Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) is a key enzyme in the synthesis of proline which is one of the important osmotic regulators in plants.Our research laid a foundation to further study the P5CS function in Suaeda glauca.

Suaeda glauca；P5CS；proline

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):395-399http://www.zjnyxb.cn

金杭霞，董德坤，王偉，等.SgP5CS基因克隆和生物信息學(xué)分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(3)： 395-399.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.06

2015-06-29

中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目 (2014M551772)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng) (2014ZX0800403B)

金杭霞(1983—)，女，浙江杭州人，博士研究生，助理研究員，從事基因功能研究。E-mail：jinhangxia@126.com

，朱丹華，E-mail：dhzhu@mail.zaas.ac.cn

Q943.2

A

1004-1524(2016)03-0395-05