王 芳，張 宇，叢祥鳳，陳 曦

（中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，國家心血管病中心，阜外醫(yī)院，臨床檢驗中心北京100037）

·方法研究·

尿游離甲氧基腎上腺素和甲氧基去甲腎上腺素檢測標本前處理的尿液酸化研究

王 芳，張 宇，叢祥鳳，陳 曦

（中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，國家心血管病中心，阜外醫(yī)院，臨床檢驗中心北京100037）

目的 檢測24小時尿游離甲氧基腎上腺素（MN）和甲氧基去甲腎上腺素（NMN）是診斷嗜鉻細胞瘤的首選篩查方法之一，需尋求24小時尿液收集和游離NMN、MN獲得這兩個前處理過程中尿液酸化處理的安全可控方式。方法 隨機尿標本用于本研究，觀察在添加或不添加濃鹽酸及在室溫或較高溫（34℃）存放24小時和在不同酸性條件下（pH值為2、3、4）進行酸水解對尿游離NMN/MN水平的影響。結果 首先發(fā)現(xiàn)尿液在室溫或較高溫條件下不添加鹽酸進行酸化存放24小時游離NMN/MN并沒有顯著降解。之后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)不同患者24小時尿量存在較大變化，常規(guī)方法留尿過程加入固定劑量的酸會引起pH值的波動（pH值2～4）。通過調(diào)節(jié)尿液pH值，發(fā)現(xiàn)在不同酸性條件進行酸水解尿游離NMN的檢測，其水平存在顯著差異，pH值大于等于4不能達到酸水解的目的。最后利用40份隨機尿標本驗證發(fā)現(xiàn)尿液不加酸存放24小時但水解時酸化至pH 2為更可控的尿液酸化方式。結論 24小時尿留取過程不必添加鹽酸但水解前用鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2是尿游離NMN、MN檢測更加安全可控的前處理方式。

尿液； 甲氧基腎上腺素； 甲氧基去甲腎上腺素； 鹽酸； 嗜鉻細胞瘤

嗜鉻細胞瘤是一種罕見的來源于嗜鉻細胞的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，兒茶酚胺（catecholamine，CA）及其代謝產(chǎn)物甲氧基腎上腺素（metanephrine，MN）和甲氧基去甲腎上腺素（normetanephrine，NMN）是診斷嗜鉻細胞瘤的最重要的生化標志物，盡管有研究表明血漿游離MN和NMN的檢測被認為是靈敏度和特異度最高的檢測方法［1-2］，但2014年美國內(nèi)分泌臨床指南推薦檢測血漿或24小時尿游離MN和NMN作為嗜鉻細胞瘤的首選篩查方法［3］。相對于血漿，24小時尿游離MN和NMN檢測涉及更多的標本前處理過程，而不恰當或不穩(wěn)定的前處理則直接影響檢測結果的準確性。24小時尿液的收集和游離NMN、MN的獲得是最易引入不穩(wěn)定因素的兩個前處理過程。24小時尿液的收集通常需要添加防腐劑或穩(wěn)定劑，目前對于兒茶酚胺類物質(zhì)檢測最常用的尿液防腐劑是濃鹽酸，臨床中遇到患者發(fā)現(xiàn)防腐劑有刺激性氣味、開蓋“冒白煙”等情況，因不敢使用而直接棄用，不僅存在極大的安全隱患，也直接影響之后標本的檢測。由于NMN、MN相對于CA更為穩(wěn)定［4］，是否在不添加鹽酸的情況下也能保持24小時所收集的尿液的穩(wěn)定性是本研究擬回答的第一個科學問題。在體液中MN和NMN多數(shù)以硫酸鹽的形式存在，因此在檢測前需要在酸性條件下水解獲得游離的MN和NMN。目前24小時尿液收集通常采用固定劑量的鹽酸，所收尿液標本因尿量的差異造成pH值的不同，這種酸性條件的差異是否會導致水解程度的差異進而影響被測游離MN和NMN的水平？因此是否能有一種更可控的尿液酸化方式是本研究要回答的第二個科學問題。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗對象及分組 防腐劑實驗采用門診患者留取的隨機尿標本20份，其中常溫實驗10份，高溫實驗10份，將每份標本分為2組，第一組添加濃鹽酸使其終濃度為1%，室溫或高溫放置24小時（目前常規(guī)劑量），第二組不添加鹽酸，室溫或高溫放置24小時。酸水解實驗采用隨機尿標本10份，將每份標本分為5組，一組添加濃鹽酸使其終濃度為1%，室溫放置24小時（常規(guī)劑量，pH為3），另設3組室溫放置24小時后分別用6N鹽酸調(diào)pH值為2、3、4（于1mL尿液中分別添加6N鹽酸100μL、40μL、20μL），最后一組為前處理過程中完全不加鹽酸（pH為7）。整體尿液酸化條件驗證實驗采用隨機尿標本40份，一組添加濃鹽酸使其終濃度為1%，室溫放置24小時，另一組為室溫放置24小時后用6N鹽酸調(diào)pH值為2。尿量統(tǒng)計通過記錄我院2014年1月到12月868例進行尿游離MN和NMN檢測患者的24小時尿量進行分析。

1.2 儀器 Waters高效液相色譜儀，具體組成為：515泵、進樣器、2465型電化學檢測器。

2 測定方法

尿液煮沸30分鐘進行水解后進行固相萃取，采用Waters公司MCX固相萃取柱，洗脫液經(jīng)真空干燥處理后重懸于0.1N鹽酸上機檢測。液相分析條件：Synergi分析柱（Phenomenex公司）、流動相成分包括乙酸鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、離子對、氯化鈉、甲醇、二正丁胺。測定流速為1 mL/min，測定時間為15 min。

3 統(tǒng)計學處理

分析軟件采用SPSS 17.0。數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性與方差齊性檢驗，正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗；非正態(tài)分布資料數(shù)據(jù)以中位數(shù)及四分位數(shù)間距表示，比較采用Mann-Whitney檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 室溫條件下尿液中不添加鹽酸不影響尿游離NMN/MN的水平

我們?nèi)?0份隨機尿，模擬臨床24小時的尿液收集過程，分為兩組，一組添加鹽酸放置24小時（鹽酸終濃度1%），一組不添加鹽酸放置24小時。結果顯示24小時放置過程添加和不添加鹽酸游離MN、NMN的水平?jīng)]有顯著性差異（表1，NMN，P= 0.3527；MN，P=0.5787），表明MN和NMN在尿液留取過程中較為穩(wěn)定，24小時尿液收集過程中可以不添加鹽酸作為防腐劑。

2 高溫條件下尿液不添加鹽酸不影響尿游離NMN/MN的水平

考慮夏天氣溫高對含菌尿液標本的影響，我們另取得10份隨機尿，其中3份標本細菌陽性，加鹽酸或不加鹽酸于34℃放置24小時觀察尿游離NMN/MN的水平，結果顯示34℃放置24小時后未加酸的含菌標本明顯混濁，但添加鹽酸組與不添加鹽酸組游離MN、NMN的水平?jīng)]有顯著性差異（表2，NMN，P=0.8633；MN，P=0.9314），結果與室溫一致。

表2 高溫條件下尿液中不添加鹽酸不影響尿游離NMN/MN的水平（ng/m L）

3 患者24小時尿量差異影響所收集尿液pH值

為了研究水解過程不同pH值對尿游離NMN、MN的水平的影響，我們首先測量了患者24小時尿量范圍，結果顯示868例進行尿游離 NMN、MN測定患者的尿量范圍是300～5480mL，3000mL以上者占12.3%（圖1），說明不同患者24小時尿量存在較大變化，而目前添加防腐劑的方法是不論尿量是多少均添加固定劑量的鹽酸（尿量小于1000mL添加10mL，大于1000mL添加15mL），這樣造成所收集尿液pH值存在較大差異，其范圍為2～4。

4 水解過程不同pH值影響尿游離NMN/MN的水平

既然水解過程的酸化對尿NMN/MN的測定至關重要，我們接下來觀察了不同pH值對尿NMN、MN的影響。取10份隨機尿，設置常規(guī)在收集過程中添加鹽酸（鹽酸終濃度1%）為對照組，另外三組放置24小時后分別用6N鹽酸調(diào)pH值為2、3、4，最后一組為前處理過程中完全不加鹽酸（pH值為7）。結果顯示在不同的pH值條件下，尿游離NMN的水平存在顯著差異（P=0.0071）。pH值為2和3組與常規(guī)處理組相比沒有顯著性差異，但pH值為4和7組與常規(guī)處理組相比則存在顯著性差異，而pH值為2和3組之間以及pH值為4和7組之間則沒有顯著性差異（表3）。MN的水平在不同的酸水解條件下并沒有顯著性差異（P=0.7671），但其變化趨勢和NMN相似。測得常規(guī)處理組（鹽酸終濃度1%）的pH值為3，不添加鹽酸的尿液pH值為7，表明水解過程若pH值大于等于4則不能達到酸水解的目的，從而影響尿游離NMN或MN的測定。

表3 水解過程不同pH值影響尿游離NMN、MN的水平（ng/mL）

5 尿液收集過程不加鹽酸但酸水解過程調(diào)節(jié)pH到2～3為更可行可控的前處理方式

為了進一步確認應將尿游離NMN、MN測定標本前處理的重點放在水解的酸化條件而非尿液收集過程的酸化，并排除24小時尿液收集過程中滋生的細菌對結果的影響，我們擴大標本量，另取40份隨機尿，其中16份尿常規(guī)顯示細菌陽性（+-+++）。分為三組，一組常規(guī)處理，即1%鹽酸室溫放置24小時（pH值為3），一組室溫放置24小時后用鹽酸調(diào)pH值為2。結果顯示NMN和MN在兩組之間均無顯著性差異，進一步證明尿液收集過程不加鹽酸但酸水解過程調(diào)節(jié)pH到2～3為更可行可控的前處理方式。

表4 尿液酸化的不同策略對尿NMN/MN的影響（ng/mL）

討 論

24小時尿液收集過程中的酸化防腐以及之后酸水解獲得游離NMN、MN是影響24小時尿游離NMN、MN測定結果穩(wěn)定性的兩個重要的標本前處理過程，本研究發(fā)現(xiàn)水解過程中有效的酸化，而非尿液收集過程中的酸化，是影響尿游離NMN、MN的關鍵因素，測定尿游離NMN、MN無需在尿液收集過程中添加鹽酸等防腐劑，接收標本后進行酸度調(diào)節(jié)是保證有效酸水解及檢測結果穩(wěn)定性的更為可控的方式。

24小時尿兒茶酚胺檢測通常要在尿液留取過程中添加濃鹽酸防腐以及更為重要的防止兒茶酚胺的降解［5］，由此，在尿游離 NMN、MN的檢測中人們延用了兒茶酚胺檢測的尿液收集方式，但是，研究表明NMN、MN卻比它們的生成物去甲腎上腺素和腎上腺素穩(wěn)定得多，Jacques等［4］的研究指出尿液在室溫放置8天NMN和MN的水平并無明顯變化，提示尿液NMN、MN的穩(wěn)定性很好，這與我們的結果相同。而且我們還觀察了高溫不加酸引起細菌生長的標本對測定結果的影響，發(fā)現(xiàn)并不影響NMN、MN的水平，更進一步支持NMN、MN在尿液中的穩(wěn)定性。濃鹽酸作為尿液防腐劑在臨床上應用存在較大的安全隱患，尤其對于門診患者，在自行添加防腐劑的過程中若使用不當一方面可能造成不必要的傷害，另一方面影響結果的準確性，由此，我們推薦尿游離NMN、MN的測定在24小時尿留取過程中可以不添加防腐劑，不過，若是測定尿兒茶酚胺則必須添加酸化劑或穩(wěn)定劑防止其降解。

也因為在尿游離NMN、MN的檢測中延用了兒茶酚胺檢測的尿液收集方式，人們忽略了尿液的pH值對之后的水解過程的影響，對于正常尿量的人群添加固定劑量的濃鹽酸（10～15mL于24小時尿），pH值通常是3左右，按照本研究結果確實不影響最終NMN、MN的水平，但如果尿量超過正常范圍，固定量的鹽酸則必然使pH值升高，我們的研究表明pH值≥4時，NMN、MN的濃度明顯下降。李明等［6］的研究表明尿液中鹽酸濃度必須大于0.5%方能保證兒茶酚胺的穩(wěn)定，另有文獻指出兒茶酚胺保持穩(wěn)定的pH值是小于3.5［7］，依此推算，若尿量大于3000mL pH值將大于3.5，根據(jù)我們的尿量統(tǒng)計分析，這部分人群占12.3%，若直接將標本進行處理必然導致水解程度的不充分，直接影響被測游離MN和NMN的水平。所以既然尿液收集過程不必添加防腐劑，那在水解前用酸調(diào)節(jié)pH值為最適條件顯然為更具操作性且保證結果穩(wěn)定的前處理方式。

另外，需要說明的是本研究的結果顯示不同酸化策略之間在統(tǒng)計學上沒有顯著性差異，但就兩組的中位數(shù)而言差異較大，由于 NMN和 MN的參考值范圍較大（NMN為0～1464μg/24h；MN為0～394μg/24h），我們就考慮這種差異是否會影響臨床的判斷？由此我們針對24小時平均尿量依據(jù)臨床診斷標準對這些標本進行分析，除發(fā)現(xiàn)1例在兩組均高度懷疑為陽性（正常值上限4倍以上）和1例兩組均懷疑為陽性（正常值上限1～4倍）的標本外，其余正常者在兩組則均在參考范圍內(nèi)。因此，我們認為在統(tǒng)計學無差異的前提下可以得出不同尿液酸化策略對結果沒有顯著影響的結論。

綜上所述，本研究觀察了尿 NMN、MN檢測前處理過程不同的尿液酸化策略對測定結果的影響，發(fā)現(xiàn)24小時尿液收集不添加濃鹽酸但標本接收后用鹽酸酸化為pH值為2～3是更加安全可控的前處理方式。

［1］Lenders JW，Pacak K，Walther M M，et al.Biochemical diagnosis of pheochromocytoma：which test is best？JAMA，2002，287（11）：1427-1434.

［2］Hickman P E，Leong M，Chang J，et al.Plasma freemetanephrines aresuperior tourineandplasmacatecholaminesandurine catecholaminemetabolitesfortheinvestigationof phaeochromocytoma.Pathology，2009，41（2）：173-177.

［3］Lenders JW，Duh Q Y，Eisenhofer G，etal.Pheochromocytoma and paraganglioma：an endocrine society clinical practice guideline.J Clin Endocrinol Metab，2014，99（6）：1915-1942.

［4］Jacques J，Willemsen H，Alec Ross，et al.Stability of urinary fractionated metanephrines and catecholamines during collection，shipment，and storage of samples.Clin Chem，2007，53（2）：268-272.

［5］Boomsma F，Alberts G，van Eijk L，et al.Optimal collection and storage conditions for catecholamine measurements in human plasma and urine.Clin Chem，1993，39（12）：2503-2508.

［6］李明，陳適，盧琳，等尿兒茶酚胺標本留取方法的改進性研究.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2012，11（17）：1358-1359.

［7］Peaston RT，Weinkove C.Measurement of catecholamines and their metabolites.Ann Clin Biochem，2004，41（Pt1）：17-38.

（潘子昂編輯）

Stability of Urinary Fractionated M etanephrine and Normetanephrine during Collection and Storage of Urine Sam ples

WANG Fang，ZHANG Yu，CONG Xiang-feng，CHEN Xi
（Department of Laboratory Medicine，F(xiàn)uwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing，100037，China）

ObjectiveMeasurementsof24-hfractionatedurinaryfractionatedmetanephrineand normetanephrine are used for the diagnosis of pheochromocytoma，but adequate information is needed regarding collection and storage.M ethods Spot urine samples were collected from 70 volunteers.Aliquots were preserved for 24 hours at room temperature or 34℃ with or without acidification with 12N hydrochloric acid.Sampleswere tested the efficacy of hydrolysis at different acid conditions（pH 2，3 and 4）.Results No clinically relevant degradation was observed for the fractionated metanephrines in unpreserved urine samples after 24 h at room temperature and 34℃.Acidification to pH 4 was not effective for hydrolysis.Compared with acidification during colllection，acidified to pH 2 before acid hydrolysiswas a betterway for detection of fractionated metanephrine and normetanephrine.Conclusion Preservation of urine samples with hydrochloric acid for measurements of urinaryfractionatedmetanephrine andnormetanephrine is not necessary. Acidification to pH 2 before hydrolysis is amore effective and practicalmethod.

Urine； Metanephrine； Normetanephrine； Hydrochloric acid； Pheochromocytoma

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.06.030

2016-03-14；

2016-04-08

王芳（1978—），女，助理研究員，博士，生物化學與分子生物學，主要從事心血管相關疾病生物標志物研究。Tel：010-88398271；E-mail：fray.163@163.com

陳曦，教授，博士，E-mail：chenxifw@126.com