融合蛋白LTβR-Fc對卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠模型的影響

方富民 焦晴晴 朱婷婷 陸一楓 葉麗彩 錢齊宏

215006蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚性病科

·論著·

融合蛋白LTβR-Fc對卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠模型的影響

方富民 焦晴晴 朱婷婷 陸一楓 葉麗彩 錢齊宏

215006蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚性病科

目的 探討單純皰疹病毒侵入介質(zhì)配體信號通路LIGHT-HVEM阻斷劑LTβR-Fc融合蛋白對卵清蛋白誘發(fā)的特應(yīng)性皮炎小鼠模型的影響。方法 將BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對照組（以100 μl生理氯化鈉溶液進(jìn)行刺激）、模型組（將100 μg卵清蛋白溶于100 μl生理氯化鈉溶液中進(jìn)行刺激）以及阻斷劑組（在卵清蛋白致敏前24 h將100 μg LTβR-Fc溶于100 μl生理氯化鈉溶液作為阻斷劑進(jìn)行刺激），在開始致敏后第0、4、8、12、15、20、23、27、31、34天分別對各組實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行病情嚴(yán)重程度評分，同時(shí)測量記錄皮損面積大小，最后于造模結(jié)束時(shí)行眼眶取血并提取血清，處死各組小鼠，首先分別采用RT-PCR法和ELISA法檢測小鼠皮損和脾細(xì)胞上清液內(nèi)干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素（IL）-4和IL-5的mRNA和蛋白的表達(dá)情況，隨后采用ELISA方法檢測血清內(nèi)卵清蛋白特異性以及總IgE和IgG1的表達(dá)水平。結(jié)果 LTβR-Fc顯著抑制了卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠模型的炎癥反應(yīng)。與模型組相比，阻斷劑組小鼠皮損面積顯著減少（P<0.05），濕疹面積與嚴(yán)重度指數(shù)（EASI）評分降低（P<0.05）。皮炎小鼠模型組與阻斷劑組小鼠皮損處IL-4 mRNA（1.81±0.25比0.88±0.25，P<0.05）、IL-5 mRNA（1.24± 0.26比 0.75± 0.15，P<0.05）、IFN-γ mRNA（1.11± 0.19比 0.62 ± 0.09，P<0.05）水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，脾細(xì)胞上清液中IL-4蛋白（20.12±5.39比9.58±1.44，P<0.05）、IL-5蛋白［（22.77±4.07）ng/L 比（11.37 ± 2.02）ng/L，P<0.05）］、IFN-γ 蛋白［（23 930 ± 44.20）ng/L 比（16167 ± 950.40）ng/L，P<0.05）］水平差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)LTβR-Fc處理后，特應(yīng)性皮炎小鼠模型血清內(nèi)總IgE和卵清蛋白特異性IgE水平較模型組顯著下降，IgG1的表達(dá)均顯著下調(diào)。結(jié)論 融合蛋白LTβR-Fc可通過阻斷LIGHT-HVEM信號通路顯著緩解卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠的臨床癥狀，提示LIGHT-HVEM信號通路可作為治療皮炎（特應(yīng)性皮炎）的潛在靶點(diǎn)。

皮炎，特應(yīng)性；模型，動物；卵白蛋白；T淋巴細(xì)胞，輔助誘導(dǎo)；白細(xì)胞介素類；干擾素γ；LIGHTHVEM信號通路

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種慢性炎癥性皮膚病，T細(xì)胞的過度激活在其發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。在AD的急性期以Th2型細(xì)胞為主，而在AD的慢性期則以Th1型細(xì)胞為主［1］。T細(xì)胞的激活主要是通過T細(xì)胞受體（TCR）和主要組織相容性復(fù)合體、輔助分子或共刺激分子的結(jié)合實(shí)現(xiàn)，因此，共刺激分子受體-配體結(jié)合在T細(xì)胞的激活、增殖、分化和凋亡過程中扮演著重要角色［2］。針對共刺激分子受體-配體結(jié)合的治療策略不僅可用于預(yù)防急性移植免疫排斥，還可以用于維持自身免疫抑制［3］，對變應(yīng)性、炎癥性皮膚病的治療同樣具有重要的臨床意義。單純皰疹病毒侵入介質(zhì)配體（LIGHT，或稱TNFSF14，HVEML）是近期發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（TNF）配體超家族的成員之一，參與許多炎癥性疾病的發(fā)病進(jìn)程，其受體為單純皰疹病毒侵入介質(zhì)（HVEM，也可稱為 TNFRSF14 或 LIGHTR）［4］，主要表達(dá)在激活的T細(xì)胞上。研究表明，LIGHT參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎以及炎癥性腸病的發(fā)病進(jìn)程，可望成為上述疾病新的治療靶點(diǎn)［5-6］。AD患者外周血血清中LIGHT的表達(dá)水平較正常健康對照者顯著上調(diào)，且與患者血清內(nèi)IgE水平和濕疹面積與嚴(yán)重度指數(shù)（eczema area and severity index，EASI） 評分顯著相關(guān)［7］。我們擬通過觀察LIGHT-HVEM信號通路阻斷劑對卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠的影響，進(jìn)一步研究LIGHT在AD發(fā)病機(jī)制中的作用，為LIGHT-HVEM信號通路作為AD的治療靶點(diǎn)提供理論支持。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及材料

BALB/c小鼠（6～8周齡，雌性，合格證號：2013001801706）來自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，卵清蛋白（V級）產(chǎn)自美國Sigma公司，斑試器產(chǎn)自北京百億怡達(dá)科技開發(fā)有限公司，融合蛋白LTβR-Fc產(chǎn)自美國Bethyl公司，RNA抽提試劑盒產(chǎn)自上海捷瑞生物工程有限公司，抗鼠IgG1、IgG2a和IgE單克隆抗體產(chǎn)自英國Abcam公司，小鼠干擾素（IFN）-γ、白細(xì)胞介素（IL）-4和 IL-5酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（ELISA Kit）產(chǎn)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，小鼠血清IgE和IgG1 ELISA試劑盒產(chǎn)自北京百奧萊博科技有限公司，RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清均產(chǎn)自美國Gibco BRL公司，IFN-γ、IL-4和IL-5引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，細(xì)胞培養(yǎng)板均產(chǎn)自美國Becton Dickinson公司。

二、AD小鼠模型的建立和干預(yù)

于SPF級別環(huán)境下飼養(yǎng)BALB/c小鼠，12 h日夜更替，室溫24～25℃，濕度5%～10%，自由進(jìn)食。30只小鼠，隨機(jī)分成3組，每組10只。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、模型組以及阻斷劑組，實(shí)驗(yàn)前24 h剔除小鼠背部毛發(fā)，膠帶在除毛部位反復(fù)粘貼8次。空白對照組：以100 μl生理氯化鈉溶液進(jìn)行刺激；模型組：將100 μg卵清蛋白溶于100 μl生理氯化鈉溶液中進(jìn)行刺激；阻斷劑組：在每次卵清蛋白致敏前以及更換斑試器前24 h，預(yù)先以100 μg阻斷劑LTβR-Fc溶于100 μl生理氯化鈉溶液預(yù)處理小鼠。刺激與預(yù)處理過程除所用溶液成分不同外，其余步驟相同。將含不同成分的生理氯化鈉溶液滴在8 mm大圓形斑試器中的濾紙片上,隨后將斑試器用繃帶固定于背部，每2～3 d更換斑試器，1周后取下，間隔2周重復(fù)1次上述致敏和阻斷過程，共致敏3次，計(jì)7周。采用EASI方法每周進(jìn)行臨床評分，評分標(biāo)準(zhǔn)：輕度（0～24分），中度（25～50分）和重度（51～ 103分）［7］。造模結(jié)束后，在 24 h內(nèi)處死小鼠，按照實(shí)驗(yàn)要求切取皮損，凍于液氮內(nèi)；于超凈臺內(nèi)摘取脾臟，制成單細(xì)胞懸液。

三、RT-PCR法檢測皮損處IFN-γ、IL-4和IL-5 mRNA的表達(dá)

按照RNA抽提試劑盒說明書抽提皮損標(biāo)本總RNA，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，建立20 μl反應(yīng)體系，用DNA擴(kuò)增儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測IFN-γ、IL-4和IL-5 mRNA的表達(dá)（以GAPDH為內(nèi)參照），引物以及PCR反應(yīng)條件均參考既往文獻(xiàn)［8-9］設(shè)計(jì)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，以驗(yàn)證產(chǎn)物的特異性，另將反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳再次確認(rèn)所擴(kuò)增DNA片段的單一性。由系統(tǒng)自動生成試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以2-△△Ct值代表相應(yīng)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量。每例標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

四、ELISA檢測小鼠血清中總IgE和IgG1的表達(dá)水平

按照試劑盒說明書檢測小鼠血清中總IgE和IgG1以及卵清蛋白特異性IgE和IgG1的表達(dá)水平。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程以及樣本450 nm處吸光度A值，計(jì)算樣本實(shí)際濃度。

五、ELISA法檢測IL-4、IL-5和IFN-γ蛋白表達(dá)水平

分離空白對照組、模型組以及阻斷劑組小鼠脾臟，分別制成脾臟單細(xì)胞懸液重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640溶液內(nèi)，以2×106/ml細(xì)胞密度種在24孔板內(nèi)（預(yù)先以抗CD3單克隆抗體包被，1 mg/L），孵育6 h后離心收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測IL-4、IL-5和IFN-γ水平。

六、數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料的數(shù)據(jù)以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析法（one-way ANOVA），Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LTβR-Fc顯著抑制皮炎小鼠皮膚炎癥反應(yīng)

造模結(jié)束后，肉眼觀察模型組和阻斷劑組小鼠背部接觸斑試器部位皮膚均出現(xiàn)不同程度炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為紅斑、鱗屑以及少許結(jié)痂。模型組紅斑和鱗屑表現(xiàn)較阻斷劑組嚴(yán)重，空白對照組未見明顯皮損（圖1）。與模型組相比，阻斷劑組皮損面積在開始致敏后第27、31以及34天顯著降低（均P<0.05，圖 2），EASI評分在第 23、27、31 天顯著降低（均 P<0.05，圖 3）。

圖1 各組小鼠開始致敏后第34天皮膚表現(xiàn) 每組3只小鼠。模型組小鼠背部接觸斑試器部位皮膚均出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為紅斑、鱗屑以及少許結(jié)痂，而阻斷劑組紅斑和鱗屑較模型組明顯減輕，空白對照組未見明顯皮損

圖2 各組小鼠皮損面積隨時(shí)間變化比較 a：模型組與阻斷劑組比較，P<0.05

圖3 各組小鼠濕疹面積與嚴(yán)重度指數(shù)（EASI）評分隨時(shí)間變化比較a：模型組與阻斷劑組比較，P<0.05

表1 皮炎小鼠皮損處白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5和干擾素γ（IFN-γ）mRNA表達(dá)及脾細(xì)胞上清液內(nèi)3種細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平（±s，ng/L）

表1 皮炎小鼠皮損處白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5和干擾素γ（IFN-γ）mRNA表達(dá)及脾細(xì)胞上清液內(nèi)3種細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平（±s，ng/L）

注：n=10。a：與空白對照組比較，P<0.05；b：與阻斷劑組比較，P<0.05

組別 皮損脾細(xì)胞上清液IL-4 mRNA IL-5 mRNA IFN-γ mRNA IL-4 IL-5 IFN-γ模型組 1.81±0.25ab 1.24±0.26ab 1.11±0.19ab 20.12±5.39ab 22.77±4.07ab 23 930±4 419.69ab阻斷劑組 0.88±0.25a 0.75±0.15a 0.62±0.09a 9.58±1.44a 11.37±2.02a 16 166.67±950.40a空白對照組 0.51±0.07 0.47±0.03 0.37±0.11 3.93±1.72 5.01±0.69 130±17.09 F值 105.295 49.838 73.596 59.428 115.002 216.244 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

二、LTβR-Fc顯著抑制皮炎小鼠皮損處和脾細(xì)胞上清液內(nèi)IL-4、IL-5和IFN-γ表達(dá)

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組皮損處 IL-4、IL-5、IFN-γ mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而阻斷劑組皮損處IL-4、IL-5和IFN-γ mRNA的表達(dá)水平相對于模型組則顯著下調(diào)（均P<0.05，表1）。與空白對照組相比，模型組脾細(xì)胞上清液內(nèi)IL-4、IL-5和IFN-γ表達(dá)水平亦顯著上調(diào)，而阻斷劑組脾細(xì)胞上清液內(nèi)上述3種細(xì)胞因子的表達(dá)水平相對于模型組亦顯著下調(diào)（均 P<0.05，表 1）。

三、LTβR-Fc顯著抑制皮炎小鼠血清內(nèi)總IgE和IgG1以及卵清蛋白特異性總IgE和IgG1的表達(dá)

結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組血清內(nèi)總IgE和IgG1的表達(dá)水平顯著上調(diào)。阻斷劑組血清內(nèi)總IgE和IgG1的表達(dá)水平相對于模型組顯著下調(diào)（均P<0.05，表2）。此外，與空白對照組相比，模型組血清內(nèi)卵清蛋白特異性IgE和IgG1的表達(dá)水平亦顯著上調(diào)，而阻斷劑組相對于模型組則顯著下調(diào)（均 P<0.05，表2）。

討 論

表2 融合蛋白LTβR-Fc對卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠血清內(nèi)總的和卵清蛋白特異性的IgE和IgG1表達(dá)的影響（±s，μg/L）

表2 融合蛋白LTβR-Fc對卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠血清內(nèi)總的和卵清蛋白特異性的IgE和IgG1表達(dá)的影響（±s，μg/L）

注：n=10。a：與空白對照組比較，P<0.05；b：與阻斷劑組比較，P<0.05

組別 總IgE 總IgG1 卵清蛋白特異性IgE卵清蛋白特異性IgG1模型組 32 277.00±407.53ab 2 323.33±502.43ab 0.84±0.11ab 0.86±0.07ab阻斷劑組 27 446.67±2 052.64a 1 296.33±32.72a 0.46±0.10a 0.62±0.10a空白對照組 1 967.00±85.49 206.67±12.06 0 0 F值 1 813.699 132.510 234.224 393.095 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，LTβR-Fc這一阻斷LIGHT-HVEM信號通路的融合蛋白顯著抑制了卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠模型的皮膚炎癥反應(yīng)，降低了其皮損面積以及EASI評分；此外，LTβR-Fc亦顯著下調(diào)了皮炎小鼠模型皮損處和脾臟內(nèi)IFN-γ、IL-4和IL-5的表達(dá)以及血清內(nèi)卵清蛋白特異性和總IgE以及IgG1的表達(dá)水平。上述結(jié)果提示，LIGHT可以作為治療皮炎，尤其是AD的潛在靶點(diǎn)。

以往研究表明，LIGHT不僅參與T細(xì)胞增殖和活化，還在抗原激活記憶性Th細(xì)胞的維持以及適應(yīng)性免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用［10］。有研究者認(rèn)為，以被抗原激活的T細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療策略對炎癥性疾病是非常有效的［4］。近期有研究表明，阻斷LIGHT-HVEM信號通路能顯著抑制哮喘小鼠模型記憶性Th2細(xì)胞數(shù)量的上調(diào)，并與其炎癥反應(yīng)的下調(diào)顯著相關(guān)［11］。此外，在嗜酸性食管炎患者中，LIGHT和HVEM的表達(dá)顯著上調(diào)，并可能通過轉(zhuǎn)化生長因子β依賴機(jī)制導(dǎo)致組織壞死［12］。而小鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阻斷或清除LIGHT-HVEM信號通路可導(dǎo)致小鼠對利什曼蟲感染易感性上升，表明LIGHT-HVEM信號通路在樹突細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起重要作用［13］。我們的研究表明，以融合蛋白LTβR-Fc阻斷LIGHT-HVEM信號通路顯著抑制卵清蛋白誘發(fā)的皮炎小鼠模型的皮膚炎癥反應(yīng)。我們的發(fā)現(xiàn)為共刺激分子網(wǎng)絡(luò)信號通路以及蛋白類藥物在變應(yīng)性、炎癥性疾病中作為研發(fā)靶點(diǎn)提供了新的依據(jù)。

除了患者皮損面積以及EASI評分之外，Th1和Th2細(xì)胞因子表達(dá)失衡，患者血清內(nèi)IgE和IgG1的表達(dá)上調(diào)也是AD患者常見的表現(xiàn)［14］。目前研究發(fā)現(xiàn)，在AD小鼠模型中，IL-4可誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生合成IgE，募集嗜酸性粒細(xì)胞至皮損處；IL-5是嗜酸性粒細(xì)胞分化和激活的必要條件之一；而IFN-γ則在AD慢性期的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［15］。我們的研究結(jié)果顯示，LTβR-Fc顯著抑制皮炎小鼠模型皮損處和脾臟內(nèi)IFN-γ、IL-4和IL-5的表達(dá)，并下調(diào)血清內(nèi)IgE和IgG1的表達(dá)。

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Effects of a fusion protein LTβR-Fc on ovalbumin-induced dermatitis in a mouse model

Fang Fumin,Jiao Qingqing,Zhu Tingting,Lu Yifeng,Ye Licai,Qian Qihong

Department of Dermatovenereology,First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China

Objective To evaluate effects of a fusion protein LTβR-Fc,which can block the herpesvirus entry mediator ligand（LIGHT-HVEM）signaling pathway,on ovalbumin-induced dermatitis in a mouse model.Methods Thirty BALB/c mice were randomly and equally divided into 3 groups:blank control group treated with 100 μl of sodium chloride physiological solution,model group sensitized with 100 μl of sodium chloride physiological solution containing 100 μg ovalbumin,blocker group firstly blocked with 100 μl of sodium chloride physiological solution containing 100 μg LTβR-Fc followed by sensitization with 100 μl of sodium chloride physiological solution containing 100 μg ovalbumin at 24 hours after the blocking.Disease severity was evaluated by eczema area and severity index（EASI）score,and lesional size was measured on day 0,4,8,12,15,20,23,27,31 and 34 after the first sensitization.A total of three sessions of sensitization were carried out.At the end of treatment,all the mice were sacrificed after serum was obtained from their orbital cavities.Thereafter,tissue specimens were obtained from skin lesions,and single cell suspensions of the spleen were prepared.RT-PCR was performed to detect mRNA expressions of interferon γ （IFN-γ）,interleukin 4 （IL-4）and IL-5 in murine lesions,ELISA to measure IFN-γ,IL-4 and IL-5 levels in culture supernatants of murine splenocytes,as well as ovalbumin-specific and total IgE and IgG1 levels in murine sera.Results LTβR-Fc significantly suppressed inflammatory response in the mouse model of dermatitis induced by ovalbumin.Compared with the model group,the blocker group showed significantly decreased lesion area and EASI score （bothP<0.05）.In addition,a significant decrease was observed in the mRNA expressions of IL-4（0.88±0.25 vs.1.81±0.25,P＜0.05）,IL-5（0.75±0.15 vs.1.24±0.26,P＜0.05）and IFN-γ （0.62±0.09 vs.1.11±0.19,P＜0.05）in murine lesions,and in supernatant levels of IL-4（9.58±1.44 ng/L vs.20.12±5.39 ng/L,P＜0.05）,IL-5（11.37±2.02 ng/L vs.22.77±4.07 ng/L,P＜0.05）and IFN-γ （16 167±950.40 ng/L vs.23 930±44.20 ng/L,P＜0.05）in the blocker group compared with the model group.The serum levels of both total IgE and ovalbumin-specific IgE were significantly lower in the blocker group than in the model group（total IgE:27 466.67 ± 2 052.64 μg/L vs.32 277 ± 407.53 μg/L,P ＜ 0.05;ovalbumin-specific IgE:1 296.33 ±32.72 μg/L vs.2 323.33 ± 502.43 μg/L,P ＜ 0.05）,so were those of total IgG1 （0.46 ± 0.11 μg/L vs.0.84 ± 0.11 μg/L,P ＜ 0.05）and ovalbumin-specific IgG1 （0.62 ± 0.11 μg/L vs.0.86 ± 0.07 μg/L,P ＜ 0.05）.Conclusion The fusion protein LTβR-Fc can alleviate symptoms of ovalbumin-induced dermatitis in the mouse model likely by suppressing the LIGHT-HVEM signaling pathway,suggesting that this signaling pathway may serve as a target for the treatment of dermatitis（such as atopic dermatitis）.

Dermatitis,atopic;Models,animal;Ovalbumin;T-lymphocytes,helper-inducer;Interleukins;Interferongamma;LIGHT-HVEM

Qian Qihong,Email:qqihong@126.com

錢齊宏，Email：qqihong@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.010

國家自然科學(xué)基金（81402597）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81402597）

2015-04-04）

（本文編輯：尚淑賢）