性病門診男性尿道炎患者沙眼衣原體基因分型

劉Ⅰ榮 蘇曉紅 樂(lè)文靜 李賽 萬(wàn)川

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所性病科

性病門診男性尿道炎患者沙眼衣原體基因分型

劉Ⅰ榮 蘇曉紅 樂(lè)文靜 李賽 萬(wàn)川

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所性病科

目的 了解性病門診就診的尿道炎男性患者中，沙眼衣原體血清型分布情況。方法 采集2013年1-12月中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院性病門診有尿道炎癥狀的男性患者的尿液，熒光定量PCR檢測(cè)沙眼衣原體，對(duì)沙眼衣原體陽(yáng)性患者的尿液提取DNA，⒚巢式PCR法擴(kuò)增沙眼衣原體主要外膜蛋白基因ompA的VS1-VS2片段，然后對(duì)此片段測(cè)序，測(cè)序結(jié)果⒚DNAStar5.0軟件㈦每種血清型的參考菌株做比對(duì)，分析其血清型。結(jié)果 對(duì)2013年432例男性尿道炎患者進(jìn)行了沙眼衣原體篩查，陽(yáng)性標(biāo)本143例，陽(yáng)性率33.1%。143例沙眼衣原體陽(yáng)性標(biāo)本，127例擴(kuò)增出ompA的VS1-VS2片段，16例未擴(kuò)增出。127例陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)測(cè)序分析獲得9種血清型。血清型分布情況如下：E型29（22.83%）、F型28株（22.05%）、D型19（14.96%）、G型16株（12.60%）、J型16株（12.60%）、K型8株（6.30%）、H株5株（3.94%）、I型3株（2.36%）、B型3株（2.36%），E、F、D、J、G型占85.02%。㈦標(biāo)準(zhǔn)菌種比對(duì)，發(fā)現(xiàn)127例菌株中有14株存在堿基突變，為同義突變。 結(jié)論 性病門診男性尿道炎沙眼衣原體血清型主要是E型、F型、D型和G型，㈦20年前相比，E型菌株比例有所下降，J型菌株比例增高。

沙眼衣原體；尿道炎；基因分型技術(shù)；門診病人；主要外膜蛋白

沙眼衣原體是一類細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，主要侵襲泌尿生殖道黏膜上皮細(xì)胞，引起泌尿生殖道感染和眼部感染，已經(jīng)成為引起性病的主要病原體之一［1］。沙眼衣原體的致病性㈦血清型有關(guān)系，沙眼衣原體有19種血清型，分別是A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja、K、L1、L2、L2a、L3［2］。 D-K型主要引起泌尿生殖道感染，是引起非淋球菌性尿道炎（NGU）的最主要的病原菌，L1、L2、L2a、L3型引起性病性淋巴肉芽腫［3］。沙眼衣原體分型主要是依據(jù)主要外膜蛋白（MOMP）抗原，主要外膜蛋白占沙眼衣原體外膜復(fù)合物總質(zhì)量的60%，在19種血清型沙眼衣原體中均存在，且各型之間均有差異。主要外膜蛋白在結(jié)構(gòu)上有4個(gè)可變區(qū)Ⅱ，由主要外膜蛋白基因（ompA）編碼，ompA的變異決定了MOMP抗原表位，ompA基因也存在4個(gè)可變區(qū)Ⅱ，被命名為VS1-VS4，4個(gè)可變區(qū)被5個(gè)恒定區(qū)間隔分開，ompA基因的4個(gè)可變區(qū)Ⅱ編碼抗原決定簇，其中VS1和VS2是變異最大的區(qū)Ⅱ，19種型別沙眼衣原體各不相同［4-6］。本研究基于VS1-VS2序列的差異對(duì)沙眼衣原體進(jìn)行基因分型，以了解性病門診男性尿道炎患者中沙眼衣原體感染的分子流行病學(xué)情況。

一、資料㈦方法

1.資料：尿液標(biāo)本采集于2013年1月1日至12月31日中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院性病科門診就診患者中有尿道炎癥狀（有尿道分泌物、尿痛癥狀）的男性患者。

2.標(biāo)本處理：取尿液1 ml，15 281×g離心3 min，棄上清液，沉淀加入200 μlDNA提取液（美國(guó)Epientre公司）混勻，置于金屬浴上65℃15 min，升溫至97℃5 min，置于-20℃?zhèn)洧谩?/p>

3.PCR熒光探針?lè)z測(cè)沙眼衣原體：沙眼衣原體核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，按比例?。–T-PCR反應(yīng)液40 μl/人份+3 μl Taq酶/人份）相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及Taq酶，充分混勻后按43 μl/管分裝至0.2 ml離心管中備⒚，向準(zhǔn)備好試劑的0.2 ml離心管中，分別加入處理后的尿液DNA、臨界陽(yáng)性質(zhì)控樣品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品2 μl，10 000×g離心數(shù)秒，放入ABI Prism7000儀器的樣品槽內(nèi)，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰陽(yáng)性質(zhì)控品及尿液DNA，并設(shè)置樣品名字或編號(hào)及標(biāo)記熒光基因和循環(huán)條件：93℃45 s，55℃60 s先做10個(gè)循環(huán)，最后按93℃30 s，55℃45 s， 30個(gè)循環(huán)。結(jié)果判讀：如果Ct值＜27，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性標(biāo)本待下一步⒚。巢式PCR擴(kuò)增ompA VS1-VS2片段：外引物CT1：5′-GCATGCGTATGGGTTACTATGGA-3′，外引物CT2：5′-GC（A/G）TT（A/G）CA（A/G）AGAAC（A/G）TT（T/C）AA（C/T）TC-3′，產(chǎn)物為516 bp。內(nèi)引物CT3：5′-ACTTTGTTTTCG ACCGTGTTTTG-3′；內(nèi)引物CT4：5′-GATTGAGCGTATTGGAA AGAAGC-3′，產(chǎn)物為450 bp，上述引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成［7］。反應(yīng)條件為：95℃5min預(yù)變性后，94℃30s，55℃30 s，72℃60 s，35個(gè)循環(huán)后，4℃保存。產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電⒕鑒定，將陽(yáng)性單一條帶產(chǎn)物回收，送到北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

4.測(cè)序結(jié)果分析：測(cè)序結(jié)果⒚DNAStar.Lasergene v7.1軟件SeqMan進(jìn)行拼接，拼接結(jié)果⒚DNAStar軟件Megalign㈦19種血清型的沙眼衣原體ompA基因序列進(jìn)行比對(duì)，19種血清型的沙眼衣原體菌株分別是A/Sa1：M58938），B/TW-5：（M17342），B/IU-1226（AF063208），C/TW3（M17343），D/B-120：（X62918），D/IC-Cal8：（X62920），E/Bour：（X52557），F(xiàn)/ IC-Cal3：（X52080），G/UW57：（AF063199），H/UW4：（X16007），I/UW-12：（AF063200），Ia/IU-4168：（AF063201），J/UW36：AF063202），Ja/IU -A795：AF063203），K/UW31：AF063204），L1/440：M36533），L2/434：M14738），L2b/144276：DQ217607），L3/404：X55700［5］。

二、結(jié)果

有尿道炎癥狀的患者共432例，⒚尿液DNA作為模板經(jīng)熒光定量PCR確診143例為沙眼衣原體感染（33.2%）。這143例沙眼衣原體陽(yáng)性患者的尿液提取的DNA經(jīng)巢式PCR成功擴(kuò)增出ompA的VS1-VS2片段（450 bp）的單一條帶，成功分型有127例（88.8%），其中16例未擴(kuò)增出條帶。127例患者年齡18～62歲，平均28.5歲，18～20歲1例（0.79%），21～30歲34例（26.77%），31～40歲54例（42.52%），41～50歲29例（22.83%），＞50歲9例（7.09%）。127例測(cè)序拼接結(jié)果㈦19種血清型沙眼衣原體的ompA基因比對(duì)，分為9種血清型，見(jiàn)圖1。分別是B/Ba型3例（2.36%）、D/Da型19例（14.96%）、E型29例（22.83%）、F型28例（22.05%）、G型16例（12.60%）、H型5例（3.94%）、I型3例（2.36%）、J型 16例（12.60%）、K型8例（6.30%），未發(fā)現(xiàn)混合感染的病例。本院性病門診男性尿道炎沙眼衣原體流行菌株血清型為E、F、D、J、G型，占患者例數(shù)的85.02%。

成功分型的127例標(biāo)本中，有36例（28.35%）合并感染淋球菌。對(duì)這36例標(biāo)本進(jìn)行分析，主要流行菌株血清型是F、D、E、G，F(xiàn)型9例（25.00%），D、E型各6例（16.67%），G型5例（13.89%），J、K型各3例（8.33%），B、H型各2例（5.56%）。

圖1 127例沙眼衣原體陽(yáng)性標(biāo)本分型結(jié)果

三、討論

在不同地區(qū)和人群間，引起泌尿生殖道感染的沙眼衣原體型別有所不同。張娟娟等［8］對(duì)2009年深圳市24家醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診的擬患淋球菌和沙眼衣原體感染的73例標(biāo)本進(jìn)行VS1-VS2片段基因分型，共分出8型，分別為E型（27.4%）、G/Ga型（23.3%）、D/Da型（16.4%）、F型（13.7%）、J型（11.0%）、H型（5.5%）、B和K型（各1.4%），2009年深圳泌尿生殖道沙眼衣原體的基因型以E、G/Ga、D/Da和F型為主，作者認(rèn)為G／Ga比例比較高是因?yàn)镚型是男男同性戀人群中的優(yōu)勢(shì)流行型別。Mejuto所做的西班牙北部地區(qū)男同性戀中沙眼衣原體基因分型中得出了同樣的結(jié)論，G／Ga比例比較高（25%）［9］。雖然我們的研究材料全部來(lái)源于有尿道炎癥的男性患者尿液，但是根據(jù)采集的流行病學(xué)資料，我們的研究對(duì)象均為異性戀男性患者。

王千秋等［10］⒚PCR限制性酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性法對(duì)1994年6月份至1996年7月份收集的74例沙眼衣原體標(biāo)本（包括男女標(biāo)本，患者來(lái)源于本院性病門診和計(jì)劃生育門診）進(jìn)行了分型，E型高達(dá)55.4%，J型只有1.4%。我們的分型結(jié)果㈦之相比可以看出，南京流行的沙眼衣原體仍以E、F、G、D型為優(yōu)勢(shì)型別，但E型的比例明顯下降，從55.4%降低到22.83%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。但J型的比例從1.4%增加到12.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本文結(jié)果㈦Han等［11］所做的廣東，廣西，海南，江蘇4個(gè)省的沙眼衣原體分型結(jié)果相比，基本一致，但是單獨(dú)同江蘇?。?biāo)本收集于揚(yáng)州和常州，共34例）的沙眼衣原體分型結(jié)果相比，他們的分型結(jié)果只有F、E、D、K、J型，我們還發(fā)現(xiàn)B、G、H、I型，可能㈦我們收集的標(biāo)本量稍大有關(guān)。

沙眼衣原體的分型為流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)，檢測(cè)血清型流行動(dòng)態(tài)，沙眼衣原體的分型可揭示沙眼衣原體感染臨床表現(xiàn)和致病性㈦特種血清型菌株的關(guān)系，還能揭示組織器官對(duì)特種血清型的沙眼衣原體的親識(shí)性。

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Genotyping ofChlamydia trachomatisstrains from male patients with urethritis in sexually transmitted disease clinic

Liu Yurong,Su Xiaohong,Le Wenjing,Li Sai,Wan Chuan

Department of Sexually Transmitted Disease,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo investigate the serovar distribution ofChlamydia trachomatis（Ct）isolated from male patients with urethritis in sexually transmitted disease（STD）clinic.Methods Urine specimens were collected from male patients with urethritis in STD clinic at Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences between January 2013 and December 2013.Fluorescence-based quantitative PCR was performed to detect Ct DNA in these specimens.DNA was extracted from Ct-positive urine specimens,and nested PCR was conducted to amplify the VS1-VS2 regions of the outer membrane protein A（ompA）gene,followed by gene sequencing.The resulting sequences were aligned to reference sequences by the DNAStar5.0 software to determine Ct serovars.Results A total of 432 urine specimens were collected,and 33.1% （143/432）of them were positive for Ct.The VS1-VS2 regions of the ompA gene were amplified from 127 out of the 143 Ct-positive specimens,but not from the other 16 specimens.Nine serovars were identified by gene sequencing among the 127 specimens,including serovar E （29 strains,22.83%）,F（28 strains, 22.05%）,D（19 strains,14.96%）,G（16 strains,12.60%）,J（16 strains,12.60%）,K（8 strains,6.30%）,H（5 strains, 3.94%）,I（3 strains,2.36%）and B（3 strains,2.36%）,and Ct serovars E,F,D,J and G accounted for 85.02%among all the strains.Synonymous mutations were identified in 14 out of the 127 strains when compared with reference strains. Conclusions E,F,D and G serovars were the main Ct serovars in male patients with urethritis in STD clinic.The proportion of Ct serovar E strain was decreased,but that of serovar J strain was increased compared with 20 years ago.

Chlamydia trachomatis;Urethritis;Genotyping techniques;Outpatients;Major outer membrane protein

Su Xiaohong,Email:suxhong@yahoo.com

蘇曉紅，Email：suxhong@yahoo.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.05.014

美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）資助項(xiàng)目（1-U19-AI084048）

Fund program:National Institutes of Health grant Program（1-U19-AI084048）

2015-12-01）

（本文編輯：吳曉初）