溫斯健 倪娜娜 張韡 宋昊 王小坡 邵雪寶 李阿梅 程偉 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科（溫斯健、張韡、宋昊、王小坡、邵雪寶、李阿梅、程偉、孫建方），中心實(shí)驗(yàn)室（倪娜娜）

組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白1在黑素瘤組織中的表達(dá)及其基因啟動(dòng)子甲基化水平研究

溫斯健 倪娜娜 張韡 宋昊 王小坡 邵雪寶 李阿梅 程偉 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科（溫斯健、張韡、宋昊、王小坡、邵雪寶、李阿梅、程偉、孫建方），中心實(shí)驗(yàn)室（倪娜娜）

目的檢測(cè)組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白1（HINT1）在黑素瘤中的表達(dá)和HINT1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，探討HINT1啟動(dòng)子甲基化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法采用甲基化特異性PCR（MSP）法檢測(cè)56例黑素瘤及瘤旁組織和51例色素痣組織中HINT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，免疫組化法檢測(cè)56例黑素瘤和51例色素痣組織中HINT1蛋白的表達(dá)。結(jié)果MSP顯示，黑素瘤組織、瘤旁組織及色素痣組織中HINT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率分別為76.8%（43/56）、33.9%（19/56）和35.3%（18/51），黑素瘤組HINT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率明顯高于瘤旁組織組和色素痣組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.810、18.749，均P＜0.05），瘤旁組織組與色素痣組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.022，P＞0.05）。免疫組化顯示，56例黑素瘤和51例色素痣組織中分別有12例（21.4%）和42例（82.4%）HINT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)，兩組陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.633，P＜0.01）。12例HINT1蛋白陽(yáng)性的黑素瘤組織中，有6例HINT1基因啟動(dòng)子甲基化，而在44例HINT1蛋白陰性的癌組織中HINT1啟動(dòng)子甲基化率高達(dá)84.1%（37/44），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.147，P=0.013）。56例黑素瘤中，HINT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率在Clark分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)組（59.1%，13/22）與Ⅲ ～Ⅴ級(jí)組（88.2%，30/34）間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.365，P=0.012）。結(jié)論HINT1在黑素瘤組織中低表達(dá)，其機(jī)制可能與啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生高甲基化有關(guān)；HINT1啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能參與黑素瘤的發(fā)生及發(fā)展。

黑色素瘤；甲基化；痣，色素；HINT1基因

組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白1（histidine triad nucleotide?binding protein 1，HINT1）又稱蛋白激酶C相 互 作 用 蛋 白 1（Protein kinase C?interacting protein1，PKCI?1），屬于組氨酸三聚體蛋白超家族，是一種新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，目前多認(rèn)為HINT1失活的主要機(jī)制是啟動(dòng)子甲基化等［1］。鑒于HINT1蛋白在組織中的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與黑素瘤臨床、病理參數(shù)的關(guān)系尚不清楚，本文應(yīng)用甲基化特異性PCR（methylation?specific PCR，MSP）法檢測(cè)56例黑素瘤和瘤旁組織及51例色素痣組織中HINT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)HINT1蛋白水平，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討HINT1啟動(dòng)子甲基化在黑素瘤中的作用。

材料與方法

1.標(biāo)本來源：所有標(biāo)本均來自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所病理科2013—2014年存檔的組織蠟塊或4%甲醛浸泡新鮮組織，其中黑素瘤56例，色素痣51例，均經(jīng)常規(guī)HE染色和（或）免疫組化標(biāo)記后組織病理確診。

2.主要試劑：兔抗人HINT1抗體（英國(guó)abcam公司），DAB酶底物顯色試劑盒和即用型快捷免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），TIANquick FFPE DNA Kit石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒（離心柱型）［天根生化科技（北京）有限公司］，高保真熱啟動(dòng)酶（日本TaKaRa公司），EZ DNA甲基化試劑盒?Gold、人HCT116 DKO甲基化DNA、人 HCT116 DKO非甲基化 DNA（美國(guó)ZymoResearch公司）。

3.標(biāo)本處理：所有4%甲醛固定液中的黑素瘤、瘤旁組織和色素痣標(biāo)本各取30 mg，用手術(shù)刀切為數(shù)塊，置于1.5 ml離心管中，按照TIANquick FFPE DNA Kit石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒說明書操作，提取基因組DNA，紫外分光光度儀檢測(cè)其含量和純度，A260/A280均為1.8～2.0，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｏ鄳?yīng)的黑素瘤和色素痣組織蠟塊以4 μm厚切片，敷貼于10%多聚賴氨酸預(yù)先處理的載玻片上，用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。

4.免疫組化法：石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸高壓修復(fù)6 min，室溫自然冷卻，置于10%過氧化氫溶液中，37℃水浴24 h脫色素。然后按試劑盒說明依次加入一抗HINT1單克隆抗體（工作濃度為1∶250）、二抗孵育反應(yīng)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。觀察指標(biāo)和結(jié)果判定：以細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。已知人結(jié)腸組織陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照。

5.甲基化修飾和MSP擴(kuò)增：取400 ng提取的DNA入EP管并用無核酶水補(bǔ)至20 μl，加CT轉(zhuǎn)換試劑 130 μl，然后參照 EZ DNA Methylation 試劑盒說明進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾甲基化處理，修飾后的DNA于-20℃保存，1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。在http://genome.ucse.edu網(wǎng)站上查找基因啟動(dòng)子區(qū)序列，用CpG Island searcher查找CpG島，用Methyl Primer Express軟件設(shè)計(jì)引物。甲基化引物：MF：5′?GTTGGTCGTATTCGTAGTTTAGGTC ?3′，MR：5?AATAATCTTCCCAAAAATCGTATCG?3′；未甲基化引物：UF：5′?GTTGGTTGTATTTGTAGTTTAGGTTGT?3′，UR：5′?AATAATCTTCCCAAAAATCATATCACC?3′，目的片段大小均為240 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成。對(duì)照組設(shè)置：用已知發(fā)生完全甲基化的DNA（Human HCT116 DKO methylated DNA）為陽(yáng)性對(duì)照，已知完全非甲基化DNA（Human HCT116 DKO Non?methylated DNA）為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各1 μl，甲基化修飾后的 DNA 4 μl，DNA 熱啟動(dòng)酶 0.25 μl，10 × Buffer 2.5 μl，MgCl21.5 μl，dNTP 2 μl，用無核酶水補(bǔ)至25 μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性1 min；94℃變性15 s，57℃退火20 s，72℃延伸20 s，共37個(gè)循環(huán)；72℃后延伸1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察、記錄。僅有甲基化引物擴(kuò)增出相應(yīng)片段即為完全甲基化，僅非甲基化引物擴(kuò)增出相應(yīng)片段為甲基化陰性，甲基化與非甲基化引物均擴(kuò)增出相應(yīng)片段為不完全甲基化，完全甲基化和不完全甲基化均計(jì)為甲基化檢測(cè)陽(yáng)性。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HINT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化：56例黑素瘤組織中HINT1啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為76.8%（43/56），其中20例發(fā)生完全甲基化，23例發(fā)生不完全甲基化，見圖1。56例瘤旁組織中甲基化率為33.9%（19/56），其中8例發(fā)生完全甲基化，11例發(fā)生不完全甲基化。51例色素痣組織中甲基化率為35.3%（18/51），其中6例發(fā)生完全甲基化，12例發(fā)生不完全甲基化。黑素瘤組HINT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率明顯高于瘤旁組織組和色素痣組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.810、18.749，均P＜ 0.05），而瘤旁組織組與色素痣組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.022，P＞ 0.05）。

2.免疫組化HINT1蛋白的表達(dá)：56例黑素瘤組織中HINT1陽(yáng)性12例（21.4%）。12例原位黑素瘤組織中5例HINT1陽(yáng)性，41例侵襲性黑素瘤組織中7例HINT1陽(yáng)性，3例轉(zhuǎn)移性黑素瘤組織未見HINT1陽(yáng)性。51例色素痣中HINT1陽(yáng)性42例（82.4%）。HINT1在黑素瘤組織中的表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于色素痣組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.633，P＜ 0.01）。見圖2。

3.HINT1基因啟動(dòng)子甲基化與其蛋白表達(dá)的關(guān)系：56例黑素瘤組織中，12例HINT1蛋白陽(yáng)性組有6例HINT1基因啟動(dòng)子甲基化，而44例HINT1蛋白陰性組HINT1啟動(dòng)子甲基化率高達(dá)84.1%（37/44），兩組甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.147，P=0.013）。

4.HINT1啟動(dòng)子甲基化與臨床及病理參數(shù)的關(guān)系：56例黑素瘤中，Clark分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)組與Clark分級(jí)Ⅲ～Ⅴ級(jí)組間HINT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.365，P=0.012）。不同性別、有無潰瘍、有無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)組間HINT1基因甲基化狀態(tài)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 黑素瘤HINT1啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳 M：甲基化引物；U：非甲基化引物；1：標(biāo)本1（不完全甲基化）；2：標(biāo)本2（完全甲基化）；3：陽(yáng)性對(duì)照組；4：DNA Marker1；5：DNA Marker2；6：標(biāo)本3（非甲基化）；7：陰性對(duì)照組

表1 黑素瘤HINT1基因甲基化狀態(tài)與臨床及病理參數(shù)的關(guān)系［例（%）］

討 論

表觀遺傳是一種不涉及核苷酸序列變化、可遺傳的基因表達(dá)調(diào)控方式，是較遺傳學(xué)更為常見的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重構(gòu)和非編碼RNA等［2］。其中啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常高甲基化是多種抑癌基因失活的重要機(jī)制。黑素瘤中啟動(dòng)子過甲基化多引起細(xì)胞黏附、促細(xì)胞凋亡、抗細(xì)胞增殖和DNA錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)基因的表 達(dá) 減 少［3］，如 MGMT［4］、RUNX3［5］、ATG5［6］、RASSF1A［7］等。提示啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常高甲基化是黑素瘤發(fā)病的一個(gè)重要分子機(jī)制。

圖2 HINT1在黑素瘤和色素痣中的表達(dá) 2A：在黑素瘤組織中HINT1僅在真皮淺層腫瘤細(xì)胞散在灶狀弱陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化×200）；2B：在皮內(nèi)痣中HINT1呈團(tuán)塊狀強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化×100）

HINT1蛋白共126個(gè)氨基酸，表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，迄今為止的研究均提示它是一個(gè)腫瘤抑制基因。2004年，林彤和孫建方［8］通過cDNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，HINT1基因表達(dá)在黑素瘤患者組織中明顯下調(diào)。隨后，陳柳青等［9］擴(kuò)大組織樣本量并經(jīng)半定量RT?PCR及原位雜交技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，HINT1在黑素瘤中的表達(dá)顯著下調(diào)，初步提示該基因可能與人黑素瘤的發(fā)生有關(guān)。HINT1對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為影響機(jī)制尚不十分明確，多數(shù)研究認(rèn)為，HINT1通過抑制基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路而發(fā)揮腫瘤抑制作用，與CDK7、USF、Pontin/Reptin/β連環(huán)素/TCF4復(fù)合物、AP1相互作用并抑制其活性，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［10］。

免疫組化分析顯示，HINT1在51例色素痣中陽(yáng)性率（82.4%）顯著高于56例黑素瘤中陽(yáng)性率（21.4%）。HINT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在黑素瘤中均下降，表達(dá)趨勢(shì)一致［9］，提示HINT1表達(dá)異?？赡芘c翻譯水平之前調(diào)控異常有關(guān)。進(jìn)一步采用MSP分析發(fā)現(xiàn)，76.8%黑素瘤組織檢測(cè)到HINT1基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化，高于相應(yīng)的瘤旁組織和正常的色素痣組織。而HINT1蛋白陰性的黑素瘤中啟動(dòng)子甲基化率（84.1%）高于HINT1蛋白陽(yáng)性的黑素瘤組織（50%），HINT1基因甲基化與其蛋白表達(dá)可能呈負(fù)相關(guān)。此結(jié)果與Zhang等［1］在原發(fā)性肝癌中和Huang等［11］在胃癌細(xì)胞株及人胃癌組織中對(duì)HINT1的研究結(jié)果相似。推測(cè)DNA甲基化是一可逆過程，是腫瘤發(fā)生過程中的早期事件，可能是因?yàn)樵摶騿?dòng)子區(qū)高甲基化，導(dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄受阻，進(jìn)一步影響到蛋白的表達(dá)，是黑素瘤中HINT1蛋白失活的重要機(jī)制。

本研究還發(fā)現(xiàn)，HINT1的甲基化與黑素瘤患者的病理Clark分級(jí)密切相關(guān)。Clark分級(jí)Ⅲ～Ⅴ級(jí)的黑素瘤組織中HINT1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率（88.2%）顯著高于Clark分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)的黑素瘤組織（59.1%）。Clark分級(jí)是黑素瘤預(yù)后因素中的重要部分，該結(jié)果提示，HINT1基因啟動(dòng)子甲基化可能與黑素瘤進(jìn)展有關(guān)，或可作為黑素瘤預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)之一。此外，不同性別、有無潰瘍、有無炎細(xì)胞浸潤(rùn)與HINT1基因甲基化無關(guān)。黑素瘤組織HINT1的陽(yáng)性率21.4%，表達(dá)顯著下調(diào)，陽(yáng)性病例少，因此未對(duì)陽(yáng)性病例按腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率及染色強(qiáng)度行半定量分析以及相關(guān)臨床病理分析，下一步可考慮擴(kuò)大樣本后再深入分析。

總之，HINT1在黑素瘤組織中低表達(dá)，與其啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生高甲基化有關(guān)，HINT1啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能參與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展。

［1］ Zhang YJ,Li H,Wu HC,et al.Silencing of Hint1,a novel tumor suppressor gene,by promoter hypermethylation in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Lett,2009,275（2）:277 ?284.DOI:10.1016/j.canlet.2008.10.042.

［2］Kubota T,Miyake K,Hirasawa T,et al.Novel etiological and therapeutic strategies for neurodiseases:epigenetic understanding of gene?environment interactions［J］.J PharmacolSci,2010,113（1）:3?8.

［3］Greenberg ES,Chong KK,Huynh KT,et al.Epigenetic biomarkers in skin cancer［J］.Cancer Lett,2014,342（2）:170 ?177.DOI:10.1016/j.canlet.2012.01.020.

［4］Hassel JC,Sucker A,Edler L,et al.MGMT gene promoter methylation correlates with tolerance of temozolomide treatment in melanoma but not with clinical outcome［J］.Br J Cancer,2010,103（6）:820?826.DOI:10.1038/sj.bjc.6605796.

［5］Kitago M,Martinez SR,Nakamura T,et al.Regulation of RUNX3 tumor suppressor gene expression in cutaneous melanoma［J］.Clin Cancer Res,2009,15（9）:2988?2994.DOI:10.1158/1078?0432.CCR?08?3172.

［6］Liu H,He Z,von Rütte T,et al.Down?regulation of autophagy?related protein 5（ATG5）contributes to the pathogenesis of early?stage cutaneous melanoma［J］.SciTransl Med,2013,5（202）:202ra123.DOI:10.1126/scitranslmed.3005864.

［7］Yi M,Yang J,Chen X,et al.RASSF1A suppresses melanoma development by modulating apoptosis and cell?cycle progression［J］.J Cell Physiol,2011,226（9）:2360?2369.DOI:10.1002/jcp.22568.

［8］林彤,孫建方.運(yùn)用cDNA芯片技術(shù)對(duì)惡性黑素瘤相關(guān)基因的研究［J］.中華皮膚科雜志,2004,37（2）:65?67.DOI:10.3760/j.issn.0412?4030.2004.02.001.Lin T,Sun JF.Study on melanoma gene expression profile by cdnamicroarray［J］.Chin J Dermatol,2004,37（2）:65?67.DOI:10.3760/j.issn.0412?4030.2004.02.001.

［9］陳柳青,林彤,曾學(xué)思,等.組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白1 mRNA在良惡性黑素細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)［J］.中華皮膚科雜志,2006,39（3）:134?136.DOI:10.3760/j.issn.0412?4030.2006.03.005.Chen LQ,Lin T,Zeng XS,et al.Expression of HINT/PKCI?1 mRNA in patients with malignant melanoma and nevus［J］.Chin J Dermatol,2006,39（3）:134?136.DOI:10.3760/j.issn.0412?4030.2006.03.005.

［10］黨永輝,劉仲偉,陳峰,等.三聯(lián)組氨酸核苷酸結(jié)合蛋白1與人類疾?。跩］.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),2014,36（4）:454?460.DOI:10.3881/j.issn.1000?503X.2014.04.019.Dang YH,Liu ZW,Chen F,et al.Histidine triad nucleotide?binding protein 1 and human diseases［J］.ActaAcad Med Sin,2014,36（4）:454?460.DOI:10.3881/j.issn.1000?503X.2014.04.019.

［11］Huang H,Wei X,Su X,et al.Clinical significance of expression of Hint1 and potential epigenetic mechanism in gastric cancer［J］.Int J Oncol,2011,38（6）:1557?1564.DOI:10.3892/ijo.2011.994.

HINT1 protein expression and gene promoter methylation in melanoma tissue

Wen Sijian,Ni Nana,Zhang Wei,Song Hao,Wang Xiaopo,Shao Xuebao,Li Amei,Cheng Wei,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wen SJ,Zhang W,Song H,Wang XP,Shao XB,Li AM,Cheng W,Sun JF）;Central Laboratory,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Ni NN）

ObjectiveTo measure histidine triad nucleotide?binding protein 1（HINT1）protein expression and gene promoter methylation,and to analyze the relationship between HINT1 gene promoter methylation and clinical pathological features of melanoma.MethodsFifty?six patients with melanoma and 51 patients with nevus were enrolled as subjects and controls,respectively.Methylation?specific PCR（MSP）was performed to measure the methylation of HINT1 gene promoter in lesional and paratumoral tissue specimens from the patients with melanoma,as well as in lesional specimens from the patients with nevus.Immunohistochemistry was carried out to quantify the expression of HINT1 protein in these tissue specimens.ResultsMSP showed that the methylation rate of HINT1 gene promoter was significantly higher in melanoma tissues than in paratumoral and nevus tissues（76.8%［43/56］vs.33.9%［19/56］and 35.3%［18/51］,χ2=20.810 and 18.749,respectively,bothP＜ 0.05）,but was insignificantly different between paratumoral and nevus tissues（χ2=0.022,P＞ 0.05）.Immunohistochemistry revealed that the expression rate of HINT1 was 21.4%（12/56）in melanoma tissues,compared to 82.4%（42/51）in nevus tissues（χ2=39.633,P＜0.01）.There was a significant difference in the methylation rate of HINT1 promoter between HINT1?positive and ?negative melanoma tissues（6/12vs.37/44［84.1%］,P＜ 0.05）,and between Clark levelⅠ-Ⅱ andⅢ-Ⅴ melanoma tissues（59.1%［13/22］vs.88.2%［30/34］,χ2=6.365，P=0.012）.Conclusions HINT1 protein is lowly expressed in melanoma,which may be associated with high methylation of its gene promoter.Moreover,the high methylation of HINT1 gene promoter may be involved in the initiation and progression of melanoma.

Melanoma;Methylation;Nevus,pigmented;Gene,HINT1

s:Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com;Zhang Wei,Email:ifmtjoel@163.com

孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com；張韡，Email：ifmtjoel@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.07.007

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272992）；2012年高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20121106110040）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131063）；江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)（BL2012003）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）;Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China（20121106110040）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20131063）;Jiangsu Provincial Special Program of Medical Science（BL2012003）

2015?11?09）

（本文編輯：周良佳 顏艷）