Hirulog-s纖溶酶促反應(yīng)動力學(xué)的常數(shù)測定

付　強(qiáng)，張靜怡，胡健力，余　碩，包　斌，戴秋云，吳文惠

(1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上?！?01306；2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京　100071)

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Hirulog-s纖溶酶促反應(yīng)動力學(xué)的常數(shù)測定

付強(qiáng)1，張靜怡1，胡健力1，余碩2，包斌1，戴秋云2，吳文惠1

(1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100071)

Hirulog-s為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院通過對水蛭素結(jié)構(gòu)改造獲得的一種新型合成水蛭肽，其序列為：(D)-FPRP-GK(Stearic acid)-GG-QGDFEPIPEDA-YDE-NH2，Hirulog-s半衰期達(dá)到T1/2=212.2±58.4 min[1]。水蛭素具有間接促進(jìn)尿激酶誘導(dǎo)的纖溶作用[2]，為考察新型水蛭肽Hirulog-s 影響纖溶因子親和性的程度,本文基于單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(pro-uPA)和纖溶酶原(plg)的相互活化作用[3]研究Hirulog-s通過酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)體現(xiàn)出來的纖溶特性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑Hiruolg-s(純度>98%)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑、纖溶酶原、尿激酶、牛血清白蛋白均購自美國Sigma公司，尿激酶發(fā)色底物S-2444購自法國BioMed公司。

實(shí)驗儀器為酶標(biāo)儀(SH-1000 CORONA)。

1.2Hirulog-s 纖溶酶促動力學(xué)參數(shù)測定方法參照黨昕等[4]建立的方法對pro-uPA激活plg成纖溶酶(plm)，plm作用于pro-uPA成尿激酶(uPA)的反應(yīng)進(jìn)行酶促動力學(xué)分析。通過構(gòu)筑不同濃度梯度的plg與pro-uPA反應(yīng)體系，分別加入0、6、12、24、30 μmol·L-1的Hirulog-s(前期實(shí)驗證明為理想活性范圍)，來計算不同濃度Hirulog-s的Km,plm和kcat，pro-uPA值。

2　結(jié)果

在pro-uPA/plg/Hirulog-s反應(yīng)體系中，改變pro-uPA和Hirulog-s的濃度，結(jié)果A405與t是二階多項式的函數(shù)關(guān)系，二次項系數(shù)為A=0.5ε·L·kcat，uPA·v(uPA)，取反應(yīng)初始階段做二次回歸。AHirulog-s→pro-uPA值確定后根據(jù)v(uPA)=2AHirulog-s→pro-uPA/a，計算v(uPA)。進(jìn)行v(uPA)與[pro-uPA]的雙倒數(shù)作圖，經(jīng)過線性回歸后，用斜率除截距得到Km，plm，見Tab 1。

改變plg和Hirulog-s的濃度，同理求出二次項系數(shù)A，確定后根據(jù)v(uPA)=2AHirulog-s→plg/a，求出v(uPA)，再根據(jù)米氏方程v(uPA)=(Vm，plm·[pro-uPA])/(Km，plg+[pro-uPA])，求出不同濃度Hirulog-s影響下的Vm，plm，作Vm，plm-[plg]，經(jīng)線性回歸后，直線斜率即kcat，plm，見Tab 1。

Tab 1　The kinetic constants of

由Tab 1可以看出：隨著Hirulog-s濃度的增加，kcat的值明顯增加，表明Hirulog-s明顯提高了plm的最大催化速率。反應(yīng)中隨著Hirulog-s濃度的增大，plm作用于pro-uPA的Km值逐漸降低，1/Km近似表示酶與底物親和力，這表明Hirulog-s隨著濃度的增加可以緩慢的增強(qiáng)plm對pro-uPA的親和性。

3　討論

由于本實(shí)驗涉及了多個酶促反應(yīng)，在我們的其他實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)利用plm的發(fā)色底物S-2251驗證Hirulog-s對plg及plm的影響時，發(fā)現(xiàn)pro-uPA激活plg的反應(yīng)中其酶促動力學(xué)常數(shù)Km、kcat均處于同一數(shù)量級，所以在計算plm對pro-uPA作用的時候忽略了pro-uPA激活plg反應(yīng)的影響。應(yīng)用本文所述的實(shí)驗方法測定的Hirulog-s對plm作用于pro-uPA反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km系列值低于黨昕等[5]報導(dǎo)的數(shù)值(Km=60.4 μmol·L-1)3個數(shù)量級，說明Hirulog-s的加入明顯增強(qiáng)了反應(yīng)的親和性。反應(yīng)的kcat值低于報導(dǎo)值(kcat=7.31 s-1)，說明纖溶酶原的濃度對反應(yīng)活性影響較大，但是隨著Hirulog-s的加入反應(yīng)活性明顯提高。

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Measuring kinetic constants of enhancing fibrinolysis of Hirulog-s

FU Qiang1,ZHANG Jing-yi1,HU Jian-li1,YU Shuo2,BAO Bin1,DAI Qiu-yun2,WU Wen-hui1

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China;2.InstituteofBiotechnology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

Hirulog-s；合成水蛭肽；纖溶作用；酶促反應(yīng)動力學(xué)；催化常數(shù)；米氏常數(shù)

Hirulog-s；synthetichirudin；fibrinolysis；enzymatic reaction kinetics；catalytic constant；Michaelis constant

時間：2016-9-22 11:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160922.1114.058.html

2016-07-15,

2016-09-10

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81502955)

付強(qiáng)(1991-)，男，碩士生，研究方向：海洋生物資源利用，E-mail: m140208432@st.shou.edu.cn;

吳文惠(1965-)，男，博士，教授，研究方向：海洋生物資源利用，通訊作者，E-mail:whwu@shou.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.029

A

1001-1978(2016)10-1478-02

R341.6；R345；R973.2；R977.3；R977.6