姚新成，張婷，唐輝，陳文

(1.石河子大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 石河子　832000；2.石河子大學(xué) 新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆 石河子　832000)

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大孔吸附樹脂純化新疆兩色金雞菊總皂苷

姚新成1,2，張婷1，唐輝1,2，陳文1,2

(1.石河子大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 石河子832000；2.石河子大學(xué) 新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆 石河子832000)

利用大孔吸附樹脂純化新疆兩色金雞菊總皂苷.采用分光光度法測定總皂苷含量，以靜態(tài)吸附量和解吸率、動態(tài)吸附量和解吸率為指標，選擇合適的大孔吸附樹脂和純化條件.D-101型大孔吸附樹脂對新疆兩色金雞菊總皂苷具有較強的吸附性能和較好的解吸能力.兩色金雞提取液經(jīng)D-101型大孔吸附樹脂處理，可獲得質(zhì)量分數(shù)為(40.53±0.81)%(n=3)的總皂苷部位.D-101型大孔吸附樹脂可有效地純化新疆兩色金雞菊總皂苷.

兩色金雞菊；總皂苷；大孔吸附樹脂

新疆兩色金雞菊又名“雪菊”、“昆侖雪菊”，為菊科金雞菊屬兩色金雞菊(Coreopsis tinctoriaNutt.)的干燥頭狀花序.該植物原產(chǎn)于北美洲干旱內(nèi)陸地區(qū)，在中國主要分布在新疆和田地區(qū)海拔2 300～3 000m的昆侖山區(qū).當?shù)鼐S吾爾族居民常采集其新鮮頭狀花序浸泡當花茶飲用，俗稱“茶菊”；新疆維吾爾醫(yī)院也將其作為一種藥材使用，具有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾等功效[1].

有研究報道，新疆兩色金雞菊中總皂苷的質(zhì)量分數(shù)為8.36%[2].而皂苷類物質(zhì)也是具有一定生物活性和藥效活性的成分[3].在總皂苷的純化方面，常用有機溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、沉淀分離法、色譜分離法等[4].由于大孔吸附樹脂具有物理化學(xué)穩(wěn)定性、吸附容量大、吸附速度快、解吸條件溫和等優(yōu)點，大孔吸附樹脂已被廣泛用于天然植物提取物的純化和分離[5-6].目前，國內(nèi)對新疆兩色金雞菊皂苷的研究報道很少.本研究通過大孔吸附樹脂對新疆兩色金雞菊中總皂苷的純化制備，為綜合利用新疆兩色金雞菊植物資源、探索其多樣的生物活性和作用機制提供科學(xué)依據(jù).

1　儀器與試藥

1.1儀器

BP211D電子分析天平(北京Sartorius)；SHA-B水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)；恒溫水浴鍋(金姚市亞星儀器表有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)；TP300超聲波提取器(北京天鵬電子新技術(shù)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000(上海亞榮生化儀器廠)；UV-2401PC紫外分光光度計(日本島津)；超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；1.0～5.0mL移液器(蘇州BIOHIT).

1.2試藥

高氯酸(HClO4)；濃鹽酸(HCl)；香草醛(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；石油醚、正丁醇、乙醇、乙酸、甲醇(天津富宇精細化工有限公司),各種試劑均為分析純；水為蒸餾水.

AB-8、D-101和NKA-9型大孔吸附樹脂(天津光復(fù)精細化工研究所)；HPD-100、HPD-450、HPD-600和XDA-1型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；DA-201型大孔吸附樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司)；LS-300B型大孔吸附樹脂(藍深樹脂科技有限公司).

齊墩果酸(質(zhì)量分數(shù)>98%)購于中國藥品生物制品檢定所；兩色金雞菊購于新疆和田地區(qū)策勒縣努爾鄉(xiāng)高海拔山區(qū)(2013年11月)，經(jīng)石河子大學(xué)藥學(xué)院李鵬副教授鑒定為菊科金雞菊屬一年生草本植物蛇目菊的干燥頭狀花序.

2　方法與結(jié)果

2.1樣品的制備

兩色金雞菊研碎，稱取100g粉末，用體積分數(shù)55%乙醇(料液比1g∶20mL)超聲波(40kHz,250W)提取2次，每次50min.抽濾，合并2次提取液.使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于55 ℃濃縮，至無醇味.再用石油醚(V(石油醚)∶V(提取濃縮液)=1∶1)進行萃取脫脂.去除石油醚層，用水飽和正丁醇溶液進行1∶1萃取，萃取3次，分取正丁醇層.正丁醇萃取液經(jīng)減壓濃縮，揮至盡干.放入冷凍干燥儀中干燥，得總皂苷提取物.

2.2總皂苷的測定

參照勵娜等[7]的含量測定方法，以齊墩果酸為對照品，于λ=(545±1)nm處測定樣品吸光度A值.根據(jù)齊墩果酸標準對照回歸方程A= 0.026 7 ρ + 0.060 8 (ρ：μg/mL)，r= 0.996 8.計算樣品中總皂苷含量(相當于齊墩果酸含量).

2.3大孔吸附樹脂的篩選

2.3.1大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附-解吸實驗[8-10]

稱取經(jīng)酸堿預(yù)處理好的9種不同極性和孔徑的大孔吸附樹脂(XDA-1，D-101，HPD-100，AB-8，HPD-450，LS-300-B，HPD-600，DA-201，NKA-9)各2.0g(濕質(zhì)量)置于100mL具塞錐形瓶中，分別加入25.0mL提取物溶液(總皂苷質(zhì)量濃度0.3mg/mL).錐形瓶置于恒溫水浴振蕩器中振搖24h，濾過.按2.2節(jié)下的方法測定濾液中總皂苷的質(zhì)量濃度.將濾出的各型號樹脂另置于100mL具塞錐形瓶中，精密加入體積分數(shù)70%乙醇25.0mL，其余操作同上.濾過，得解吸后的濾液.按含量測定方法測定解吸液的總皂苷質(zhì)量濃度.按下式計算9種樹脂的靜態(tài)吸附量、解吸量、吸附率及解吸率.

式中 ρ0為加入樣液中總皂苷質(zhì)量濃度(mg/mL)，ρ1為吸附后樣液中總皂苷質(zhì)量濃度(mg/mL)，ρ2為解吸后樣液中總皂苷質(zhì)量濃度(mg/mL)，V1為吸附液體積(mL)，V2為解吸液體積(mL)，m為濕樹脂質(zhì)量(g).

多項研究表明，大孔吸附樹脂的極性、孔徑、比表面積等性質(zhì)均對需純化的物質(zhì)分離有較大影響，對皂苷的純化效果影響很大.經(jīng)試驗和計算，9種不同型號的大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸實驗結(jié)果見表1.

表1　9種大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸性能Tab.1　Adsorption and desorption capacities of 9 types of macroporous adsorptive resin

由表1測定結(jié)果可知，XDA-1，D-101，HPD-100，AB-8，HPD-450，HPD-600型大孔吸附樹脂對新疆兩色金雞菊總皂苷的吸附率均超過75%以上；但從解吸性能考察D-101，HPD-100，AB-8，HPD-450和HPD-600解吸率均超過80%，其他型號樹脂解吸率卻小于80%.綜合考慮，本實驗選取XDA-1，D-101，HPD-100，AB-8，HPD-450，HPD-600這6種型號樹脂做進一步的動態(tài)吸附-解吸能力考察.

2.3.26種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附-解吸能力考查

稱取酸堿預(yù)處理好的XDA-1、D-101、HPD-100、AB-8、HPD-450、HPD-600型大孔樹脂各2.0g，分別于100mL具塞錐形瓶中.準確加入提取物溶液25.0mL(總皂苷質(zhì)量濃度0.3mg/mL)，置于恒溫振蕩器中振搖.分別于0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0h定時取上清液，測定上清液吸光度值并計算吸附率.同時繪制各型號樹脂的靜態(tài)吸附曲線.另將濾出的各型號樹脂分別置于100mL具塞錐形瓶中，精密加入體積分數(shù)70%乙醇25.0mL，其余操作同上.測定解吸液吸光度值并計算解吸率，繪制各型號樹脂的靜態(tài)解吸曲線.各型號樹脂的靜態(tài)吸附曲線和靜態(tài)解吸曲線結(jié)果見圖1和圖2.

由圖1測定結(jié)果可知，HPD-100型大孔吸附樹脂在3h內(nèi)對總皂苷的吸附率最快；D-101型樹脂次之.2種型號的樹脂均在6h后基本達到吸附平衡狀態(tài).而其他4種型號的樹脂對總皂苷的吸附率上升較平緩，AB-8型樹脂隨著時間的增加吸附率甚至有下降趨勢.由圖2測定結(jié)果可知，D-101型樹脂對總皂苷的解吸率在2h內(nèi)上升最快，HPD-600次之.2種型號的樹脂均在3h后基本達到解吸平衡.

圖1　6種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附曲線Fig.1　Static adsorption curve of six types macroporous adsorptive resin

圖2　6種大孔吸附樹脂的靜態(tài)解吸曲線Fig.2　Static desorption curve of six types macroporous adsorptive resin

2.4D-101型大孔吸附樹脂純化新疆兩色金雞菊提取物中的總皂苷

2.4.1上樣質(zhì)量濃度對D-101型樹脂吸附率的影響[11-12]

稱取5份預(yù)處理好的D-101型樹脂各2.0g，分別置于100mL具塞錐形瓶中.再分別加入總皂苷質(zhì)量濃度為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/mL的供試液25.0mL，置于恒溫振蕩器中振搖吸附7h后，取上清液按2.2項下的測定方法進行測定，計算吸附率.結(jié)果見表2.

表2　不同上樣質(zhì)量濃度對樹脂吸附率的影響Tab.2　Affection of absorption ratio for total saponins in different mass concentrationof sample on D-101 adsorptive resin

由表2結(jié)果可知，當上樣液中總皂苷質(zhì)量濃度為0.9mg/mL時吸附率最高；隨質(zhì)量濃度增大吸附率反而降低，故確定0.9mg/mL為最佳上樣液質(zhì)量濃度.

2.4.2 洗脫溶劑乙醇體積分數(shù)對D-101型樹脂解吸率的影響

稱取6份預(yù)處理好的D-101型樹脂各2.0g，加入總皂苷質(zhì)量濃度為0.9mg/mL的樣品溶液使之吸附平衡7h后，濾過，洗滌表面.取過濾后的樹脂，加入25.0mL體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，置于恒溫振蕩器上解吸7h后，取上清液按2.2項下的測定方法進行測定，計算解吸率.結(jié)果見表3.

表3　不同體積分數(shù)的乙醇洗脫劑對樹脂解吸率的影響Tab.3　Affection of desorption ratio for total saponins in different volume fractionof ethanol eluent on D-101 adsorptive resin

由表3測定結(jié)果可知，當洗脫溶劑乙醇體積分數(shù)為80%時，總皂苷的解吸率最大.因此，選擇體積分數(shù)80%乙醇作為洗脫液.

加速推進潛山市內(nèi)旅游區(qū)域公路與各地高速、鐵路、國道的對接，全力打造開放性的旅游交通網(wǎng)絡(luò)，并加快環(huán)天柱山旅游公路和龍?zhí)?-萬澗旅游公路拓改、積翠谷索道等項目的實施，通過“串點成線”打造全域旅游通道，優(yōu)化城鎮(zhèn)與景區(qū)、景區(qū)與景區(qū)間的交通銜接。

2.4.3D-101型大孔吸附樹脂動態(tài)吸附實驗

稱取預(yù)處理好的D-101型樹脂適量，裝入徑高比為1∶12的玻璃層析柱.將總皂苷質(zhì)量濃度為0.9mg/mL的樣品液上樣，流速控制在20mL/h.按一定的體積收集流出液，并測定每份收集液中總皂苷含量，繪制出樹脂動態(tài)吸附曲線.結(jié)果見圖3所示.

圖3　D-101型樹脂動態(tài)吸附曲線Fig.3　Dynamic adsorption curve of D-101 macroporous adsorptive resin

由圖3測定結(jié)果可知，初始階段流出液中總皂苷含量很小，樹脂的吸附率較高.當上樣體積增加到132mL時有明顯泄漏，并逐漸接近飽和吸附.故確定132mL為最佳上樣量.

2.4.4D-101型大孔吸附樹脂動態(tài)解吸實驗

將上述動態(tài)吸附平衡的樹脂靜置過夜.先用40mL蒸餾水洗去極性較大的水溶性成分，然后用體積分數(shù)80%乙醇以40mL/h的流速進行沖洗柱床.適當?shù)捏w積進行收集，并測定每份收集洗脫液中總皂苷的含量.由此繪制樹脂的動態(tài)解吸曲線.結(jié)果見圖4所示.

由圖4實驗結(jié)果可知,20～30mL解吸液中總皂苷的質(zhì)量濃度達到最大值；當收集洗脫溶劑100mL時解吸液中總皂苷已基本洗脫完全，因此選取100mL為洗脫溶劑用量.

圖4　D-101型樹脂動態(tài)解吸曲線Fig.4　Dynamic desorption curve of D-101 macroporous adsorptive resin

2.5驗證實驗

按最佳條件進行3次平行實驗，即取預(yù)處理好的D-101型樹脂適量裝入層析柱(徑高比1∶12)，將132mL樣品溶液(總皂苷質(zhì)量濃度0.9mg/mL)上樣(流速20mL/h)，吸附平衡后，靜置過夜.先用40mL蒸餾水洗去極性較大的成分，然后用100mL的體積分數(shù)80%乙醇進行洗脫(流速40mL/h)，收集20～80mL洗脫液.洗脫液水浴蒸干，計算總固形物重量.經(jīng)測定固形物中總皂苷質(zhì)量分數(shù)為(40.53±0.81)%(n=3).

3　結(jié)果和討論

本實驗通過比較XDA-1、D101、HPD-100、AB-8、HPD-450、LS-300-B、HPD-600、DA-201、NKA-9等9種類型大孔樹脂對新疆兩色金雞菊總皂苷靜態(tài)和動態(tài)吸附和解吸性能的考察，最終選取性能較好的D-101型大孔樹脂進行實驗和工藝過程優(yōu)化.制備工藝過程經(jīng)多次驗證具有較好的穩(wěn)定性，并能將提取物中總皂苷質(zhì)量分數(shù)由19.26%大幅提高到40.53%.通過大孔吸附樹脂對新疆兩色金雞菊總皂苷的純化制備，可以為總皂苷的相關(guān)藥效學(xué)活性和化學(xué)成分研究提供必要條件.

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

PurificationoftotalsaponinsfromCoreopsistinctoriaNutt.inXinjiangbymacroporousadsorptiveresin

YAOXincheng1,2,ZHANGTing1,TANGHui1,2,CHENWen1,2

(1.SchoolofPharmacy,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China;2.MinistryofEducationKeyLaboratoryofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

ToinvestigatethepurificationprocessoftotalsaponinsfromCoreopsis tinctoriaNutt.usingmacroporousadsorptiveresin.TheassayoftotalsaponinswasdeterminedbyUV-Visspectrophotometry,andtheresinswereselectedusingtheparameters,suchasstaticadsorptioncapacity,desorptionratio,dynamicadsorptioncapacity,andaswellasdynamicdesorptionratio.TheD-101macroporousresinissuitableforpurificationoftotalsaponinsfromCoreopsis tinctoriaNutt.accordingtoitsadsorptionanddesorptionabilityfortotalsaponins.Thetotalsaponinscontentis(40.53±0.81)%(n=3)intotalsolidsthroughD-101macroporousresinpurification.TheD-101macroporousresincanbeusedforpurificationoftotalsaponinsobtainedfromCoreopsis tinctoriaNutt.inXinjiang.

Coreopsis tinctoriaNutt.;totalsaponins;macroporousadsorptiveresin

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.03.005

2015-08-20

新疆生產(chǎn)兵團重點領(lǐng)域科技攻關(guān)項目(2014BA031)；石河子大學(xué)高層次人才科研啟動項目(RCZX201328)；國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2011ZX09401-007)

姚新成(1973—)，男，江蘇睢寧人，石河子大學(xué)副教授，博士，主要從事中藥與天然產(chǎn)物活性研究.

E-mail:yxc@whu.edu.cn

陳文(1967—)，男，湖南益陽人，石河子大學(xué)教授，博士，主要從事藥物制劑及新藥研究.

E-mail:chen-wen2000@126.com

TQ

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