甘草酸18位差向異構體不同配比和濃度對Caco-2細胞P-gp功能的影響

趙燕燕，孫東，劉麗艷，柳亞飛，王靜

( 1.河北大學 化學與環(huán)境科學學院，河北 保定　071002；2.河北大學 藥學院，河北 保定　071002；3.河北大學 醫(yī)學實驗中心，河北 保定　071000)

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甘草酸18位差向異構體不同配比和濃度對Caco-2細胞P-gp功能的影響

趙燕燕1,2，孫東1，劉麗艷3，柳亞飛1，王靜1

( 1.河北大學 化學與環(huán)境科學學院，河北 保定071002；2.河北大學 藥學院，河北 保定071002；3.河北大學 醫(yī)學實驗中心，河北 保定071000)

研究甘草酸18位差向異構體18α-甘草酸(18α-Gly)與18β-甘草酸(18β-Gly)不同配比和濃度對結腸癌(Caco-2)細胞P-糖蛋白(P-gp)功能的影響，選擇最佳濃度比例.建立細胞模型，選擇甘草酸總濃度為1∶10∶30∶60∶120∶240 μmol/L，18α-Gly與18β-Gly物質的量比分別為10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10，根據細胞存活率，選擇合適濃度比例，利用流式細胞儀測定細胞內熒光強度，尋找熒光強度最大的濃度比，即對P-gp抑制作用最強，P-gp功能最弱.研究結果表明甘草酸總濃度為1 μmol/L時，隨著18α-Gly比例的減少，熒光強度逐漸減弱，P-gp誘導作用逐漸增加.甘草酸總濃度為10 μmol/L和60 μmol/L時，隨著兩者物質的量比的變化，熒光強度變化明顯；當總濃度為10 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6時，熒光強度較強，抑制作用明顯；當總濃度為60 μmol/L，兩者物質的量比為5∶5時熒光強度最強，抑制作用最強.

18α-甘草酸；18β-甘草酸；P-糖蛋白功能；Caco-2細胞；不同配比/濃度

甘草是一味重要的傳統(tǒng)中草藥，甘草酸是甘草中最主要的活性成分，具有解毒、消炎、抗病毒、抗癌、免疫調節(jié)、降血脂等多方面藥理作用[1].18位H的立體構型不同，使甘草酸存在2種差向異構體，即18α-甘草酸(18α-glycyrrhizin，18α-Gly)和18β-甘草酸(18β-glycyrrhizin，18β-Gly).兩者空間構型存在微小差異，但在藥理學、藥效學、藥代動力學及不良反應等方面卻有著顯著不同[2].近年來，其在抗SARS病毒[3]和抗HIV病毒[4]活性方面的重要作用，使得18α-Gly和18β-Gly的比較研究越來越受到國內外研究者的關注[5-9].

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一種能量依賴性蛋白，通過轉運作用降低細胞內化合物濃度，減輕了藥物的不良反應，同時也降低了藥物對細胞的作用，使藥效降低，產生耐藥現(xiàn)象[10]；同時，P-gp的表達水平的變化，可影響藥物的吸收、分布、代謝、排泄和毒性[11].近年來研究表明，18α-Gly和18β-Gly在細胞膜上的轉運表現(xiàn)出一定的立體選擇性，對P-gp功能和表達的影響分別表現(xiàn)為抑制作用和誘導作用，2種異構體的影響截然相反.目前國內外在轉錄水平和細胞膜轉運方面對甘草酸的研究，僅限于18α-Gly和18β-Gly單體分別對CYP3A表達或P-gp功能和表達的影響[12-13]，尚未見不同比例的18α-Gly和18β-Gly混合物在此方面的研究.上市制劑眾多，大部分制劑為18α-Gly和18β-Gly混合物，二者所占比例各不相同[5]，現(xiàn)有各國藥典及其質量標準中尚沒有對2種異構體的組成比例做出規(guī)定.本實驗就2種甘草酸差向異構體不同配比和濃度對Caco-2細胞P-gp功能的影響進行了研究，為新制劑的研發(fā)，臨床用藥選擇，以及相關藥物的研究與開發(fā)提供依據和新的研究思路.

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

C6流式細胞儀(美國BD公司)；ELX800酶標儀(美國寶特公司)；CKX41型倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)；BHC-1300ⅡA/B3超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；Allegar X-22R Centriguge低溫高速離心機(美國BECKMAN)；MCO-18AIC恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋設備有限公司)；MLS-3780型高壓滅菌鍋(日本三洋設備有限公司)；WZD-160型微量振蕩器(上海創(chuàng)發(fā)電子科技有限公司)；移液槍(美國GIBCO)；25 cm2培養(yǎng)瓶(美國Costar Corning)；75 cm2培養(yǎng)瓶(美國Costar Corning)；96孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning Costar)；吸管.

Caco-2細胞(30代，購自中國武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心)；胎牛血清(美國GIBCO，批號：141104)；100 U/mL青-鏈霉素雙抗(碧云天生物技術研究所，批號：423A0522)；丙酮酸鈉(美國MERCK，批號：HG3-1166-78)；Eagle’s minimum essential medium (MEM) 培養(yǎng)基(美國GIBCO，批號：1460618)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma-Aldrich，批號：0231)；噻唑藍(MTT)(中國藥品生物制品檢定所，批號：0793)；羅丹明123(中國Solarbio，批號：1015A053)；Hepes鹽(中國Solarbio，批號：710130411)；18α-Gly對照品(18α，20β-glycyrrhizic acid，ALPS制藥，批號：10B001S)；18β-Gly對照品(18β，20β-glycyrrhizinic acid，ALPS制藥，批號：05C11S).

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

MEM培養(yǎng)基制備：取1袋MEM培養(yǎng)基，稱取HEPES 鹽2.38 g和丙酮酸鈉0.11 g，用800 mL去離子水溶解稀釋，磁力攪拌3 h，加入Na2CO32.00 g，加入200 mL去離子水，磁力攪拌1 h，調pH為7.2～7.4，然后用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝，4 ℃保存.

胰蛋白酶制備：稱取胰蛋白酶0.25 g，EDTA-Na 0.30 g，NaCl 0.8 g，KCl 0.04 g，葡萄糖0.1 g，苯酚紅0.000 5 g，加入100 mL去離子水溶解，磁力攪拌2～3 h，調pH為7.8～8.0，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝，-20 ℃保存.

凍存液制備：全培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO 3者體積比為7∶2∶1.用前配制.

羅丹明123溶液配制：精確稱取0.38 mg羅丹明123，用400 μL PBS溶解，備用.使用時用PBS稀釋到500 μmol/L和0.550 0 μmol/L.

MTT溶液制備：稱取250 mg MTT，溶于50 mL PBS，磁力攪拌30 min，0.22 μm微孔濾器過濾除菌，分裝至1.5 mL EP管，4 ℃避光保存，保質期為2周.

細胞培養(yǎng)及形態(tài)學觀察：Caco-2細胞以2×105/mL接種于25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，加入體積分數10% FBS的MEM培養(yǎng)基6 mL和0.1 U/L青霉素-鏈霉素雙抗.將細胞置于37 ℃、體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，細胞換液，在第4天，細胞長到80%～90%時，用質量分數0.1%的胰蛋白酶消化并傳代，當細胞生長到30～50代時用于實驗.

1.2.218α-Gly和18β-Gly不同配比和濃度對Caco-2細胞毒性的考察

將處于對數生長期的Caco-2細胞以2×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔終體積為200 μL，放入37 ℃、體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.18β-Gly用DMSO(終體積分數<1%)溶解，18α-Gly用MEM培養(yǎng)基溶解，并加入等量的DMSO，用MEM培養(yǎng)基稀釋，使甘草酸最終總濃度均為1、10、30、60、120、240 μmol/mL，兩者物質的量比為10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10；將每孔培養(yǎng)24 h后細胞培養(yǎng)液吸盡，于陰性對照孔加入培養(yǎng)基和溶劑DMSO，實驗孔加入不同配比和濃度的18α-Gly和18β-Gly混合液，每孔中DMSO含量相等；空白調零孔為不含細胞的完全培養(yǎng)基，放入37 ℃、體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h.每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，放入37 ℃、體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使結晶物溶解.以空白對照孔調零后，測量490 nm處的吸光度(A)(實驗平行重復3次).計算細胞的存活率，觀察各濃度細胞的存活狀況.

細胞存活率=(實驗組平均吸光度值/陰性對照組平均吸光度值)×100%.

選取細胞存活率≥90%的藥物配比和濃度，進行下一步非細胞毒性實驗.

1.2.318α-Gly和18β-Gly不同配比和濃度對P-糖蛋白功能影響的考察

依據“1.2.2”實驗結果和文獻[14-15]，選取18α-Gly 和18β-Gly總濃度為60、10、1 μmol/mL高中低3個濃度，在實驗孔中分別加入以上3個濃度18α-Gly和18β-Gly不同配比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)的混合液.將處于對數生長期的Caco-2細胞用0.1 mol/L胰酶消化，用含體積分數10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基重懸為單細胞懸液，進行細胞計數，離心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，棄上清液，用PBS分散成1×106/mL的細胞懸液，接種于2 mL的EP管中.離心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，棄上清液，按實驗分組分別在實驗孔加入高中低濃度的不同配比的18α-Gly和18β-Gly混合液，將細胞置于37 ℃、體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min.置冰上終止作用(約10 min)，離心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，棄上清液，用冰冷的PBS洗2次，離心(4 ℃，2 500 r/min，5 min)，棄上清液.按實驗分組加入Rh-123或PBS，將細胞置于37 ℃、體積分數5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，置冰上終止作用(約10 min)，離心(4 ℃，2 500 r/min，5 min)，棄上清液，冰冷的PBS清洗2次，離心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，棄上清液，加0.5 mL PBS輕輕吹打，制成單細胞懸液.具體分組見表1.

流式細胞儀選擇F1通道，每次采集1萬個細胞，檢測細胞內Rh-123平均熒光強度，分析時設門以除去細胞碎片和細胞團對實驗的干擾.

表1　18α-Gly與18β-Gly不同配比和濃度對P-糖蛋白功能影響分組Tab.1　Groups of the different proportion and concentration of 18α-Gly and 18β-Gly effect on P-gp function

1.2.4統(tǒng)計學處理

2　結果與討論

2.1細胞培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

細胞傳代于25 cm2培養(yǎng)瓶中，很快開始貼壁，48 h換液，再經48 h細胞貼壁80%～90%.在倒置相差顯微鏡下觀察，Caco-2細胞成鋪路石狀鑲嵌排列，形態(tài)正常，與文獻報道[16]相似，見圖1.

a.消化后的細胞；b.細胞形態(tài).圖1　消化后的細胞和細胞形態(tài)Fig.1　Digestion cell and the morphology cell

2.218α-Gly和18β-Gly不同配比和濃度對Caco-2細胞毒性的考察

實驗分別考察了18α-Gly和18β-Gly不同配比和濃度對Caco-2細胞的毒性.結果表明，甘草酸總濃度一定時，18α-Gly和18β-Gly比例不同對細胞存活率影響不同.在7種不同配比的條件下，甘草酸總濃度在1～60 μmol/L，細胞存活率均大于90%，為非細胞毒性濃度.其中當甘草酸總濃度在1～30 μmol/L，n(18α-Gly)：n(18β-Gly)=8∶2時，以及總濃度為60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6時，細胞總體存活率表現(xiàn)較高(>110%)，見圖2 a、b、c、d；總濃度在120～240 μmol/L內，18α-Gly和18β-Gly在7種不同配比的條件下，細胞存活率均小于90%，為細胞毒性濃度.隨著濃度增加，毒性表現(xiàn)增強，見圖2 e、f.因此選取甘草酸總濃度分別為1、10、60 μmol/L，18α-Gly和18β-Gly物質的量比分別為10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10進行下一步研究.

甘草酸總濃度(μmol/L)分別為a.1;b.10;c.30;d.60;e.120;f.240.圖2　18α-Gly與18β-Gly不同配比和濃度對Caco-2細胞存活率的影響Fig.2　Different proportion and concentration of 18α-Gly and 18β-Gly effect on the cell survival rate

2.318α-Gly和18β-Gly不同配比和濃度對P-gp功能影響的考察

實驗分別考察了18α-Gly與18β-Gly總濃度(1、10、60 μmol/L)及不同配比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)混合液對Caco-2細胞內P-gp轉運Rh-123的影響，見表2.結果表明，18α-Gly單體濃度為10 μmol/L和60 μmol/L時，細胞內Rh-123攝取量增多，與陰性對照相比熒光強度增強，對P-gp功能表現(xiàn)出抑制作用；18β-Gly單體濃度為1、10、60 μmol/L時，細胞內Rh-123攝取量減少，與陰性對照相比熒光強度減弱，對P-gp功能表現(xiàn)出誘導作用，見圖3.

甘草酸總濃度為1 μmol/L時，隨著18α-Gly與18β-Gly 2種異構體比例的減小，熒光強度逐漸減弱，誘導作用逐漸增強；在濃度為10 μmol/L，二者物質的量比為4∶6時，以及濃度為60 μmol/L，物質的量比為5∶5時，熒光較強，抑制作用明顯，見圖3.

表2　18α-Gly與18β-Gly不同配比和濃度對Caco-2細胞內Rh-123熒光強度的影響(n=3)Tab.2　Different proportion and concentration of 18α-Gly and 18β-Gly effect on the fluorescence intensity of Rh-123 in Caco-2 cells (n=3)

圖3　18α-Gly與18β-Gly不同配比和濃度對Caco-2細胞內Rh-123聚積作用比較Fig.3　Different proportion and concentration of 18α-Gly and 18β-Gly effect on Rh-123 accumulation compared with the control group in Caco-2 cells

甘草酸由于C18位H構型不同，存在2種立體異構體，18α-Gly為反式構型，18β-Gly為順式構型，根據位阻效應，前者大于后者，易于受體蛋白結合，導致兩者比例不同時，甘草酸的藥效不同.甘草酸2個差向異構體雖然在自然界、制劑中或在體內很難發(fā)生差向異構化，但在一定的化學條件下能發(fā)生構型的改變.本實驗前期工作中已經研究了不同的炮制條件對甘草藥材中主成分異構體的含量及比例的影響[17]，結果表明，生甘草中18α-Gly與18β-Gly的物質的量比始終為1∶7，未發(fā)現(xiàn)炮制條件的變化，對甘草酸2個差向異構體比例的影響.并對國內外上市的4代甘草酸制劑中主成分18α-甘草酸和18β-甘草酸進行了含量測定[5]，對同一代制劑不同劑型、不同代制劑同一劑型中兩差向異構體的組成比例進行了分析.結果表明，甘草酸制劑不同，18α-Gly與18β-Gly所占比例各不相同，第1代與第2代、第3代與第4代甘草酸不同劑型制劑中，18α-Gly與18β-Gly的物質的量比分別為1∶20～1∶109、3∶1～500∶1.甘草酸上市制劑眾多，各制劑選用的原料藥不同以及采取的制劑工藝不同，都可能會導致甘草酸制劑中主成分差向異構體組成比例的不同.

從天然產物中提取、精制18β-Gly比較簡單，成本比較低，而直接合成18α-Gly成本高，多數廠家選用由前者轉化的方式制造18α-Gly.目前市售的甘草酸制劑的主成分均以18α-Gly與18β-Gly混合物的形式存在，以α體占主體的第4代甘草酸制劑-異甘草酸鎂，也含有少量的18β-Gly (n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=500∶1[5]).所以研究甘草酸18位差向異構體18α-甘草酸(18α-Gly)與18β-甘草酸(18β-Gly)不同配比和濃度對結腸癌(Caco-2)細胞P-糖蛋白(P-gp)功能的影響，對新制劑的研發(fā)和臨床用藥選擇具有重要的意義.

P-gp可以將細胞內的藥物泵出細胞外，從而降低細胞內的藥物濃度，減輕細胞的毒副作用，保護機體免受外源毒素作用，這也是導致腫瘤細胞出現(xiàn)耐藥性的重要原因.Caco-2細胞來源于人類結腸癌及直腸癌，P-gp是其中的一種主要轉運蛋白.Rh-123是P-gp的特異性底物，可以用來評價P-gp的功能活性，當P-gp功能受抑制時，Rh-123從Caco-2細胞的外排量將減少.

18β-Gly甘草可以通過誘導P-gp功能以加速藥物排出細胞外，起到解毒的作用，而18α-Gly對于P-gp的抑制作用，則可以減弱細胞外排，使藥物在細胞內發(fā)揮最大藥效.誘導和抑制作用，對于其他治療藥物的輔助作用非常大，可以使藥物發(fā)揮最大藥效同時，對機體的毒性降到最低，因此尋找合適的濃度比例非常重要.

本實驗首先培養(yǎng)Caco-2細胞模型，配制甘草酸總濃度為1、10、30、60、120、240 μmol/L 6個濃度系列，18α-Gly與18β-Gly比例分別為10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10，通過毒性實驗，選擇了1，30，60 μmol/L作為低中高3個濃度系列，用流式細胞儀測定細胞內Rh-123熒光強度，判斷P-gp的功能活性，從而推斷甘草酸合適的濃度比，最終得出在總濃度為60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=5∶5時，熒光最強，細胞的外排作用最弱，細胞內藥物最多，抗藥性最弱.

實驗結果表明，甘草酸的作用強度及安全性與18α-Gly和18β-Gly的濃度和比例有關.通過甘草酸總濃度(1、10、60 μmol/L)及不同配比物質的量比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)的混合液對Caco-2細胞內P-gp轉運Rh-123作用影響的比較研究，在濃度為60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=5∶5時，熒光強度最強，對Caco-2細胞內P-gp抑制作用最強，對于藥物外排最弱，可減弱抗藥性，可能是18α-GL和18β-Gly發(fā)揮最大協(xié)同作用的的最佳濃度配比.具體作用機制尚需進一步研究.

[1]ABE M，AKBAR F，HASEBE A，et al.Glycyrrhizin enhances interleukin-10 production by liver dendritic cells in mice with hepatitis[J].J Gastroenterol，2003，38(10)：962-967.

[2 ]宋紅波，劉茜，趙輝，等.甘草酸銨類制劑中甘草酸差向異構體的分析[J].藥物分析雜志，2012，32(5)：883-886.

SONG Hongbo，LIU Qian，ZHAO Hui，et al.Analysis of 2 epimers in ammonium glycyrrhizinate drugs[J].China J Pharm Anal，2012，32(5)：883-886.

[3]CINML J，MORGENSTEM B，BAUER G，et al.Glycyrrhizin，all active component of liquorice roots，and replication of SARS-associated coronavirus[J].Lancet，2003，361(9374)：2045-2046 DOI：10.1016/S0140-6736(03)13615-X.

[4]PLIASUNOVA OA，HONA，KISELEVA I，et al.The anti-HIV activity of glycyrrhizic acid penta-O-nicotinate[J].Vestn Ross Akad Med Nauk，2004(11)：42-46.

[5]趙燕燕，石敏健，劉麗艷，等.4代甘草酸制劑主成分異構體及雜質含量差異分析與變化趨勢[J].藥物分析雜志，2014，34(2)：247-254.

ZHAO Yanyan，SHI Minjian，LIU Liyan，et al.Analysis of content differences and variation trends of the principal component isomers and related substances in the four generations of glycyrrhizin preparations[J].Chin J Pharm Anal，2014，34(2)：247-254.

[6]ZOU Q G，WEI P，LI J，et al.Simultaneous determination of 18a-and18β-glycyrrhetic acid in human plasma by LC-ESI-MS and its application to pharmacokinetics[J].Biomed Chromatogr，2009，23：54-62.

[7]楊柏燦，潘穎宜.甘草“調和”的影響因素探析[J].中成藥，2013，35(1)：155-156.

YANG Bocan，PAN Yingyi.Influence factors analysis of licorice “reconciliation”[J].Chinese Traditional Patent Medicine，2013，35(1)：154-156.

[8]周倩，孫立立.蜜炙對甘草化學成分影響研究[J].中國藥學雜志，2013，48(10)：768-772.

ZHOU Qian，SUN Lili.Changes of chemical constituents in radix glycyrrhizae before and after honey processing[J].Chin Pham J，2013，48(10)：768-772.

[9]席先蓉，陳慶.正交設計研究甘草蜜制工藝[J].中國中藥雜志，2001，26(7)：460-462.

XI Xianrong，CHEN Qing.Research of licorice honey processing with Orthogonal design[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2001，26(7)：460-462.

[10]LAURETTA M S CHAN，SIMON LOWES，BARRY H HIRST.The ABCs of drug transport in intestine and liver：efflux proteins limiting drug absorption and bioavailability[J].Eur J Pharm Sci，2004，21(1)：25-51.DOI：10.1016/j.ejps.2003.07.003.

[11]LIN J H.Drug-drug interaction mediated by inhibition and induction of P-glycoprotein[j].Adv Drug Dev，2003，55：1:53.

[12]王宇光，楊明會，馬增春，等.18β-甘草酸和18α-甘草酸對大鼠原代肝細胞CYP3A酶表達的影響[J].中國中藥雜志，2009，34(3)：307-311.

WANG Yuguang，YANG Minghui，MA Zengchun，et al.Effects of 18β-glycyrrhizic acid and 18α-glycyrrhizic acid on mRNA and protein expression of cytochrome P450 3A in cultured rat primary hepatocyte[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2009，34(3)：307-311.

[13]顏苗，李蘭芳，李煥德，等.18α-甘草酸和18β-甘草酸對Caco-2細胞P-gp功能和表達的影響[J].中國中藥雜志，2012，37(1)：99-103.

YAN Miao，LI Lanfang，LI Huande，et al.Effect of 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid on P-gp function and expression in Caco-2 cells[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2012，37(1)：99-103.

[14]SUN Li，SHEN Jingfang，PANG Xiaoyun，et al.Phase I safety and pharmacokinetic study of magnesium isoglycyrrhizinate after single and multiple intravenous doses in Chinese healthy volunteers[J].J Clin Pharmacol，2007,47(6)：767-773 DOI：10.1177/0091270007299757.

[15]張喜全，夏萬光，萬順之.天晴甘美[J].中國新藥雜志，2006，15(16)：1409-1410.

[16]孫敏捷，盛星，胡一橋.Caco-2細胞單層模型的建立與驗證[J].中國藥學雜志，2006，41(18)：1431-1434.

[17]趙燕燕，李楊，劉麗艷，等.甘草炮制條件對18α-Gly和18β-Gly含量及比例的影響[J]:河北大學學報(自然科學版)，2015，35(2):138-146.DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.006.

ZHAO Yanyan，LI Yang，LIU Liyan，et al.Effects of licorice processing conditions on content and proportion of 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid[J].Journal of Hebei University(Naturnal Science Edition)，2015，35(2)：138-146.DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.006.

(責任編輯：梁俊紅)

Different proportion and concentration of Glycyrrhizic acid -18-epimers effect on P-gp function in Caco-2 cells

ZHAO Yanyan1，2,SUN Dong1,LIU Liyan3,LIU Yafei1,WANG Jing1

(1.College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China;2.College of Pharmaceutical Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;3.Experimental Center of Medicine,Hebei University,Baoding 071000,China)

To evaluate the effect of glycyrrhizic acid 18 epimers,18α-glycyrrhizic acid (18α-Gly) and 18β-glycyrrhizic acid (18β-Gly) at different proportion and concentration on the P-glycoprotein (P-gp) activity in colon cancer Caco-2 cell to select their appropriate concentration and proportion in use.Making a cell model,selecting the total glycyrrhizic acid concentration of 1,10,30,60,120,240 μmol/L and proportion of 10∶0,8∶2,6∶4,5∶5,4∶6,2∶8,0∶10,determining their optimum concentration and proportion by cell survival rate,and detecting the maximum fluorescence value by flow cytometer,that is,thestrongest inhibitory effect of P-gp and its weakest function.When the concentration of glycyrrhizic acid was 1 μmol/L,the fluorescence intensity became gradually weak and its induction fuction was strengthed gradually with the reduction in proportion of 18α-Gly.When the concentration of glycyrrhizic acid was 10 μmol/L and 60 μmol/L,the fluorescence intensity changed significantly.When the concentration of glycyrrhizic acid was 10 μmol/L and their proportion wasn(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6,the fluorescence intensity became stronger and its inhibitory effect was remarkable.When the concentration of glycyrrhizic acid was 60 μmol/L and their proportion wasn(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=5∶5,the fluorescence intensity was the highest,and the strongest inhibitory effect of P-gp appeared.

18α-glycyrrhizic acid;18β-glycyrrhizic acid;P-glycoprotein;Caco-2 cell;different proportion/ concentration

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.03.006

2015-10-08

河北省自然科學基金資助項目(H2013201203)；河北大學醫(yī)學學科專項資金建設項目(2014A1003)

趙燕燕(1960—)，女，天津人，河北大學教授，主要從事藥學以及將現(xiàn)代分離技術用于臨床、藥學、食品、環(huán)境等方面的研究.E-mail：zhaoyany606@tom.com

R285.5

A

1000-1565(2016)03-0249-08