槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

張佳君，厲新新，陳寶石，劉麗娟

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槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

張佳君，厲新新，陳寶石，劉麗娟

the Second Ward of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001, Heilongjiang Province, China

?METHODS: RPE cells were subculture, and they were divided into negative control group: cultured with normal culture medium; oxidative injury group: 100 μmol/L H2O2treated for 12h; quercetin low dose group: 100 μmol/L quercetin incubated for 24h then treated with 100 μmol/L H2O2for 12h; and quercetin high dose group: 100 μmol/L quercetin incubated for 24h then treated with 100 μmol/L H2O2for 12h. Cell viability were tested by MTT colorimetric detection, apoptosis rate was detected by flow cytometry, apoptotic cell morphology was observed by Hochest33258 staining, expression of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were tested by colorimetric detection.

?RESULTS: Quercetin inhibited H2O2-induced cell viability decreased in RPE cells, after treated with different concentrations of quercetin, RPE cells activity increased to (79.67±4.98)% and (83.00±3.60)%, which had statistical significance difference compared with oxidative damage group (48.93±3.39)% (P<0.05). After treated with different concentrations of quercetin, the apoptosis rate of RPE cells decreased to (23.23±3.29)% and (16.23±1.94)%, respectively, which had statistical significance difference compared with oxidative damage group (38.03±4.76)% (P<0.05). In addition, quercetin also increased the expression of CAT、SOD、GSH-Px in RPE cells, which had statistical significance difference compared with oxidative damage group.

?CONCLUSION:Quercetin effectively inhibited H2O2-induced RPE cells damage by improving cell antioxidant enzyme activity, which provide reliable experimental basis for the treatment of injuries in RPE cells.

目的:探討槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retina pigment epithelium，RPE)氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

方法：RPE細(xì)胞傳代培養(yǎng)，分為陰性對(duì)照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；氧化損傷組：100μmol/L的H2O2作用12h；槲皮素低濃度組：100μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h；槲皮素高濃度組：500μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h。MTT比色法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，Hochest33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)，比色法檢測細(xì)胞中過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性。

結(jié)果：槲皮素能明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞活力的下降，用不同濃度槲皮素處理后，RPE細(xì)胞活性分別提高到79.67%±4.98%和83.00%±3.60%，與氧化損傷組(48.93%±3.39%)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)不同濃度槲皮素處理后，RPE細(xì)胞凋亡率分別下降至23.23%±3.29%和16.23%±1.94%，與氧化損傷組(38.03%±4.76%)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；此外，槲皮素還能增加細(xì)胞中CAT、SOD、GSH-Px活性，與氧化損傷組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

結(jié)論：槲皮素通過改善細(xì)胞中抗氧化酶活性有效抑制了H2O2對(duì)RPE細(xì)胞的損傷，從而為其用于治療RPE細(xì)胞損傷提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

槲皮素；視網(wǎng)膜色素上皮；過氧化氫酶；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶

引用：張佳君，厲新新，陳寶石，等.槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用.國際眼科雜志2016;16(11):2010-2013

0　引言

糖尿病患者因糖代謝障礙導(dǎo)致全身各組織器官的微血管發(fā)生病變，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]。研究表明，氧化應(yīng)激與DR的發(fā)生密切相關(guān)。視網(wǎng)膜色素上皮層位于視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層之間，由單層排列的RPE細(xì)胞構(gòu)成，當(dāng)收到外界各種因素刺激時(shí)，容易導(dǎo)致生理功能的破壞，是DR最早受損傷的靶組織[2]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)MDR發(fā)生機(jī)制，體外建立RPE細(xì)胞氧化損傷模型，對(duì)比分析不同濃度的槲皮素干預(yù)RPE細(xì)胞后細(xì)胞活力以及相關(guān)因子表達(dá)的變化，并進(jìn)一步探討其細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，為其用于防治DR提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料槲皮素(美國Sigma公司，批號(hào) PHR1488，分子量 302.24 )，人RPE細(xì)胞株(美國ATCC，批號(hào)CRL-4000)，30% H2O2(天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20131016)，DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，批號(hào)D0819)，胎牛血清(Sigma公司，批號(hào)12107C)，MTT試劑盒(Sigma公司，批號(hào)M2128)，Annexin V FITC/PI(美國BD公司，批號(hào)556570)，Hoechst33258試劑盒(碧云天公司，批號(hào)C1011)，CAT、SOD、GSH-Px試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)S0101，S0051，S0053)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)RPE細(xì)胞培養(yǎng)在100μg/mL鏈霉素及100U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含15%胎牛血清，培養(yǎng)箱溫度為37℃。

1.2.2細(xì)胞分組共分4組：(1)陰性對(duì)照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng);(2)氧化損傷組：100μmol/L H2O2作用12h；(3)槲皮素低濃度組：100μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h；(4)槲皮素高濃度組：500μmol/L槲皮素孵育24h后，加入H2O2作用12h。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞活力細(xì)胞接種于96孔板(細(xì)胞密度5×104/L，每孔120μL培養(yǎng)24h使細(xì)胞融合約80%～90%，將原培養(yǎng)液吸出，向各孔細(xì)胞中加入20μL終濃度為5g/L的MTT無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，加入150μL的DMSO溶液，置搖床搖晃10min后用酶標(biāo)儀測定492nm的光密度值。

1.2.4流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡各組RPE細(xì)胞六孔板內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)過相應(yīng)處理后，用1g/L胰酶消化后制備細(xì)胞懸液。1000r/min離心后收集細(xì)胞，用Annexin V-FITC試劑盒中緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104/L，取上述細(xì)胞分別按試劑盒說明，加入Annexin和PI，混勻后孵育20min，于1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，以上操作均在暗室內(nèi)避光進(jìn)行。檢測結(jié)果圖共分4個(gè)象限，第四象限代表凋亡早期的細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞凋亡率=第四象限凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)各組RPE細(xì)胞六孔板內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)過相應(yīng)處理后，PBS沖洗3次，每次2min，用固定液固定20min后用PBS再?zèng)_洗2次，加入染色液暗室內(nèi)固定20min，吸掉染色液后于倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)(×400)。每組5張不同的圖片上各隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核熒光較強(qiáng)，呈致密濃染，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

表1槲皮素對(duì)RPE細(xì)胞活性的影響

，n=3)

注：aP<0.05vs陰性對(duì)照組；cP<0.05vs氧化損傷組。

1.2.6 SOD和CAT與GSH-Px活性的檢測收集細(xì)胞并用1g/L胰酶消化，1200r/min離心10min，收集細(xì)胞并用PBS沖洗2次，每份樣品加30μL細(xì)胞裂解液，冰上孵育20min，10000r/min離心10min，然后按試劑盒操作步驟測定細(xì)胞裂解液中CAT、SOD、GSH-Px活性。

2　結(jié)果

2.1槲皮素對(duì)H2O2致RPE細(xì)胞氧化損傷的影響槲皮素能明顯抑制H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞活力的下降，氧化損傷組RPE細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，細(xì)胞活性明顯下降(48.93%±3.39%)，用不同濃度槲皮素處理后，RPE細(xì)胞活性分別提高到79.67%±4.98%和83.00%±3.60%，與氧化損傷組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2槲皮素對(duì)氧化損傷致RPE細(xì)胞凋亡的抑制作用氧化損傷組RPE細(xì)胞凋亡率(38.03%±4.76%)顯著高于陰性對(duì)照組(2.57%±0.76%)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明，H2O2可以導(dǎo)致RPE細(xì)胞凋亡的發(fā)生，經(jīng)不同濃度槲皮素處理后，其凋亡率分別下降至23.23%±3.29%和16.23%±1.94%，與氧化損傷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

2.3槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡的影響Hoechst33258核染色法顯示，陰性對(duì)照組(3.00%±1.00%)未見明顯凋亡染色的細(xì)胞核，氧化損傷組(41.67%±4.33%)凋亡細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞核熒光較強(qiáng)，呈致密濃染，給予不同濃度的槲皮素作用后凋亡細(xì)胞減少(36.67%±4.22%，18.67%±3.45%)，細(xì)胞核形態(tài)改善，熒光強(qiáng)度逐漸減弱(圖2)。與流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測結(jié)果一致。

2.4槲皮素對(duì)RPE細(xì)胞內(nèi)CAT和SOD與GSH-Px活性的影響從表2中可以觀察到，氧化損傷組RPE細(xì)胞中CAT、SOD、GSH-Px活性明顯降低，與陰性對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予不同濃度槲皮素處理后，CAT、SOD、GSH-Px表達(dá)量升高，槲皮素高劑量組與氧化損傷組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3　討論

高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激增強(qiáng)被認(rèn)為是糖尿病并發(fā)視網(wǎng)膜病變的重要因素，大量證據(jù)表明，氧化應(yīng)激損傷在視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[3]。過量的活性氧可直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用損傷細(xì)胞。H2O2常作為建立體外氧化應(yīng)激損傷模型的工具，分解后產(chǎn)生的羥基自由基可導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，RPE細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激較為敏感，我們利用100μmol/L H2O2建立細(xì)胞氧化損傷模型，觀察槲皮素對(duì)該細(xì)胞的保護(hù)作用。

圖1流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡的抑制作用A：陰性對(duì)照組；B：氧化損傷組；C：槲皮素低濃度組；D：槲皮素高濃度組；E：槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡的抑制作用的柱形圖(aP<0.05，bP<0.01vs氧化損傷組)。

圖2槲皮素對(duì)氧化損傷致RPE細(xì)胞凋亡的抑制作用A：陰性對(duì)照組；B：氧化損傷組；C：槲皮素低濃度組；D：槲皮素高濃度組； E：槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡的抑制作用的柱形圖(aP<0.05，bP<0.01vs氧化損傷組)。

表2槲皮素對(duì)RPE細(xì)胞內(nèi)CAT和SOD與GSH-PX含量的變化

組別CAT(U/mg)SOD(U/mL)GSH-Px(U/mL)對(duì)照組46.66±3.0588.74±3.76132.03±3.03氧化損傷組24.57±4.38b51.89±4.66b79.46±3.54b槲皮素低劑量組26.89±3.2959.06±3.4483.03±4.37槲皮素高劑量組39.49±3.83a70.75±3.04a116.57±3.80a

注：aP<0.05vs氧化損傷組；bP<0.01vs對(duì)照組。

抗氧化劑因可延緩DR的發(fā)展而在DR的防治中得到重視。槲皮素是一種廣泛存在于中草藥和蔬果中的天然黃酮類化合物，具有多種生物活性，其中包括清除自由基，下調(diào)由活性氧介導(dǎo)的下游信號(hào)通路[4-5]。國內(nèi)外還少見槲皮素在眼科中的應(yīng)用研究，為此該課題利用槲皮素保護(hù)RPE細(xì)胞緩解由H2O2所致的氧化損傷，初步探討了槲皮素保護(hù)RPE細(xì)胞免受氧化損傷的效果與機(jī)制。

細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示，H2O2處理的細(xì)胞活力明顯降低，槲皮素能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，而且這種藥物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用呈劑量依賴性；流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33258核染色法測定凋亡結(jié)果同樣表明，H2O2作用下RPE早期凋亡率明顯增加，槲皮素有效抑制了H2O2誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)的發(fā)生。

生理狀態(tài)下，機(jī)體抗自由基損傷的酶如SOD、GSH-Px能有效地清除活性氧和自由基，使自由基的產(chǎn)生和清除處于平衡；超氧化物歧化酶(SOD)能夠提供氫原子配體而使其還原生成H2O2，進(jìn)而被谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)催化還原生成對(duì)人體無害的H2O和O2，進(jìn)一步降低過氧化損傷[6-7]。用槲皮素干預(yù)后RPE細(xì)胞中CAT、SOD、GSH-Px活性較氧化損傷組顯著升高，提示槲皮素可能通過提高細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD、GSH-Px活性發(fā)揮其較強(qiáng)的抗氧化作用。

綜上所述，槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有劑量相關(guān)性的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與槲皮素能夠有效改善抗氧化酶活性、增強(qiáng)自由基清除能力從而抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，從而為其用于治療RPE細(xì)胞損傷提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1薛嘉睿，郎平，吳昌凡.氧化應(yīng)激在糖尿病視網(wǎng)膜病發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué) 2009；14 (3):356-360

2凌靜，欒潔.氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變.國際眼科雜志 2008；8(11):2312-2315

3陳放，徐珊，呂偉紅.糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷及葛根素的干預(yù)作用.眼科新進(jìn)展 2012；32(1):15-19

4劉紅亮，胡磊，王靖凱，等.槲皮素對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)效果與機(jī)制.中國藥理學(xué)通報(bào) 2014；30(3):373-377

5劉鵑，康剛勁.槲皮素對(duì)晶狀體保護(hù)作用的研究進(jìn)展.國際眼科雜志 2015；15(1):49-51

6 Pehar M, Beeson G, Beeson CC,etal. Mitochondria-targeted catalase reverts the neurotoxicity of hSOD1G93A astrocytes without extending the survival of ALS-linked mutant hSOD1 mice.PLoSOne2014;9(7):e103438

7 Yuhai GU, Zhen Z. Significance of the changes occurring in the levels of interleukins, SOD and MDA in rat pulmonary tissue following exposure to different altitudes and exposure times.ExpTherMed2015;10(3):915-920

Effects of quercetin on H2O2-induced oxidative damage in human retina pigment epithelium cells

Jia-Jun Zhang, Xin-Xin Li, Bao-Shi Chen, Li-Juan Liu

Li-Juan Liu. the Second Ward of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China. 3051136639@qq.com

2016-07-04Accepted：2016-09-28

?AIM: To discuss the protective effects and possible mechanisms of quercetin in oxidative damage of human retina pigment epithelium (RPE) cells induced by H2O2.

quercetin; human retina pigment epithelium; catalase; superoxide dismutase; glutathione

(150001)中國黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科二病房

張佳君，女，護(hù)師，研究方向： 眼底病。

劉麗娟，副主任護(hù)師，研究方向：眼底病.3051136639@qq.com

2016-07-04

2016-09-28

Zhang JJ, Li XX, Chen BS,etal. Effects of quercetin on H2O2-induced oxidative damage in human retina pigment epithelium cells.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(11):2010-2013

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.11.07

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