王潤青樊曉聰宋梅芳肖 陽郭 林孟凡華楊青華吳大付楊建平1,,*

1河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院, 河南新鄉(xiāng) 453000;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;3河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002;4北京市輻射中心, 北京 100875;5中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京100081

研究簡報(bào)

小麥DELLA獲得性突變體矮變1號(hào)增強(qiáng)了幼苗的抗鹽能力

王潤青1,2,**樊曉聰2,3,**宋梅芳2,4肖 陽5郭 林2孟凡華2楊青華3吳大付1,*楊建平1,2,*

1河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院, 河南新鄉(xiāng) 453000;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;3河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002;4北京市輻射中心, 北京 100875;5中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京100081

DELLA蛋白是GA信號(hào)途徑中重要的負(fù)向調(diào)控因子, 能夠響應(yīng)各種環(huán)境信號(hào), 在植物抵抗生物和非生物脅迫中起著重要的作用。功能獲得性DELLA突變體矮變1號(hào)在矮化育種上已得到廣泛應(yīng)用, 但是其在耐鹽方面的研究鮮有報(bào)道。本文采用含200 mmol L–1NaCl的Hoagland水培溶液處理中國春、京411、矮稈早和矮變1號(hào)幼苗7 d, 測定鹽脅迫下的總?cè)~綠素含量、相對(duì)含水量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量, 并借助免疫印跡檢測了4個(gè)小麥品種中DELLA蛋白的積累。鹽脅迫處理后, 矮變1號(hào)的葉片沒有出現(xiàn)明顯的萎蔫和失綠, 而其他3個(gè)品種均表現(xiàn)出不同程度的萎蔫。鹽脅迫使4個(gè)小麥品種的總?cè)~綠素含量和相對(duì)含水量均有所下降, 但矮變1號(hào)的下降幅度最小; 與此同時(shí), 矮變1號(hào)體內(nèi)SOD活性的相對(duì)上升幅度最大, 并且體內(nèi)的MDA含量相對(duì)上升幅度最小。4個(gè)品種中矮變1號(hào)的DELLA蛋白積累量最高, 矮變1號(hào)具有較高的耐鹽性與其體內(nèi)的高DELLA蛋白含量密切相關(guān)。

小麥DELLA蛋白; NaCl脅迫; 葉綠素含量; 超氧化物歧化酶; 丙二醛

我國農(nóng)用耕地中約有1億公頃的鹽堿地, 是制約小麥播種面積和進(jìn)一步增產(chǎn)增收的重要環(huán)境因素之一[1]。因此,開展小麥抗鹽機(jī)理研究、培育耐鹽品種對(duì)我國擴(kuò)大小麥播種面積、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn), 乃至糧食安全具有重要的意義。

20世紀(jì)60年代, 隨著矮稈基因Rht的廣泛應(yīng)用, 興起了第一次“綠色革命”。目前, 已定名的Rht主效矮稈基因多達(dá)25個(gè)[2], 但在生產(chǎn)中有利用價(jià)值的卻不超過10個(gè),利用最廣泛的是來源于農(nóng)林10號(hào)的Rht1 (Rht-B1b)和Rht2 (Rht-D1b), 分別位于小麥 4B和 4D染色體短臂[3]。Rht1 和 Rht2編碼赤霉素(GA)信號(hào)途徑中的負(fù)向調(diào)控因子DELLA蛋白。該類蛋白主要存在于細(xì)胞核內(nèi)[4], 屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GRAS (GAI、RGA和SCR)蛋白家族的一個(gè)亞家族[5]。DELLA蛋白主要由位于N端的GA信號(hào)感知區(qū)和近C端的GA信號(hào)調(diào)節(jié)區(qū)兩部分構(gòu)成。GA信號(hào)感知區(qū)包含2個(gè)非常保守的酸性結(jié)構(gòu)域VHYNP和感受GA信號(hào)所必須需的DELLA結(jié)構(gòu)域[6]; GA信號(hào)調(diào)節(jié)區(qū)由NLS (nuclear localization signal)、LZ (Leucine zipper)結(jié)構(gòu)域、poly S/T/V (poly Ser/Thr/Val)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域、VHIID (Val-His-Ile-Ile-Asp)[7-8]、SAW (SCARECROW)等功能域構(gòu)成[4]。植物感知GA信號(hào)后, 位于質(zhì)膜上的GA受體GID1與GA形成GA-GID1復(fù)合體, 該復(fù)合體進(jìn)入核中與DELLA蛋白的N端結(jié)合后, DELLA蛋白的C端GRAS結(jié)構(gòu)域識(shí)別E3連接酶 SCFSLY1/GID2的 F-box亞基, 從而形成GA-GID1-DELLA-E3連接酶復(fù)合體, 導(dǎo)致DELLA蛋白通過26S蛋白酶體途徑降解, 打開GA信號(hào)途徑, 從而調(diào)控植物的生長發(fā)育進(jìn)程[9]。小麥Rht-B1b和Rht-D1b兩個(gè)基因編碼的蛋白均是N端DELLA區(qū)段的缺失導(dǎo)致GA信號(hào)感知區(qū)遭到破壞, DELLA蛋白不能被降解, 從而阻斷GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 致使小麥植株矮化[10]。

DELLA蛋白不僅參與調(diào)節(jié)植物的株高[11], 還能夠響應(yīng)各種逆境脅迫, 在作物抵抗逆境中發(fā)揮著重要的作用。鹽脅迫條件通過誘導(dǎo)GA2氧化酶導(dǎo)致內(nèi)源GA水平降低、DELLA蛋白大量積累、植物生長受抑、植物抗鹽能力提高[12-14]。響應(yīng)低溫的轉(zhuǎn)錄因子 CBF1/DREB1b能夠提高GA合成途徑中GA2ox3和GA2ox6的表達(dá)水平, 從而減少內(nèi)源GA的含量, 穩(wěn)定DELLA蛋白, 提高植物的抗冷能力[15]。植物營養(yǎng)不足, 例如磷缺乏, 導(dǎo)致 GA 含量降低,促進(jìn)DELLA蛋白的積累, 從而調(diào)控植物低磷脅迫下的適應(yīng)能力[16]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的DELLA蛋白包括擬南芥的GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3, 大麥的SLN1, 水稻的SLR1 和 OsGAI, 小麥的 Rht和葡萄的 L1等[17]。對(duì)擬南芥DELLA蛋白的抗逆研究有很多報(bào)道, 但對(duì)小麥DELLA蛋白目前主要報(bào)道其株高調(diào)節(jié)功能, 鮮有其他方面的研究。

矮變1號(hào)是西安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所于1972年從小麥品種矮稈早中選出的天然Rht突變體, 株高26~29 cm, 是世界上最矮的小麥品種之一[18]。該突變體攜帶不完全顯性矮桿基因Rht-D1c, 由2個(gè)拷貝的Rht-D1b串聯(lián)復(fù)制而成, 其致矮效果是Rht-D1b的3倍以上[3]。利用矮變1號(hào)與太谷核不育雜交選育出矮敗小麥, 并且已建立了矮敗小麥輪回選擇育種體系[19]。本研究采用含NaCl (200 mmol L-1)的Hoagland營養(yǎng)液處理4個(gè)小麥品種的幼苗7 d, 比較其總?cè)~綠素含量、相對(duì)含水量、SOD活性和MDA含量等生理指標(biāo), 并借助免疫印跡檢測 DELLA蛋白水平, 明確DELLA蛋白與小麥耐鹽性之間的關(guān)系, 為探討矮變1號(hào)在抗鹽育種中的利用價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

4 個(gè)供試品種均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供, 本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁并保存。其中, 矮稈早由麥類種質(zhì)資源課題組提供, 中國春、京411和矮變1號(hào)由矮敗小麥課題組提供。

1.2 NaCl脅迫處理

實(shí)驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院人工溫室內(nèi)進(jìn)行, 以消除光照和溫度等條件造成的誤差。培養(yǎng)條件為 16 h光照/8 h黑暗, 光照強(qiáng)度30.0 μmol m-2s-1, 恒溫22℃, 空氣相對(duì)濕度50%。選取無病飽滿的小麥種子, 表面消毒后用無菌水浸種12 h, 28℃催芽24 h, 將萌動(dòng)露白一致的種子播于蛭石中。4 d后挑選生長健壯、株高一致的幼苗, 洗凈根部, 用長條海綿固定于帶孔的泡沫板上, 并于 Hoagland營養(yǎng)液(pH 6.0)中培養(yǎng)。將4個(gè)品種置同一塊泡沫板上, 每品種重復(fù)3孔, 每孔2株。幼苗在營養(yǎng)液中適應(yīng)2 d后, 轉(zhuǎn)入含200 mmol L-1NaCl的營養(yǎng)液中, 以不含NaCl的營養(yǎng)液為對(duì)照。每3 d更換一次營養(yǎng)液, 處理7 d后取葉片測定各種生理指標(biāo)。設(shè)3次獨(dú)立的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.3 植物逆境相關(guān)生理指標(biāo)的測定與統(tǒng)計(jì)分析

參照孫廣華等[20]描述的方法提取葉片總?cè)~綠素, 按萬里強(qiáng)等[21]描述的方法測定相對(duì)含水量。用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定 SOD 活性[22], 用巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量[22]。

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析, 用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。在Microsoft Excel 2010中繪制柱形圖。

1.4 黑暗和白光條件下DELLA蛋白的表達(dá)水平分析

小麥種子經(jīng)自來水充分吸脹, 待種子萌動(dòng)露白后播種于蛭石中, 在22℃白光(20.0 μmol m-2s-1)或22℃黑暗條件下生長 6 d, 取地上部測定 DELLA蛋白表達(dá)豐度[20,23]。采用的抗體分別是 Rht兔多克隆抗體(制備抗體的抗原多肽序列 FLDRFTESLHYYST, 效價(jià) 1∶500, 杭州華安生物技術(shù)有限公司)、HSP鼠單克隆抗體(1∶5000, 北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)、抗兔IgG抗體(1∶5000, Sigma, 美國)和抗鼠 IgG抗體 (1∶5000, Sigma, 美國)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下矮變1號(hào)葉片未見明顯的萎蔫及失綠

未經(jīng)NaCl處理時(shí), 4個(gè)品種均生長良好, 葉片為綠色且豎直向上生長(圖1-A, C); 而200 mmol L-1NaCl處理7 d后, 中國春、京 411和矮稈早的株高明顯下降, 葉寬變窄, 葉片萎蔫與失綠的程度依次加重, 而矮變1號(hào)的葉色與生長狀況與未脅迫處理的生長狀況無明顯差異, 也沒有出現(xiàn)明顯萎蔫(圖1-B, D)。

2.2 鹽脅迫下矮變 1號(hào)具有高的總?cè)~綠素含量和相對(duì)含水量

未經(jīng)NaCl脅迫處理的4個(gè)品種的總?cè)~綠素含量和相對(duì)含水量均處于較高水平, NaCl處理后呈明顯下降趨勢(圖2), 總?cè)~綠素含量下降幅度為中國春 63%、矮稈早45%、京411 20%、矮變1號(hào)17%, 相對(duì)含水量下降幅度為中國春27%、矮稈早14%、京411 12%、矮變1號(hào)4%?？梢? 矮變1號(hào)耐鹽脅迫的能力較強(qiáng)。

2.3 鹽脅迫下矮變1號(hào)的SOD活性最高, MDA含量最低

NaCl處理后, 小麥幼苗中MDA含量和SOD活性較未脅迫處理時(shí)升高(圖3), 其中 MDA含量增加幅度為中國春2.9倍、矮稈早1.9倍、京411 1.3倍、矮變1號(hào)1.1 倍, SOD活性增長率為中國春23%、矮桿早25%、京411 38%、矮變1號(hào)46%, 表明矮變1號(hào)清除自由基和穩(wěn)定細(xì)胞膜的能力最強(qiáng)。

2.4 矮變1號(hào)含有較高的DELLA蛋白含量

不論在黑暗還是在白光條件下, 矮變1號(hào)的DELLA含量均明顯高于其他 3個(gè)品種(圖4), 結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo), 認(rèn)為矮變 1號(hào)的耐鹽性與其體內(nèi)較高的DELLA蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)。

圖1 鹽脅迫前后的小麥幼苗形態(tài)Fig.1 Morphology of wheat seedlings in response to salt stress

圖2 鹽脅迫和無脅迫下4個(gè)小麥品種的葉綠素含量(A)和相對(duì)含水量(B)變化Fig.2 Changes of chlorophyll content (A) and relative water content (B) in four wheat cultivars under treatment with or without salt stress

圖3 鹽脅迫和無脅迫下4個(gè)小麥品種中MDA含量(A)和SOD活性(B)的變化Fig.3 Changes of MDA content (A) and SOD activity (B) in four wheat cultivars under treatments with or without salt stress

圖4 4個(gè)小麥品種的幼苗在白光或黑暗下DELLA蛋白的免疫印跡檢測Fig.4 Immunoblot analysis of DELLA protein accumulation in four wheat cultivars under white light or darkness

3 討論

高鹽對(duì)植物造成的最直接的傷害是水分脅迫, 植物會(huì)因環(huán)境的滲透勢低于細(xì)胞內(nèi)滲透勢導(dǎo)致細(xì)胞逐漸失水,失水量大于吸水量時(shí), 植物出現(xiàn)卷曲和萎蔫癥狀[24-25]。葉綠體是植物對(duì)鹽分最敏感的細(xì)胞器, 鹽分破壞細(xì)胞中色素–蛋白質(zhì)–類脂復(fù)合體的結(jié)合強(qiáng)度, 并且增強(qiáng)葉綠素降解酶的活性, 破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)、促進(jìn)葉綠素的降解, 導(dǎo)致葉片失綠和黃化, 光合作用受阻, 植物正常的能量供應(yīng)失調(diào), 造成植物的生長和發(fā)育紊亂[24,26]。本研究發(fā)現(xiàn), 矮變1號(hào)在鹽脅迫處理前后未出現(xiàn)明顯的萎蔫和失綠, 并且植株生長狀態(tài)良好(圖1), 體內(nèi)的總?cè)~綠素含量和相對(duì)含水量均高于其他3個(gè)小麥品種(圖2), 表明矮變1號(hào)緩沖脅迫、維持相對(duì)正常的生長發(fā)育的能力更強(qiáng)。

在遭受鹽脅迫時(shí), 植物細(xì)胞內(nèi)自由基積累, 導(dǎo)致膜脂過氧化水平增高, 體內(nèi) MDA含量增加引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子交聯(lián)聚合, 細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的完整性遭到破壞, 胞內(nèi)組分大量外滲, 正常代謝不能維持而導(dǎo)致植物受傷表現(xiàn)出逆境反應(yīng)乃至死亡。植物體內(nèi)的SOD等保護(hù)性酶類的活性在植物遭遇逆境脅迫時(shí)大幅提高, 以減輕 MDA積累的傷害, 維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性與完整性[27-28]。脅迫處理后, 矮變 1號(hào)的 SOD活性比處理前增長46% (圖3), 明顯大于其他3個(gè)品種的SOD增幅, 同時(shí)矮變1號(hào)的MDA上升幅度僅為10%, 變化幅度遠(yuǎn)低于其他3個(gè)品種。這表明在鹽脅迫下, 矮變1號(hào)通過提高自身SOD酶的活性來增強(qiáng)清除活性氧的能力, 從而增強(qiáng)對(duì)鹽脅迫的耐受能力。

DELLA蛋白作為 GA信號(hào)途徑中的重要調(diào)節(jié)因子,也是外界環(huán)境信號(hào)與其他植物激素信號(hào)通路中一個(gè)重要的節(jié)點(diǎn)蛋白[29], 能夠響應(yīng)光、乙烯、ABA、非生物脅迫及生長素途徑[30]。在擬南芥中, 鹽脅迫下DELLA蛋白通過提高 SOD等抗氧化酶的活性使植物體內(nèi)的活性氧(ROS)保持在較低的水平, 從而提高植物的抗鹽能力[31]。矮變1號(hào)攜帶Rht-D1b基因, 該基因內(nèi)部發(fā)生堿基替換, GGA突變?yōu)門GA, 形成終止密碼子, N端的GA信號(hào)感知區(qū)遭到破壞, 導(dǎo)致DELLA蛋白不被降解[3,10]。在本研究中, 矮變1號(hào)的DELLA含量高于其他3個(gè)品種(圖4), 且鹽處理后矮變1號(hào)的SOD活性上升幅度最大, MDA含量上升幅度最小(圖2), 表明由DELLA蛋白調(diào)控的耐鹽機(jī)制在小麥和擬南芥中相似, 該機(jī)制可能普遍存在于大多數(shù)植物中。

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A Wheat DELLA Gain-of-function Mutant Aibian 1 Promotes Seedling Salt Tolerance

WANG Run-Qing1,2,**, FAN Xiao-Cong2,3**, SONG Mei-Fang2,4, XIAO Yang5, GUO Lin2, MENG Fan-Hua2, YANG Qing-Hua3, WU Da-Fu1,*, and YANG Jian-Ping1,2,*
1School of Life Science & Technology, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453000, China;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3College of Agronomy, Henan Agricultural University / Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Zhengzhou 450002, China;4Beijing Radiation Center, Beijing 100875, China;5Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

DELLA proteins are negative regulators in GA signal pathway.DELLA protein is able to response to various environmental signals and plays an important role in plant resistance to biotic and abiotic stresses.The DELLA gain-of-function mutant Aibian 1 has been widely applied in wheat breeding for dwarfness, but its tolerance to salt is unclear.In this study, Aibian 1 was compared with Chinese Spring, Jing 411, and Aiganzao in salt tolerance using Hoagland’s hydroponic culture with 200 mmol L-1NaCl.Total chlorophyll content, relative water content, superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content were measured to evaluate the ability of salt tolerance.Immunoblot assay was employed to assess the DELLA protein abundance in wheat seedlings.After seven-day NaCl treatment, Aibian 1 showed no clear withering leaves, whereas the other three cultivars displayed obviously wilting and yellowing leaves.Among the four cultivars, Aibian 1 had the least loss on chlorophyll content and relative water content, the highest SOD activity, and the lowest levels of MDA content after salt treatment.Immunoblot assay indicated the highest accumulation of DELLA protein in Aibian 1 among the four cultivars.Thus, we consider thehigh level of DELLA protein is closely related to salt tolerance in Aibian 1.

Wheat DELLA proteins; Salt tolerance; Chlorophyll content; Superoxide dismutase; Malondialdehyde

10.3724/SP.J.1006.2016.01721

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(七大作物育種試點(diǎn)專項(xiàng))(2016YFD101802), 北京市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(6151002)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目的資助。

This study was supported by the National Key R&D Program of China (Pilot Project on Seven Main Crop Breeding) (2016YFD101802 ), the Natural Science Foundation of Beijing (Key Program) (6151002) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of CAAS.

*通訊作者(Corresponding authors): 楊建平, E-mail: yangjianping02@caas.cn, Tel: 010-82105859; 吳大付, E-mail: uau9393@163.com, Tel: 0373-3693629

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

聯(lián)系方式: Tel: 010-82105851; 王潤青, E-mail: wrq1990520@163.com; 樊曉聰, E-mail: xiaocong_fan@163.com

稿日期): 2016-02-23; Accepted(接受日期): 2016-07-11; Published online(

日期): 2016-08-11.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160811.1623.020.html