李藝，王悅，王健，趙翔宇，王芳，別曉敏

山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，作物生物學國家重點實驗室，山東泰安271018

除草劑篩選小麥轉基因植株的有效濃度研究

李藝，王悅，王健，趙翔宇，王芳，別曉敏*

山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，作物生物學國家重點實驗室，山東泰安271018

利用篩選標記基因可方便快捷的區(qū)分轉基因植株和非轉基因植株。篩選標記基因通常用PCR、Southern雜交等分子手段檢測。隨著規(guī)模化轉基因工作的開展，大量轉基因植株需要及時準確的鑒定。葉片涂抹除草劑篩選轉基因植株具有快速、高效的優(yōu)勢。本研究結果顯示，除草劑草銨膦對小麥品種輪選987和科農(nóng)199的有效篩選濃度分別為75 mg·L-1和125 mg·L-1；對以輪選987為受體材料的轉bar基因小麥植株的有效篩選濃度為100 mg·L-1，該濃度可用于針對此類轉基因材料的大規(guī)模篩選。

小麥；轉基因；除草劑；bar基因；有效濃度

小麥是世界上重要的糧食作物之一，分布范圍廣，種植面積大，關系到經(jīng)濟和社會穩(wěn)定發(fā)展。因此，培育具有高產(chǎn)、優(yōu)質、抗病、抗逆等優(yōu)良性狀的小麥品種具有重要意義。在基因水平操控和定向改良方面，轉基因技術明顯優(yōu)于傳統(tǒng)育種方式，是改良植物抗病、抗蟲、抗除草劑、抗旱以及其它重要農(nóng)藝性狀的一個有力工具。自1992年Vasil等利用基因槍轉化技術獲得世界上第一例轉基因小麥植株至今［1］，小麥遺傳轉化技術經(jīng)過不斷改進已日趨成熟，基因工程育種逐漸成為小麥品種改良的主要補充手段［2-5］。目前，全球轉基因作物面積達到1.7×108hm2［6］。

篩選標記基因可以為獲得真正的轉化體提供有利的判斷依據(jù)，在植物遺傳轉化過程中發(fā)揮著至關重要的作用。篩選標記的選用不僅關系到獲得轉基因植株的效率，也關系到轉基因材料的安全性評價和后續(xù)產(chǎn)業(yè)化進程［7，8］。目前在植物遺傳轉化中廣泛應用的標記基因有抗抗生素基因和抗除草劑基因，均屬于傳統(tǒng)的選擇標記基因，其成熟的技術體系和廣泛的適用性，使得轉化工作能夠更加順利地開展。

小麥遺傳轉化常用的篩選標記基因主要有bar、nptII、hpt等基因。其中，bar基因編碼的草丁膦乙酰轉移酶PAT蛋白賦予植物細胞對Bialaphos等（活性成分為PPT）除草劑的抗性，nptII或aphA基因編碼的新霉素磷酸轉移酶基因使植物細胞獲得對氨基糖苷類抗生素如卡那霉素（Kanamycin）、G418（Geneticin）、巴龍霉素（Paromomycin）的抗性，hpt基因編碼的潮霉素磷酸轉移酶賦予植物細胞潮霉素（Hygromycin）抗性。

bar基因是一種抗除草劑基因，是目前使用最多的選擇標記基因之一［9］。它編碼的蛋白能使篩選培養(yǎng)基中的草丁膦自由氨基乙?；荻§D基因植物細胞的毒害作用。此外，草丁膦在土壤中易被土壤微生物快速分解，不會對環(huán)境和人畜造成毒害。該篩選體系快速、簡便、高效，細胞產(chǎn)生的假轉化體少，并且使植物獲得抗除草劑的農(nóng)藝性狀［10，11］，在當下轉基因作物的種植面積中占有相當大的比重。

篩選標記基因在植物遺傳轉化中具有極為重要的作用，使用這類基因可大大減少工作量，能夠方便快捷的區(qū)分轉化細胞和非轉化細胞。關于篩選標記基因的檢測，目前常用PCR［12-14］、Southern雜交［15］等分子手段鑒定。隨著規(guī)?；D基因工作的開展，大量候選轉基因植株需要及時準確的鑒定，因此，需要探明一種快速、高效、準確的檢測方法。本研究擬通過對轉bar基因小麥植株葉片涂抹不同濃度的除草劑，以期獲得能夠有效鑒定轉基因植株的除草劑濃度。

1　材料與方法

1.1小麥材料

本實驗所用的非轉基因小麥材料為小麥國審品種—輪選987和科農(nóng)199；所用的轉基因材料為以輪選987受體的3個轉bar基因小麥株系，編號為B1、B2、B3等3個株系。轉化方法為農(nóng)桿菌介導法。所有實驗材料均于2014年10月份種植于山東農(nóng)業(yè)大學網(wǎng)室。

1.2實驗方法

分別配制濃度為50 mg·L-1、75 mg·L-1、100 mg·L-1、125 mg·L-1和150 mg·L-1的草銨膦溶液（美國Sigma公司）并涂抹非轉基因小麥植株；50 mg·L-1、75 mg·L-1、100 mg·L-1、125 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1和250 mg·L-1的草銨膦溶液涂抹轉基因小麥植株。用棉簽蘸取相應濃度的草銨膦溶液涂抹拔節(jié)期的小麥葉片，涂抹位置選擇生長節(jié)位和葉面積基本一致的葉片中部，并保證涂抹面積一致。

涂抹時間于下午16：00～18：00進行。涂抹72 h后調查葉片表型。

1.3基因組提取及PCR鑒定

利用CTAB法提取轉基因小麥T3代植株和非轉基因小麥植株的基因組DNA。根據(jù)bar基因序列設計特異引物。上游引物序列為：CGGTCTGCACCATCGTCAACCACT；下游引物序列為：GAAACCCACGTCATGCCAGTTCCC（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。PCR擴增體系為：1 μL DNA模板（200 ng μL-1），2 μL上游引物（5 μmol μL-1），2 μL下游引物（5 μmol μL-1），10 μL 2×Trans Diect PCR SuperMix（天根生化科技（北京）有限公司），加ddH2O將總體積補充至20 μL。擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性50 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s，循環(huán)32次；72℃延伸10 min。PCR擴增時以陽性質粒作為陽性對照、非轉基因小麥植株的基因組DNA為陰性對照。

2　結果與分析

2.1不同濃度草銨膦對非轉基因小麥葉片的影響

在非轉基因小麥葉片上涂抹50 mg·L-1、75 mg·L-1、100 mg·L-1、125 mg·L-1、150 mg·L-15種不同濃度的草銨膦溶液，3 d后觀察并統(tǒng)計實驗結果（表1）。

由表1和圖1可知，75 mg·L-1草銨膦涂抹輪選987葉片，涂抹部位葉色由綠色變?yōu)辄S色，與未涂抹部位有明顯差異（圖1A），可作為有效篩選濃度；科農(nóng)199在草銨膦濃度為125 mg·L-1時，葉色明顯由綠色變黃色（圖1B）。

表1　不同濃度草銨膦涂抹非轉基因小麥植株葉片的結果統(tǒng)計Table 1 Statistics of non-transgenic wheat leaves painted different concentrations of herbicide

圖1　小麥葉片涂抹草銨膦72 h后的表型觀察Fig.1 Phenotype of wheat leaves painted with glufosinate-ammonium for 72 h

2.2不同濃度草銨膦對轉基因小麥植株的影響

由于轉基因材料為轉bar基因小麥植株，我們首先對5個T3代轉基因株系進行了PCR鑒定（圖2），發(fā)現(xiàn)bar基因均已整合到小麥基因組中。結合輪選987草銨膦涂抹實驗得出75 mg·L-1為有效篩選濃度，設置了50 mg·L-1、75 mg·L-1、100 mg·L-1、125 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1、250 mg·L-17個濃度梯度。選取株系3、4、5（編號B1，B2，B3）的T4代轉基因植株和非轉基因植株的葉片涂抹不同濃度的草銨膦，觀察表型（圖1C和圖1D），并統(tǒng)計實驗結果（表2）。

圖2　T3代轉基因小麥株系PCR鑒定Fig.2 PCR detection of T3 transgenic wheat

表2　不同濃度草銨膦涂抹轉基因小麥植株的統(tǒng)計結果Table 2 Statistics of transgenic wheat plants painted with different concentrations of glufosinate-ammonium

由表2可知，B1、B2、B3轉基因株系在涂抹草銨膦濃度為100 mg·L-1時，幾乎所有植株均具有除草劑抗性；125 mg·L-1濃度時，抗性苗率不超過10%；高于150 mg·L-1濃度時，幾乎無抗性苗存活。結合輪選987有效篩選濃度為75 mg·L-1，表明在100 mg·L-1濃度時，草銨膦涂抹實驗可以有效區(qū)分小麥植株是否為轉基因植株。

3　討論

隨著作物轉基因工作的大規(guī)模開展，轉基因植株的鑒定工作量急劇增大，且時間較為集中。相比于PCR檢測、Sourthern雜交等分子生物學手段，除草劑涂抹實驗具有操作簡單、價格低廉、高效快速等優(yōu)勢。

輪選987和科農(nóng)199作為兩種不同的非轉基因材料（轉化受體材料），對除草劑的敏感性有差異，我們推測其它的各種小麥受體材料可能對除草劑敏感性亦有差異。在實驗鑒定過程中，如需涂抹除草劑，應先對受體材料進行預實驗，確定最低有效篩選濃度后，再進行轉基因材料的除草劑涂抹試驗及濃度確定。

本研究中，以輪選987為受體的多個株系的有效篩選濃度基本一致，均為草銨膦100 mg·L-1，這一濃度低于李欣等［16］在葉片涂抹200 mg·L-1Liberty的濃度，推測可能與實驗所用除草劑有效濃度及處理時的天氣條件等有關。同時，本研究所用小麥轉基因株系為農(nóng)桿菌侵染法所得，該轉化方法獲得的轉基因植株中bar基因多為單拷貝插入，故對除草劑敏感性基本一致。對于基因槍轟擊法獲得的小麥轉基因植株，可能會由于bar基因在不同轉化事件中拷貝數(shù)的差異，導致植物體內草丁膦乙酰轉移酶PAT蛋白的表達量不一致，對除草劑抗性會在有效濃度基礎上有所提高。

4　結論

本研究通過對小麥轉化的受體材料——輪選987和科農(nóng)199，即非轉基因小麥植株的葉片涂抹不同濃度的除草劑溶液（草銨膦），確定75 mg·L-1可有效篩選輪選987，125 mg·L-1有效篩選科農(nóng)199。對于轉bar基因小麥植株（輪選987為受體材料），結果表明100 mg·L-1濃度為有效篩選濃度。研究結果對以輪選987為受體的小麥轉基因植株的快速篩選具有一定的參考價值。

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Study on the Effective Concentration of Herbicide Screening for Transgenic Wheat

LI Yi，WANG Yue，WANG Jian，ZHAO Xiang-yu，WANG Fang，BIE Xiao-min*
College of Life Sciences，State Key Laboratory of Crop Biology/Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China

The selection marker gene was widely used to detect and identify transgenic plants in biotechnological breeding of crops.For detection of selection marker genes，the molecular techniques such as Polymerase-Chain-Reaction（PCR）and Southern blot were generally applied.However，with the rapid progress of genetic transformation of crop species，a large number of transgenic plants need to be identified timely and usually，bar was designed as the marker gene.The method painting herbicide（glufosinate-ammonium）on leaf has the advantage of quickness and effectiveness for verifying transformation.The results showed that in wheat varieties Lunxuan 987 and Kenong199，the effective selection concentrations of herbicide were 75 mg·L-1and 125 mg·L-1，respectively.Further，the effective selection concentrations of herbicide were 100 mg·L-1for detecting the activity of bar protein when Lunxuan 987 was transformed as the donor plant，suggesting this concentration of glufosinate-ammonium might be suitable for large scale detection.

wheat；transgenosis；Herbicide；bar gene；effective concentration

Q786

A

1000-2324（2016）05-0664-04

2015-10-14

2015-11-16

泰安市大學生科技創(chuàng)新行動計劃項目（2014D027）

李藝（1991-），女，本科生.E-mail：18706380053@163.com

Author for correspondence.E-mail：biexm@sdau.edu.cn