許祿，歐杰，王婧，賈素中

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306

黃酒中生物胺的HPLC-MS/MS測定

許祿，歐杰*，王婧，賈素中

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306

本文建立了一種新型的檢測市售黃酒中常見的六種生物胺（尸胺、組胺、酪胺、色胺、腐胺和2-苯乙胺）的HPLC-MS/MS分析方法。采用Atlantis HILIC色譜柱（150.0 mm×2.1 mm，3μm）；乙腈和水（2 mmol/L的乙酸銨，0.1%甲酸）作為流動相進(jìn)行梯度進(jìn)樣；以電噴霧離子源（ESI）在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描；采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式和外標(biāo)法進(jìn)行質(zhì)譜定量分析，分析時間為15 min。六種生物胺的檢出限為9.7 μg/L～50 μg/L，定量限為28.6 μg/L～148.6 μg/L，且在0～1000 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，樣品平均添加回收率為81.34%～104.23%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.23%～8.56%。本方法不需要衍生化處理，且操作簡便，靈敏度高，可快速準(zhǔn)確對黃酒中多種生物胺進(jìn)行定性和定量分析。

黃酒；生物胺；HPLC-MS/MS

生物胺（BA）是一類含氮的低分子量有機(jī)化合物總稱，具有生物活性，是由動物、植物和微生物組織在正常新陳代謝過程中降解產(chǎn)生［1］。生物胺廣泛存在于食品中，尤其是蛋白質(zhì)和氨基酸含量多的食品中，如魚、肉、奶酪及各類發(fā)酵產(chǎn)品等中。組胺和酪胺在食品中含量最多，同時也是對人體健康危害最大的兩種生物胺，如酪胺可引起人體血壓升高及偏頭痛，組胺積累到一定濃度可導(dǎo)致食源性中毒，造成腹部痙攣、嘔吐等癥狀命［2，3］。

黃酒是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵酒，隨著消費(fèi)者對黃酒安全問題的關(guān)注度不斷增加，黃酒中生物胺含量的安全性也被多次提及。由于黃酒的釀造地區(qū)和發(fā)酵方法不同，黃酒中生物胺的種類和含量存在差異，陸永梅等［4，5］對中國4個黃酒產(chǎn)區(qū)的14種黃酒中生物胺進(jìn)行測定，結(jié)果顯示黃酒中含有酪胺、組胺、尸胺、精胺、腐胺等五種生物胺。目前生物胺的檢測方法主要有反相高效液相色譜法（RP-HPLC）、離子色譜法（IC）、薄層色譜法（TLC）等，其中RP-HPLC法最為常用［6，7］。其中GB/T.5009-208［8］采用HPLC測定食品中生物胺含量，但該方法需要進(jìn)行柱前或柱后衍生，反應(yīng)條件非?？量?。本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度結(jié)合起來，且不需要衍生化處理，同時具有可提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)，為黃酒中多種生物胺的同時定性和定量分析提供了有效便利的分析方法。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

主要試劑：組胺（His，C5H9N3）標(biāo)準(zhǔn)品、腐胺（Put，C4H12N2）標(biāo)準(zhǔn)品、尸胺（Cad，C5H14N2）標(biāo)準(zhǔn)品、苯乙胺（Phe，C8H11N）標(biāo)準(zhǔn)品、色胺（Try，C10H12N2）標(biāo)準(zhǔn)品、酪氨（Tyr，C8H11NO）標(biāo)準(zhǔn)品均購于Sigma公司（純度均＞98%）；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）甲醇/乙腈溶液80/20（v/v）；氨水甲醇溶液（量取5 mL氨水，溶解于100 mL甲醇中）；實(shí)驗(yàn)室用水為MILI-Q超純水。

實(shí)驗(yàn)儀器：Quattro Micro型液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；MasslynxV4.1軟件；有機(jī)相0.22 μm過濾膜；超聲波清洗儀；DC12系列氮吹儀吹儀（上海安譜）；梅特勒電子天平SBZ04-N；BESEP?HR-XC混合型陽離子交換固相萃取柱（60 mg，3 mL）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理取10 mL黃酒樣品經(jīng)0.45 μm有機(jī)相濾膜過濾，將濾液加入混合型陽離子交換固相萃取柱后，用2 mL的3%甲酸水溶液過柱，然后棄去流出液，再用3 mL氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，氮吹濃縮后，用甲醇溶液定容至1 mL，過0.22 μm有機(jī)相濾膜后入樣品瓶，上機(jī)測定。1.2.2色譜條件Atlantis HILIC色譜柱（150.0 mm×2.1 mm，3μm）；進(jìn)樣量為10 μL；分析時間為15 min；柱溫為35℃；流速為0.2 mL/min；流動相A為水（2 mmol/L的乙酸銨，0.1%甲酸），B為乙腈；具體梯度洗脫程序如圖所示（見表1）。

表1　梯度洗脫參數(shù)Table 1 Parameters of gradient elution

1.2.3質(zhì)譜條件電離源采用電噴霧離子源（ESI）；離子源溫度為120℃；毛細(xì)管電壓為3.00 kV脫溶劑和錐孔氣為N2；脫溶劑溫度為300℃；脫溶劑流速為500 L/h；錐孔氣流速為50 L/h；碰撞氣體為氬氣；掃描方式為正離子掃描，駐留時間為50 ms；監(jiān)測模式為多重離子反應(yīng)（MRM）。

2　結(jié)果與討論

2.1樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1固相萃取柱柱型的選擇本試驗(yàn)采用了幾種不同的固相萃取小柱：HLB固相萃取柱、C18固相萃取小柱、MCX固相萃取柱和DSC-18固相萃取柱。結(jié)果顯示HLB固相小柱和DSC-18固相小柱對腐胺和尸胺沒有任何保留，而MCX固相小柱對腐胺和尸胺的回收率分別為86.27%和93.14%，因此本實(shí)驗(yàn)選擇MCX固相萃取小柱。與其他萃取小柱凈化樣品相比，混合型離子交換固相萃取小柱的使用使生物胺的回收率有所提高，有利于大批量樣品的檢測。

2.1.2洗脫液的選擇洗脫液的選擇會影響樣品中生物胺的回收率，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確度影響很大。實(shí)驗(yàn)采用MCX固相萃取小柱，樣品過柱流速控制在1 mL/min，探究了四種常見的洗脫液：二氯甲烷和丙酮混合液（1：1），甲醇，乙腈，氨水甲醇溶液（5 mL氨水，100 mL甲醇）。結(jié)果表明，用氨水甲醇混合溶液（5 mL氨水，100 mL甲醇）洗脫，腐胺和酪胺的回收率分別為87.6%、92.7%，六種生物胺的平均回收率在82.3%～88.9%，而用二氯甲烷和丙酮混合液（1：1），甲醇和乙腈洗脫時，六種生物胺的平均回收率為72.5%～78.3%、34.5%～46.3%、27.8%～32.3%，當(dāng)用甲醇洗脫時，酪胺和腐胺的回收率僅為19.6%、23.4%。另外二氯甲烷和丙酮混合液（1：1）洗脫氮吹后，需要轉(zhuǎn)溶劑為甲醇并定容到1.0 mL，氨水甲醇混合液洗脫后無需轉(zhuǎn)溶劑可直接定容進(jìn)樣，操作也簡單。所以實(shí)驗(yàn)最終選取氨水甲醇溶液（5 mL氨水，100 mL甲醇）作為洗脫液。

2.2色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，Atlantis HILIC色譜柱（150.0 mm×2.1 mm，3μm）對生物胺的保留效果遠(yuǎn)比C18色譜柱要好。流動相的組成和比例影響物質(zhì)的分離和靈敏度，本實(shí)驗(yàn)使用了不同比例的甲醇-水和乙腈-水等多種流動相體系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動相為乙腈-水（2 mmol/L乙酸銨，0.1%甲酸）時，六種生物胺的分離效果最好。同時乙酸銨和甲酸的加入可提高離子化的速率，因此溶出時間最早的物質(zhì)峰型很尖銳，靈敏度也隨之提高。然而當(dāng)用甲醇-水（80：20）作為流動相時，得到的峰形不僅拖尾嚴(yán)重，而且靈敏度也大大下降。按照表1的梯度洗脫使得樣品的峰型比較窄而且尖銳，分離能力很強(qiáng)，從而有效地縮短分離時間。六種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖（見圖1）。

圖1　6種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of six standards of biogenic amines

2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用50 μg/L的6種生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用電噴霧離子源（ESI）方式在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定其準(zhǔn)分子離子峰，然后以其分子離子作為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，最終選取干擾較小、豐度較強(qiáng)的子離子為定性離子，然后通過調(diào)諧其流動相流速、錐孔電壓、碰撞能、母離子以及兩對子離子等參數(shù)，使其特征離子的強(qiáng)度達(dá)到最大。MS檢測條件的優(yōu)化就是為了保證被測離子具有較好的穩(wěn)定性和靈敏度，最終優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如下（見表2）。

表2　多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下6種生物胺優(yōu)化后的質(zhì)譜條件Table 2 Multiple reaction monitoring（MRM）conditions of 6 biogenic amines

2.4線性范圍與檢出限

用生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液做線性實(shí)驗(yàn)，各組生物胺濃度分別為：0、50、100、250、500、1000 μg/L。按照本實(shí)驗(yàn)所創(chuàng)建的方法進(jìn)行測定，然后以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示六種生物胺的相關(guān)系數(shù)R的平方均大于0.994，說明在0～1000 μg/L的濃度范圍內(nèi)該方法具有良好的線性關(guān)系（見表3）。以3倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)黃酒樣品中生物胺濃度作為檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）對應(yīng)的黃酒樣品中生物胺作為定量限（LOQ），最終算得六種生物胺的檢出限和定量限，所得結(jié)果（見表3）。

表3　六種生物胺的線性關(guān)系和檢測限Table 3 Linear equation and LOD of six biogenic amines

2.5方法回收率和精確度

向不含待測化合物的黃酒樣品中加入三種濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)量分別為50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L，進(jìn)樣分析并計(jì)算其回收率和精密度，每個水平重復(fù)測量七次，結(jié)果見表4，其平均回收率為81.34%～104.23%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在之間1.23%～8.56%。

表4　黃樣品中六種生物胺的回收率（n=7）Table 4 The recovery rate of six biogenic amines in yellow rice wine（n=7）

2.6實(shí)際樣品的測定

在本文建立的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)條件下，對上海市市售品牌黃酒進(jìn)行隨機(jī)取樣，將樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，從得到的質(zhì)譜圖（圖2）可以看出，圖像平穩(wěn)清晰，樣品各組分出峰點(diǎn)與標(biāo)樣出峰點(diǎn)都有準(zhǔn)確的對應(yīng)，而且沒有其他雜峰的干擾。隨機(jī)取樣的50個黃酒樣品中均檢測到生物胺，其含量均在國家規(guī)定的安全范圍內(nèi)，其中43個樣品中檢測到組胺和酪胺，其含量分別在370.2 μg/L～850.7 μg/L和98.5 μg/L～670.5 μg/L，23個樣品檢測到了腐胺，其含量為156.6 μg/L～245.6 μg/L，14個樣品檢測到尸胺，其含量為120.4 μg/L～210.6 μg/L，5個樣品檢測到了苯乙胺，其含量為135.3 μg/L～256.4 μg/L，50個樣品均未檢測到色胺。

圖2　加標(biāo)后黃酒樣品生物按檢測質(zhì)譜圖Fig.2 The MRM spectrum of biogenic amines in Yellow Rice Wine with standards

3　結(jié)論

本文建立了HPLC-MS/MS法測定黃酒中生物胺的分析方法，采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式和外標(biāo)法進(jìn)行質(zhì)譜定量分析，六種生物胺的定量離子對分別為組胺112/94.86、尸胺103/85.85、色胺161/144.11、酪胺138/120.98、腐胺89/71.77、苯乙胺122/104.94。本方法中六種生物胺的檢出限為9.7 μg/L～50 μg/L，定量限為28.6 μg/L～148.6 μg/L，且在0～1000 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。六種生物胺在黃酒樣品中的平均回收率為81.34%～104.23%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在之間1.23%～8.56%之間，均符合國際標(biāo)準(zhǔn)中殘留檢測要求。本方法中樣品無需衍生化處理，可對黃酒中生物胺進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定性和定量，大大提高了大批量樣品檢測的效率。

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DeterminationofBiogenicAminesinYellowRiceWinebyHPLC-MS/MS

XU Lu1，OU Jie1*，WANG Jing2，JIASU-zhong1
1.College of Food Science and Technology/Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China
2.Shanghai Food Research Institute，Shanghai 200235，China

A new HPLC-MS/MS analytical method was developed to detect the biogenic amines（Cadaverine，Histamine，Tyramine，Tryptamine，Putrescine and Phenethylamine）in Yellow Rice Wine.The analysis was performed using a Atlantis HILIC column（150.0 mm×2.1 mm，3 μm）and the mobile phase was consisted of acetonitrile and water（2 mmol/L ammonium acetate，0.1%formic acid）in the mode of gradient elution programand it was employed in multiple reaction monitoring（MRM）with electrospray ionization（ESI）in the positive mode and the analysis time was fifteen minutes.The detection limits of the six biogenic amines were in the range of 9.7 μg/L to 50 μg/L.The limit of quantitation was in the range of 28.6 μg/L to 148.6 μg/L.A good linear relationship was observed in the range of 0 μg/L to 1000 μg/L.The average recoveries were in the range of 81.34%to 104.23%for the six biogenic amines.The relative standard deviations（RSD）were between 1.23%and 8.56%.This method is reliable，sensitive and reproducible for the qualitative and quantitative analysis on the biogenic amines in Yellow Rice Wine.

Yellow Rice Wine；biogenic amines；HPLC-MS/MS

O657.7+2

A

1000-2324（2016）05-0654-05

2015-11-16

2015-12-23

上海市科委應(yīng)用技術(shù)開發(fā)專項(xiàng)資金（2013-116）；（2014-110）

許祿（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称贩治龌瘜W(xué).E-mail：525080716@qq.com

Author for correspondence.E-mail：jou@shou.edu.cn