丹紅注射液對兔主動脈動脈粥樣硬化斑塊內脂聯(lián)素表達的影響

于志偉　姚曉偉　潘軍強

陜西省人民醫(yī)院心內二科(西安710069)

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丹紅注射液對兔主動脈動脈粥樣硬化斑塊內脂聯(lián)素表達的影響

于志偉姚曉偉潘軍強

陜西省人民醫(yī)院心內二科(西安710069)

目的：觀察丹紅注射液對兔動脈粥樣硬化斑塊內脂聯(lián)素表達的影響。方法：新西蘭兔36只，隨機分為高膽固醇飲食加丹紅注射液組、高膽固醇飲食組及對照組。喂養(yǎng)12周后處死實驗兔，取出實驗兔主動脈，觀察脂聯(lián)素在各組兔主動脈內膜中的表達。結果：內膜厚度、內膜/中膜厚度比、斑塊面積/血管內膜面積均在高膽固醇飲食組最高，高膽固醇飲食加丹紅注射液組次之，對照組最低，組間比較差異有顯著性(P<0.05)；免疫組化染色及Western blot結果均提示動脈粥樣硬化斑塊內脂聯(lián)素蛋白表達在對照組最高、高膽固醇飲食加丹紅注射液組次之、高膽固醇飲食組最低，組間比較差異有顯著性(P<0.05)。結論：丹紅注射液可上調高脂飲食所致動脈粥樣硬化兔主動脈粥樣硬化斑塊內脂聯(lián)素蛋白的表達，進而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)及其相關疾病是臨床常見病、多發(fā)病，隨著老齡化社會的發(fā)展，其致殘率逐步上升，同時也是世界公認的人類主要死亡原因[1]。脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)是由脂肪組織分泌的一個與胰島素抵抗密切相關的細胞因子，動物實驗證實其具有延緩動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的功能[2]。丹紅注射液主要由兩種傳統(tǒng)中藥材丹參和紅花的有效成分組成，具有活血化淤、通經舒絡的功效[3]，動物實驗證實其可延緩、抑制家兔AS發(fā)生、發(fā)展。本研究擬從分子生物學角度探討丹紅注射液對兔動脈粥樣硬化斑塊內ANP表達的影響。

1材料1.1實驗動物模型的建立及主動脈標本的留取自西安交通大學實驗動物中心購買新西蘭兔36只，兔齡2個月,體重1.5～2.0kg，均為雄性。將實驗兔隨機分為：高膽固醇飲食加丹紅注射液組(A組)、高膽固醇飲食組(B組)及對照組(C組)，每組均為12只。對照組飼喂正常飼料150 g/d；高膽固醇飲食者飼喂高膽固醇飼料(購自西安交通大學實驗動物中心)150 g/d；高膽固醇飲食加丹紅注射液組給予高膽固醇飼料150g/d+丹紅注射液15ml/kg/d(經耳緣靜脈注射)。各組實驗動物均喂養(yǎng)12周后處死，取出主動脈，去除血管外組織，生理鹽水沖洗后用中性甲醛液固定。

1.2實驗儀器及試劑脂聯(lián)素抗體(Anti-Adiponectin)，購自北京博奧森生物技術有限公司。步長制藥有限公司提供丹紅注射液(20ml/支)。免疫酶標組織化學染色檢測試劑盒購自武漢轉導生物科技發(fā)展有限公司。光學顯微鏡(BX-51型)OLYMPUS，Japan。病理圖文分析系統(tǒng) PIPS2000(重慶天海醫(yī)療設備有限公司)。

2試驗方法 2.1免疫組化特異性染色APN蛋白的表達陽性為血管壁染成棕黃色。免疫組化染色后用顯微鏡顯影系統(tǒng)自動采集圖像，隨機取6個視野(×400)，系統(tǒng)自動測量并計算出陽性信號積分光密度(A值)。

2.2Western-blot法測定主動脈APN蛋白組織溶漿后先提取總蛋白，后用BCA試劑盒測定蛋白總濃度。總蛋白50ug/孔上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白后轉膜，加入一抗(1：500鼠抗兔ANP單克隆抗體或者1：1000鼠抗兔β-actin)4℃孵育過夜。TBST浸洗后加入二抗(羊抗鼠IgG，1:1000稀釋)4℃孵育過夜。應用凝膠掃描成像系統(tǒng)中進行掃描分析，以β-actin作為內參。

3結果3.1三組間動脈粥樣硬化程度的比較 用內膜厚度(μm)、內膜/中膜厚度比(%)、斑塊面積/血管內膜面積(%)觀察動脈粥樣硬化程度。通過比較發(fā)現(xiàn)：內膜厚度(μm)、內膜/中膜厚度比(%)、斑塊面積/血管內膜面積(%)均在高膽固醇飲食組(A組)最高，高膽固醇飲食加丹紅注射液組(B組)次之，對照組(C組)最低，組間比較差異有顯著性(P<0.05)，見表1。

表1　三組間動脈粥樣硬化程度的比較

注:與B組及C組相比*P<0.05；與C組相比△P<0.05

3.2免疫組還染色觀察三組間APN的表達通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)兔動脈粥樣硬化斑塊內脂聯(lián)素蛋白在高膽固醇飲食組(A組)、高膽固醇飲食加丹紅注射液組(B組)、對照組(C組)的表達A值分別為：0.265±0.035、0.446±0.064、0.843±0.083，組間比較差異有顯著性(P<0.05)，見圖1。

圖1　主動脈AS斑塊脂聯(lián)素蛋白的表達(×400)

3.3Western blot檢測三組間AS斑塊內APN的表達Western blot檢測三組間AS斑塊內APN的表達，發(fā)現(xiàn)AS斑塊內APN蛋白表達分別為：高膽固醇飲食組(A組)最低為(0.265±0.015)，高膽固醇飲食加丹紅注射液組(B組)次之為(0.863±0.083)，對照組(C組)最高為(1.510±0.273)，組間比較差異有顯著性(P<0.05)，見圖2。

圖2　三組間聯(lián)素蛋白Western blot檢測結果比較

4討論APN是由成熟脂肪細胞分泌出一種蛋白質，因其具有抗炎、保護血管內皮、改善胰島素抵抗及動脈粥樣硬化發(fā)展等生物學活性，故又有“內源性生物活性多肽”之稱[4]。我們前期的研究結果提示APN在高脂飲食所致動脈粥樣硬化兔主動脈斑塊內表達明顯減低，驗證了其在抗動脈粥樣硬化中的作用[5]。丹紅注射液是由傳統(tǒng)中藥丹參、紅花有效提取物的主要成分組成的復合劑，其主要成分為丹參酮、丹參素、紅花黃色素、紅花苷等[6]。傳統(tǒng)醫(yī)學認為丹紅注射液具有活血化淤、通經舒絡之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證實：丹紅注射液具有降低血脂、抑制血小板聚集、改善內皮功能等作用，從而在臨床上廣泛用于心、腦血管疾病及外周血管等疾病的治療[7]。

高脂飲食所致兔嚴重動脈粥樣硬化模型是經典的研究動脈粥樣硬化及其相關疾病發(fā)病機制、治療方法的實驗模型[8]。此次研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食所誘發(fā)嚴重AS發(fā)生，而高膽固醇飲食加丹紅注射液組內膜厚度、內膜/中膜厚度比、斑塊面積/血管內膜面積均顯著低于高膽固醇飲食組，這說明丹紅注射液具有明顯抑制高脂血癥所致動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的作用。此外本研究從分子生物學角度出發(fā)，利用免疫組化技術及Western blot技術，更深層次探討了丹紅注射液在抗動脈粥樣硬化中的

作用，發(fā)現(xiàn)：高膽固醇飲食加丹紅注射液組主動脈動脈粥樣硬化斑塊內APN的表達顯著高于高膽固醇飲食組。這提示：丹紅注射液除了通過降低血脂、抑制血小板聚集、改善內皮功能等抗動脈粥樣硬化機制之外，其可能通過上調APN的基因表達從而抑制炎癥反應、改善胰島素抵抗，進而在抗動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用。至于丹紅注射液在動脈粥樣硬化過程中上調APN的確切機制有待于進一步研究。

[1]Ho SS.Current status of carotid ultrasound in atherosclerosis[J]. Quant Imaging Med Surg, 2016 ,6(3):285-296.

[2]Caselli C. Role of adiponectin system in insulin resistance[J]. Mol Genet Metab,2014,113(3):155-160.

[3]丹紅注射液對介入治療ST段抬高型急性心肌梗塞的療效觀察[J].陜西中醫(yī),2014,35(6):648-650.

[4]Skurk C, Wittchen F, Suckau L,et al.Description of a local cardiac adiponectin system and its deregulation in dilated cardiomyopathy[J]. Eur Heart J,2008,29(9):1168-1180.

[5]潘軍強,姚曉偉,周鑫，等. 鹽酸吡咯列酮對動脈粥樣硬化兔主動脈脂聯(lián)素表達的影響[J]. 西安交通大學學報(醫(yī)學版), 2014, 35(2):227-230.

[6] 付嬋, 羅娟敏, 王義明，等.多波長高效液相色譜法同時測定丹紅注射液中7種成分含量[J]. 中國新藥雜志,2012,21(23):2817-2820.

[7]Lv Y, Pan Y, Gao Y, et al.Effect of Danhong Injection Combined with Naoxintong Tablets on Prognosis and Inflammatory Factor Expression in Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Percutaneous Coronary Intervention[J]. Zhonghua Minguo Xin Zang Xue Hui Za Zhi, 2015,31(4):301-307.

[8]Dornas WC, Oliveira TT, Augusto LE, et al. Experimental atherosclerosis in rabbits[J]. Arq Bras Cardiol, 2010,95(2):272-278.

(收稿2016-04-17；修回2016-05-18)

*陜西省社會發(fā)展攻關項目資助(2004K17-G22)

腦脈粥樣硬化脂聯(lián)素@丹紅注射液動物，實驗兔

R743.1

A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.082

?陜西省富平縣人民醫(yī)院(富平711700)