徐德林 張 林 儲(chǔ)士潤 韋 欣 錢 剛 鄭明輝

(1.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，遵義563000； 2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院，遵義563000； 3.遵義醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室，遵義563000)

白及原生質(zhì)體的分離與純化

徐德林1張 林1儲(chǔ)士潤1韋 欣2錢 剛1鄭明輝3*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，遵義563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院，遵義563000；3.遵義醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室，遵義563000)

為建立起白及原生質(zhì)體分離純化的技術(shù)體系，以白及組培苗葉片為材料，經(jīng)不同方式預(yù)處理后，用不同濃度的纖維素酶、果膠酶、離析酶和甘露醇組合進(jìn)行酶解，將釋放出來的原生質(zhì)體用過濾和離心的方法進(jìn)行純化，最后用熒光素雙醋酸酯(FDA)法對(duì)純化的原生質(zhì)體進(jìn)行活力率測定，以期系統(tǒng)建立起酶解法從葉片中分離純化出白及原生質(zhì)體的技術(shù)流程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低溫黑暗+0.75 mol·L-1甘露醇條件下對(duì)葉片進(jìn)行預(yù)處理、酶液組合為1.5%纖維素酶Cellulase R-10+0.4%果膠酶Pectolyase Y-23+0.5%離析酶Macerozyme R-10+0.75 mol·L-1甘露醇、酶解液pH值保持在5.8、搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1、酶解4 h時(shí)，得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量最大，達(dá)4.72×106個(gè)·g-1，活力率也達(dá)90.4%。本研究構(gòu)建了用白及葉片分離和純化原生質(zhì)體的技術(shù)流程，為白及遺傳資源的拓展和遺傳改良奠定了一定的物質(zhì)和技術(shù)基礎(chǔ)。

白及；原生質(zhì)體；分離；純化；技術(shù)體系

白及(Bletillastriata)為蘭科(Orchidaceae)白及屬(Bletilla)多年生草本植物，是蘭科中既有藥用價(jià)值又有觀賞價(jià)值的中藥材。隨著白及用途的不斷增加，亟需開展種質(zhì)資源的保護(hù)與拓展以及優(yōu)良品系選育的研究。由于其自身的生物學(xué)特性[1]、生態(tài)環(huán)境破壞以及人類的過度采挖等原因，白及野生資源已日漸枯竭[2]，具備優(yōu)良中藥性狀的株系更是稀缺，致使白及已被我國列為珍稀瀕危的中藥物種，還被國際貿(mào)易公約(CITES)附錄二收錄而加以保護(hù)[3]。雖然一些學(xué)者試圖利用傳統(tǒng)的遺傳改良技術(shù)來分離、純化白及的優(yōu)良株系[4]，但是由于耗時(shí)長、成本投入高等缺點(diǎn)而阻礙了對(duì)優(yōu)良株系選擇的進(jìn)程。應(yīng)用生物工程技術(shù)拓展白及的遺傳資源，從中篩選出中藥性狀優(yōu)良的植株品系，不僅利于白及的遺傳改良、基因工程等研究，且對(duì)白及的規(guī)?；a(chǎn)與高效開發(fā)利用更有價(jià)值。

原生質(zhì)體是遺傳資源拓展的良好材料，是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，也是研究細(xì)胞壁、細(xì)胞膜功能、信息傳遞及植物激素作用機(jī)理的理想材料。利用原生質(zhì)體融合技術(shù)能有效克服遠(yuǎn)緣雜交不親和，培育出具有優(yōu)良性狀的新株系，因而植物原生質(zhì)在植物遺傳改良應(yīng)用研究與生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用廣泛。該技術(shù)同樣廣泛應(yīng)用于蘭科植物中的大花蕙蘭[5]、金釵石斛[6]等中草藥植物的研究與新品系創(chuàng)制中，然而筆者目前在國內(nèi)外文獻(xiàn)上未見該技術(shù)在白及方面應(yīng)用的研究報(bào)道。

本研究利用組織培養(yǎng)獲得的幼苗為研究材料，通過酶解法分離出原生質(zhì)體，并對(duì)其進(jìn)行純化與活力率檢測，探索出適合白及原生質(zhì)體分離和純化的步驟與方法，以期為后續(xù)原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞器分離和功能驗(yàn)證、細(xì)胞雜交和遺傳轉(zhuǎn)化等相關(guān)研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)組織培養(yǎng)試驗(yàn)材料系為成熟未開裂的白及蒴果，于2013年采自貴州省遵義市正安縣，并由遵義醫(yī)學(xué)院錢剛教授進(jìn)行鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)前期研究結(jié)果，用白及蒴果組培出苗，以組培苗的葉片為材料，選取嫩綠而飽滿的幼苗葉片，經(jīng)過黑暗低溫和甘露醇的預(yù)處理后(預(yù)處理方式見1.2.1)，在超凈工作臺(tái)中將其剪碎成為1 mm長寬左右的片段，放入培養(yǎng)皿中，將配制好的酶解液倒入培養(yǎng)皿中，并震蕩搖晃使酶液與葉片充分混勻。依據(jù)每克葉片碎片添加10 mL酶解液的比例來確定酶解液的使用量(酶解液配方篩選試驗(yàn)見1.2.2)。在培養(yǎng)皿中使葉片與酶解液充分接觸后用封口膜進(jìn)行培養(yǎng)皿的封口，置于恒溫?fù)u床上震蕩和酶解(搖床轉(zhuǎn)速和酶解時(shí)間試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別見1.2.3和1.2.4)。選用甘露醇作為保持原生質(zhì)體活力的滲透壓調(diào)節(jié)劑[7]，設(shè)置7個(gè)濃度梯度，比較分析不同濃度下原生質(zhì)體的活力率(見1.2.5)。酶解過程中，每間隔1 h吸取10微升的酶解液到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，將計(jì)數(shù)板放置在倒置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)酶解釋放出來的原生質(zhì)體數(shù)量和活力率(原生質(zhì)體純化、計(jì)數(shù)與活力率測定見1.2.6)。待計(jì)數(shù)的原生質(zhì)體數(shù)量不再增加時(shí)，用移液槍輕輕吹打混勻原生質(zhì)體與葉片酶解混合液，離心、清洗終止酶解。

1.2.1 酶解前葉片的不同預(yù)處理方式

對(duì)組培苗葉片進(jìn)行3種方式預(yù)處理，探索這3種預(yù)處理方式對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。這3種方式為低溫黑暗、甘露醇浸沒、低溫黑暗+甘露醇浸沒。其中，低溫黑暗預(yù)處理為置于4℃冰箱中避光保存12、24或48 h，甘露醇預(yù)處理為剪取葉片放入0.75 mol·L-1甘露醇溶液中浸泡1 h，低溫黑暗+甘露醇預(yù)處理為進(jìn)行黑暗低溫保存12、24或48 h后再進(jìn)行甘露醇浸泡1 h，預(yù)處理后的葉片置于酶解液中進(jìn)行原生質(zhì)體的分離。

1.2.2 酶解液配方篩選試驗(yàn)

取經(jīng)過黑暗低溫培養(yǎng)24 h+0.75 mol·L-1甘露醇浸泡1 h預(yù)處理后的組培苗葉片來探索不同配比的酶解液對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。用不同濃度的纖維素酶、果膠酶、離析酶組合成不同配比的酶解液進(jìn)行葉片的消化和原生質(zhì)體的分離，酶解液的pH值為5.8、甘露醇濃度為0.75 mol·L-1，酶解4 h。

1.2.3 不同酶解時(shí)間處理

將預(yù)處理后的葉片置于1.2.2鑒定出的最佳酶解液配方進(jìn)行消化酶解，在搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1的條件下，進(jìn)行2、4、6、8和10 h等5種不同時(shí)間的酶解，探索不同酶解時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響。

1.2.4 搖床不同轉(zhuǎn)速處理

用最佳酶解液對(duì)預(yù)處理葉片進(jìn)行酶解，在酶解時(shí)間為4 h的條件下，對(duì)比分析搖床轉(zhuǎn)速分別為60、90、120、150 r·min-1時(shí)分離出的原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力率的差異。

1.2.5 不同甘露醇濃度處理

取上述最佳條件下分離的活力率為91.2%的原生質(zhì)體，均分成若干份，分別加入濃度為0.3、0.45、0.55、0.6、0.75、0.85和0.9 mol·L-1的甘露醇，48 h后對(duì)原生質(zhì)離活力率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

上述預(yù)處理、酶液組合、酶解時(shí)間、轉(zhuǎn)速和甘露糖試驗(yàn)中，每個(gè)處理均進(jìn)行5次重復(fù)，通過對(duì)最終獲得的原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析來評(píng)價(jià)不同處理對(duì)結(jié)果的影響。

1.2.6 原生質(zhì)體的純化、計(jì)數(shù)與活力率測定

通過過濾和離心的方法純化原生質(zhì)體。將終止酶解的酶解液混合液用200目的細(xì)胞篩過濾來初步純化，濾除組織殘片與雜質(zhì)。收集濾液于2 mL離心管中，在離心機(jī)轉(zhuǎn)速500 r·min-1下離心5 min，離心后丟棄上清液，在原生質(zhì)體沉淀物中加入原生質(zhì)體清洗液(MES 1.0 mL+KCl 2.5 mL+Mannitol 5.0 mL+BSA 1.0 mL+CaCl2400 μL+ddH2O 100 μL/10 mL)，輕輕吹打混勻，300 r·min-1離心3 min后丟棄上清液，再加入清洗液如此反復(fù)清洗3～5次，即得到較為純凈的原生質(zhì)體。

用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)獲取的原生質(zhì)體數(shù)量。將填滿原生質(zhì)體混懸液計(jì)數(shù)室的計(jì)數(shù)板置于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算中央大方格中25個(gè)中方格內(nèi)原生質(zhì)體數(shù)量，連續(xù)計(jì)數(shù)3次，以每克葉片酶解分離得到原生質(zhì)體的個(gè)數(shù)(個(gè)/g)來表示產(chǎn)量。

1 mL懸浮液中原生質(zhì)體數(shù)=1個(gè)中央大方格懸浮液(0.1 mm3)中的細(xì)胞數(shù)×10×1 000

(1)

用熒光素雙醋酸酯(FDA)染色法來測定原生質(zhì)體的活力率[8]。在明光視野下觀察計(jì)數(shù)原生質(zhì)體總量，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)能發(fā)出黃綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)，用有活力的原生質(zhì)體占全部觀察原生質(zhì)體的百分比(原生質(zhì)體活力率)來衡量獲取樣品中原生質(zhì)體的活力，即：

原生質(zhì)體活力率=被染色的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)×100%

(2)

每個(gè)樣品的原生質(zhì)體活力率進(jìn)行計(jì)數(shù)3次，取平均值作為該樣品的最終活力率數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理方式對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

經(jīng)過預(yù)處理的原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力率均顯著提高。由表1可知，與對(duì)照組相比，無論是經(jīng)單獨(dú)的低溫黑暗預(yù)處理還是單獨(dú)的甘露醇浸沒預(yù)處理，或者是二者聯(lián)合的預(yù)處理，原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力率均有顯著提高。而其中先經(jīng)低溫黑暗預(yù)處理后再對(duì)葉片進(jìn)行甘露醇預(yù)處理，獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力率均達(dá)最大值，分別為4.68×106個(gè)·g-1和93%，故該種方式為最佳預(yù)處理方式。

表1不同預(yù)處理方式對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

Table1Effectofpretreatmentontheyieldandvitalityofprotoplasts

預(yù)處理方式Pretreatmentmethod處理時(shí)間Time(h)產(chǎn)量Yield(106g·FW-1)活力率Survivalrate(%)002．88±0．08f88．6±0．55e低溫黑暗Inlowtemperatureanddark123．50±0．07e88．0±0．71e低溫黑暗Inlowtemperatureanddark243．86±0．11d91．8±0．71c低溫黑暗Inlowtemperatureanddark482．36±0．10j89．8±0．84d0．75mol·L-1甘露醇浸沒Immersedin0．75mol·L-1mannitol14．38±0．08c91．2±0．84c低溫黑暗+0．75mol·L-1甘露醇浸沒Inlowtemperatureanddark+immersedin0．75mol·L-1mannitol12+14．54±0．05b92．0±0．70b低溫黑暗+0．75mol·L-1甘露醇浸沒Inlowtemperatureanddark+immersedin0．75mol·L-1mannitol24+14．68±0．08a93．0±0．71a低溫黑暗+0．75mol·L-1甘露醇浸沒Inlowtemperatureanddark+immersedin0．75mol·L-1mannitol48+13．82±0．13d90．0±0．70d

注：同列相同小寫字母代表差異不顯著；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) 下同。

Note: FW refers to the weight of fresh leaf. Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 levels respectively.The same as below.

2.2 不同酶液組合對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

不同的酶液組合對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力率有顯著影響(表2)。結(jié)果顯示，Cellulase R-10與Pectolyase Y-23單獨(dú)消化葉片均不能得到原生質(zhì)體，而當(dāng)二者組合時(shí)，均能獲得原生質(zhì)體，二者組合時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)3.26×106個(gè)·g-1、活力率達(dá)91.2%，進(jìn)一步在酶解液中添加0.5%的Macerozyme R-10后原生質(zhì)體產(chǎn)量能顯著提高，達(dá)4.64×106個(gè)·g-1，活力率也達(dá)最大值為91.6%，故1.5% Cellulase R-10+0.4% Pectolyase Y-23+0.5% Macerozyme R-10為最佳酶解液組合。此外，從表2還可以看出，當(dāng)果膠酶Pectolyase Y-23的添加量為0.4%時(shí)，隨著纖維素酶Cellulase R-10和離析酶Macerozyme R-10的添加量的不同，產(chǎn)生的白及原生質(zhì)體的產(chǎn)量有顯著差異(差異顯著性從a～e)，而活力率的顯著性變化幅度不太大(差異顯著性從a～c)，說明原生質(zhì)體的產(chǎn)量受纖維素酶Cellulase R-10和離析酶Macerozyme R-10濃度變化的影響十分顯著，而活力率對(duì)纖維素酶Cellulase R-10和離析酶Macerozyme R-10的濃度變化則沒有這么敏感。

表2不同酶液組合對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

Table2Effectsofenzymecomponentontheyieldandvitalityofprotoplasts

纖維素酶CellulaseR?10(%)果膠酶PectolyaseY?23(%)離析酶MacerozymeR?10(%)產(chǎn)量Yield(106g·FW-1)活力率Survivalrate(%)00．400—1．0000—1．00．402．36±0．11e90．2±0．84b1．50．403．26±0．11c91．2±1．30ab2．00．402．98±0．13d89．4±1．14ab1．00．40．5%3．94±0．12b90．6±0．55ab1．50．40．5%4．64±0．10a91．6±1．14a2．00．40．5%3．28±0．08c88．4±0．89c

2.3 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

酶解的時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力率的影響較大，過高的酶解時(shí)間易致原生質(zhì)體破裂，而過低的酶解時(shí)間影響其產(chǎn)量。本研究對(duì)酶解時(shí)間進(jìn)行了2、4、6、8和10 h篩選，由表3可見，酶解時(shí)間越短，其原生質(zhì)體活力率越高，酶解6 h后其產(chǎn)量與活力率均開始顯著下降。在酶解4 h時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)最大值，為4.72×106個(gè)·g-1。在該酶解時(shí)間下，盡管原生質(zhì)體的活力率(90.4%)比酶解2 h時(shí)(91.8%)有所下降，但差異并不顯著，而原生質(zhì)體產(chǎn)量卻比酶解2 h時(shí)的2.54×106個(gè)·g-1提高了86%，說明4 h是最佳酶解時(shí)間。

2.4 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

由于失去了細(xì)胞壁的保護(hù)，原生質(zhì)體對(duì)剪切力更加敏感，因而轉(zhuǎn)速大小與時(shí)間長短的選擇對(duì)獲取的原生質(zhì)體質(zhì)量有較大影響。本試驗(yàn)也證實(shí)不同的搖床轉(zhuǎn)速下分離獲取的原生質(zhì)體產(chǎn)量和質(zhì)量有明顯差異。如表4所示，在搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1時(shí)其原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)最大值，為47.0×106個(gè)·g-1而活力率也高達(dá)90.2%，因此120 r·min-1為酶解分離階段的最佳搖床轉(zhuǎn)速。

表3不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力率的影響

Table3Effectsofdissolvingtimeofenzymesontheyieldandvitalityofprotoplasts

酶解時(shí)間Enzymedissolvedtime(h)產(chǎn)量Yield(106g·FW-1)活力率Survivalrate(%)22．54±0．10c91．8±0．83a44．72±0．08a90．4±1．34a63．32±0．08b88．6±1．14b82．26±0．11d86．8±1．30c101．16±0．11e84．8±1．64d

表4不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力率的影響

Table4Effectsofrevolvingspeedontheyieldandvitalityofprotoplasts

轉(zhuǎn)速Revolvingspeed(RPM)產(chǎn)量Yield(106g·FW-1)活力率Survivalrate(%)602．74±0．10d91．4±0．89a903．30±0．07b90．4±1．14a1204．70±0．08a90．2±0．84a1503．04±0．13c82．8±1．30b

2.5 不同甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

甘露醇為分離原生質(zhì)體時(shí)理想的滲透壓調(diào)節(jié)劑，適宜的濃度對(duì)原生質(zhì)體穩(wěn)定分離與活力率具有重要影響。本試驗(yàn)對(duì)適宜白及原生質(zhì)的甘露醇濃度進(jìn)行了比較分析(表5)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甘露醇濃度從0.3 mol·L-1上升至0.75 mol·L-1時(shí)原生質(zhì)體的活力率也逐步升高，在甘露醇濃度為0.75 mol·L-1時(shí)活力率達(dá)最高，為68.8%，但當(dāng)甘露醇濃度繼續(xù)升高后原生質(zhì)體的活力率即開始逐漸降低。故適合白及原生質(zhì)體保存的甘露醇最佳濃度為0.75 mol·L-1。

表5不同甘露醇濃度速對(duì)原生質(zhì)體活力率影響

Table5Effectsofmannitolconcentrationonthevitalityofprotoplasts

甘露醇Mannitol(mol·L-1)活力率Survivalrate(%)0．3029．8±1．64f0．4536．4±1．14d0．5551．8±1．30c0．6064．0±1．00b0．7568．8±1．64a0．8533．2±1．79e0．9023．6±1．51j

2.6 原生質(zhì)體的純化與活力率測定

為獲得純化和高活力率的白及原生質(zhì)體，本研究在前人研究基礎(chǔ)[9]上采用過濾和離心法相結(jié)合的方法，對(duì)酶解獲得的原生質(zhì)體純化流程進(jìn)行了優(yōu)化，得到了較為純凈和高活力率的原生質(zhì)體(圖1)。

圖1 酶解分離的白及原生質(zhì)體 a.純化前的原生質(zhì)體；b.純化后的原生質(zhì)體；c.FDA染色后觀察到的原生質(zhì)體Fig.1 The protoplasts of Blettila striata isolated from this study a.The newly isolated protoplast; b.The purified protoplasts; c.The FDA-dyed protoplasts

3 討論

原生質(zhì)體分離的產(chǎn)量與活力率是原生體培養(yǎng)的基礎(chǔ)與關(guān)鍵因素。其中酶解液種類與濃度組合、酶解時(shí)間、預(yù)處理方式選擇、滲透壓穩(wěn)定劑濃度等對(duì)原生質(zhì)體的分離產(chǎn)量與活力率有直接影響[10～11]。本試驗(yàn)對(duì)影響白及原生質(zhì)體分離的不同因素進(jìn)行了多水平的對(duì)比分析和條件優(yōu)選。

較多的報(bào)道認(rèn)為進(jìn)行原生質(zhì)分離前，對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理能提高其產(chǎn)量與活力率。較為常用的預(yù)處理方法有低溫處理[12]、黑暗培養(yǎng)處理、甘露醇處理等。本研究對(duì)低溫黑暗、甘露醇、低溫黑暗+甘露醇預(yù)處理進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)無論材料經(jīng)過哪種預(yù)處理，原生質(zhì)體分離后其產(chǎn)量與活力率均明顯提高(表1)。黑暗環(huán)境使葉片不能進(jìn)行光合作用，加速葉片能量與物質(zhì)消耗，使得葉片萎蔫；萎蔫使葉片失水，細(xì)胞質(zhì)壁分離，酶液更加容易接觸細(xì)胞壁與果膠質(zhì)成分，使得原生質(zhì)體更易分離，而萎蔫過度則會(huì)使細(xì)胞死亡，從而降低原生質(zhì)體產(chǎn)量[13]。因此本試驗(yàn)低溫黑暗預(yù)處理>24 h后產(chǎn)量明顯降低。在不同預(yù)處理?xiàng)l件中，低溫+黑暗培養(yǎng)+甘露醇預(yù)處理的材料獲得白及原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力率均為最高(表1)，表明不同因素之間在預(yù)處理時(shí)具有相互促進(jìn)作用，采用多種因素組合進(jìn)行預(yù)處理，效果顯著優(yōu)于單一因素。本試驗(yàn)結(jié)果表明多因素組合進(jìn)行預(yù)處理能顯著提高白及原生質(zhì)體分離產(chǎn)量與活力率。

植物細(xì)胞壁中含有纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)與蛋白等，因而在采用纖維素酶與果膠酶，以酶解法來分解原生質(zhì)體。在藥用植物中纖維素酶與果膠酶的配合使用尤為常見，主要用來分解細(xì)胞中纖維素與果膠質(zhì)成分。本研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶與果膠酶配合能對(duì)白及原生質(zhì)體分離的分離效果好(表2)，與非洲紫羅蘭[14]、狗頭草[15]、金釵石斛[6]研究結(jié)果一致；然而加入離析酶后能顯著提高分離原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力率，表明離析酶配合纖維素酶與果膠酶能更好的原生質(zhì)體分離效果，該研究結(jié)果與石牌廣藿香[9]、擬南芥[11]等結(jié)果相一致。由于纖維素酶對(duì)原生質(zhì)體分離影響最大，本試驗(yàn)對(duì)纖維素酶濃度進(jìn)行了對(duì)比，從表2結(jié)果可見，無論是否添加離析酶，纖維素酶濃度為1.5%時(shí)分離原生質(zhì)的產(chǎn)量與活力率值最高，表明過高或過低濃度均不適宜白及原生質(zhì)體的分離。

對(duì)原生質(zhì)體酶解時(shí)，必須選擇合適的酶解時(shí)間，酶解時(shí)間的長短對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力率具有直接影響。表3可見，酶解時(shí)間越短，其活力率越高，表明酶解液時(shí)間越久，對(duì)原生質(zhì)體破壞越大，故在合適的酶解條件下，盡量選取較短的酶解時(shí)間進(jìn)行原生質(zhì)體分離。本試驗(yàn)結(jié)果白及原生質(zhì)體分離在4 h時(shí)，可獲得產(chǎn)量高、活力強(qiáng)原生質(zhì)體，這與松茸[16]等的酶解時(shí)間一致。

搖床轉(zhuǎn)速為物理因素，其他植物中原生質(zhì)分離研究時(shí)對(duì)物理因素影響方面研究報(bào)道相對(duì)較少。本試驗(yàn)對(duì)不同搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行了篩選，如表4可見，相同酶解時(shí)間下?lián)u床轉(zhuǎn)速對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力率影響有顯著差別，在搖床轉(zhuǎn)速為60 r·min-1時(shí)產(chǎn)量為2.74×106個(gè)·g-1，轉(zhuǎn)速120 r·min-1時(shí)產(chǎn)量高達(dá)4.70×106個(gè)·g-1，原生質(zhì)體活力率90.2%，但大于120 r·min-1其產(chǎn)量降低，活力率也明顯降低。

原生質(zhì)體由于無細(xì)胞壁的保護(hù)，對(duì)滲透壓較為敏感，適宜的滲透壓能持久保持其活力，滲透壓過低可使原生質(zhì)體發(fā)生破裂，過高滲透壓會(huì)對(duì)原生質(zhì)體照成擠壓，影響其活力率與產(chǎn)量[10]。不同植物對(duì)滲透壓穩(wěn)定劑的適宜濃度不同，本試驗(yàn)對(duì)滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇濃度進(jìn)行了對(duì)比，如表5所示，原生質(zhì)體保存48 h后，甘露醇濃度為0.75 mol·L-1時(shí)原生質(zhì)體活力率最高，因此甘露醇0.75 mol·L-1為白及原生質(zhì)體適宜滲透壓調(diào)節(jié)劑甘露醇最佳濃度值。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)白及葉片分離獲取原生質(zhì)體技術(shù)流程進(jìn)行了探索和條件優(yōu)化。材料選取上原生質(zhì)體分離純化以白及幼嫩葉片組織，經(jīng)過低溫+黑暗培養(yǎng)+0.75 mol·L-1Mannitol條件下的預(yù)處理，在酶液組合為0.75 mol·L-1Mannitol+1.5% Cellulase R-10+0.4% Pectolyase Y-23+0.5% Macerozyme R-10、酶解液pH值為5.8，分離時(shí)搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，酶解4 h得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量最大，可達(dá)4.72×106個(gè)·g-1，活力率可以達(dá)到90.4%。

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Natural Science Foundation of China(31560079);The Modernization and Industrialization Project of TCM in Guizhou Province(QKH-ZY[2013]3002);The Cooperation Program of Guizhou Province(QKH-LH[2014]7549);College Students’ Innovative Training Project of China in 2015(201513653003);The 15851# Talent Projects of Zunyi City in 2014(201424)

introduction： XU De-Lin(1981—),male,Ph.D. Mainly engaged in the Genetic Breeding of Traditional Chinese Medicinal Herbs.

date:2016-04-15

AProtocolfortheIsolationandPurificationofProtoplastfromBletillastriataLeaves

XU De-Lin1ZHANG Lin1CHU Shi-Run1WEI Xin2QIAN Gang1ZHENG Ming-Hui3*

(1.Department of Cell Biology,Zunyi Medical University,Zunyi 563000；2.Medicine and Technology School,Zunyi Medical University,Zunyi 563000；3.Department of Parasite,Zunyi Medical University,Zunyi 563000)

To construct a protocol of isolation and purification of protoplasts from the seedling leaves ofBletillastriata. After a series of pretreating assay, the leaves were enzymatic hydrolyzed with mixed solution of mannitol, Cellulase R-10, Pectolyase Y-23 and Macerozyme R-10 for certain hours. Then the newly released protoplasts were purified through filtration and centrifugalization. Finally, the harvest protoplastswere detected in the survival rate by means of fluorescein diacetate (FDA). The preprocessing of seedlings living in dark field for 12 h and the leaves were immersed in 0.75 mol·L-1mannitol for 1 h was the most effective way for protoplasts isolation. The enzymes mixture of 0.75 mol·L-1mannitol+1.5% Cellulase R-10+0.4% Pectolyase Y-23+0.5% Macerozyme R-10 was the optimism composition of enzyme solution. The pH of 5.8 and 4 h enzyme dissolve with the revolving speed of 120 r·min-1at room temperature was the best environmental condition. Under this optimal condition, abundant of 4.72×106protoplasts with survival rate of 90.4% could be harvested from each gram leaf. This study gave a necessary help for protoplasts culture, cell fusion and genetic transformation ofB.striata.

Bletillastriata;protoplast;isolation;purification;protocol

國家自然科學(xué)基金(31560079)；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(xiàng)(黔科合ZY字[2013]3002號(hào))；貴州省科技廳2014年聯(lián)合基金(黔科合LH字[2014]7549號(hào))；2015年國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201513653003)；遵義市2014年度“15851”人才工程(201424)

徐德林(1981—)，男，博士，主要從事中藥材遺傳育種研究。

* 通信作者：E-mail:ivying0209@hotmail.com

2016-04-15

* Corresponding author：E-mail:ivying0209@hotmail.com

Q945.4

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.05.023