胡衛(wèi)國，　安展飛，　劉秀霞，　戴曉峰，　楊艷坤*，白仲虎

（1．江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；2．江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3．江南大學 糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

生物反應(yīng)器中表達ScFv大腸桿菌細胞自溶的分析

胡衛(wèi)國1，2，3，安展飛1，2，3，劉秀霞1，2，3，戴曉峰1，2，3，楊艷坤*1，2，3，白仲虎1，2，3

（1．江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；2．江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3．江南大學 糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

表達外源蛋白細菌培養(yǎng)過程中的細胞自溶現(xiàn)象是一個普遍性的過程工程問題。在相同發(fā)酵培養(yǎng)條件下，研究生物反應(yīng)器中大腸桿菌W3110表達全人源化單鏈抗體片段 （Single chain antibody fragments，ScFv）工程菌和野生菌的外源蛋白表達及細胞活性的差異，發(fā)現(xiàn)外源蛋白高效表達并積累在細胞內(nèi)，大部分活細胞較野生菌提前6 h進入活著但不可培養(yǎng) （Viable but nonculturable，VBNC）狀態(tài)，進而發(fā)生細胞自溶。分析工程菌與野生菌中脅迫應(yīng)激和自溶途徑基因轉(zhuǎn)錄水平表達譜，發(fā)現(xiàn)外源蛋白表達過程中熱激途徑rpoH，dnaK，dnaJ，groEL，groES；酸脅迫途徑rpoS，gadE，gadX；氧脅迫途徑sodA，katE均出現(xiàn)表達波峰，而發(fā)酵罐中細胞自溶過程中外膜蛋白基因ompA，ompC，ompW，ompX表達量顯著下降，但rpoE并未出現(xiàn)持續(xù)高表達。這些發(fā)現(xiàn)為后續(xù)ScFv表達宿主細胞抗脅迫和自溶控制策略提供了新思路。

工程菌細胞自溶；活的不可培養(yǎng)狀態(tài)；σE途徑；脅迫應(yīng)激；生物反應(yīng)器

隨著現(xiàn)代基因工程的發(fā)展進步，大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）高效表達ScFv已經(jīng)實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)［1］。為了收獲高濃度高質(zhì)量的產(chǎn)品，此類外源蛋白質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)通常采用分批補料培養(yǎng)方式實現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng)并要求外源蛋白質(zhì)高效表達［2-3］。但由于生物反應(yīng)器中培養(yǎng)環(huán)境復(fù)雜多變，以及不同外源蛋白質(zhì)表達過程中基因和蛋白質(zhì)層次非常復(fù)雜，表達外源蛋白細菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過程中常出現(xiàn)不可預(yù)測的細胞自溶現(xiàn)象。

眾所周知，外源蛋白質(zhì)表達會導致細胞生理缺陷，在一定程度上對宿主細胞產(chǎn)生毒性和代謝負擔，降低細胞活性，有效生物合成代謝所需的能量減少［4-6］。而要進一步了解生物反應(yīng)器中重組菌細胞遭受的外源蛋白質(zhì)表達脅迫對細胞自溶的影響，需要了解外源蛋白質(zhì)表達與大腸桿菌宿主自身的脅迫應(yīng)激機制和自溶機制之間的關(guān)聯(lián)。

現(xiàn)在已廣泛認為大腸桿菌經(jīng)過長期進化已經(jīng)形成復(fù)雜精確的脅迫應(yīng)激機制，如熱脅迫應(yīng)激、酸脅迫應(yīng)激途徑、氧脅迫應(yīng)激途徑，它們通過調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物重構(gòu)相和磷酸化的信號傳導系統(tǒng)來適應(yīng)外界/內(nèi)部的多種多樣的刺激，包括溫度、pH、滲透壓、營養(yǎng)物質(zhì)濃度和細胞內(nèi)產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，或者周質(zhì)空間外源蛋白錯誤折疊積累等［7-9］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌內(nèi)存在類似于真核組織細胞凋亡的程序性死亡 （Programmed Cell Death，PCD）機制，調(diào)控細胞死亡及自溶的發(fā)生過程［10］。Murata等［11-12］基于搖瓶培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)了一條σE引導的大腸桿菌細胞自溶途徑，其被認為是細胞應(yīng)對不利環(huán)境或遭受脅迫時的一種內(nèi)在生存策略。即E.coli細胞由對數(shù)生長期進入穩(wěn)定期后，或細胞受發(fā)酵過程中因環(huán)境刺激如營養(yǎng)缺乏，或受培養(yǎng)液pH脅迫和氧化脅迫等脅迫時，大部分細胞由“活細胞”轉(zhuǎn)化為VBNC細胞，σE引導的細胞自溶機制的啟動用于清除這些VBNC，使得活細胞最大限度利用細胞釋放物來應(yīng)對營養(yǎng)缺乏環(huán)境，以保持較長的細菌穩(wěn)定期。

目前人們對細胞自溶機制的研究主要集中于搖瓶水平，在基因工程菌株表達外源蛋白質(zhì)的時候，人們往往需要在生物反應(yīng)器水平對其進行放大培養(yǎng)，以期收獲更多的目的蛋白質(zhì)，所以在生物反應(yīng)器水平研究生物反應(yīng)器中特定外源蛋白質(zhì)的表達對細胞活性和自溶影響的相關(guān)機理，其意義重大。

作者以表達人源化ScFv分子的E.coli W 3110（ATCC 39936）工程菌和野生菌為培養(yǎng)模型，在5 L生物反應(yīng)器水平相同培養(yǎng)條件下，研究了外源蛋白質(zhì)表達對細胞內(nèi)脅迫和自溶相關(guān)基因表達、細胞活性、細胞自溶現(xiàn)象的影響，為提高大腸桿菌工程菌細胞抗性及培養(yǎng)過程中細胞自溶的控制問題提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，實現(xiàn)重組蛋白生產(chǎn)效率的最大化。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株野生型E.coli W3110：作者所在實驗室保存的菌種；表達ScFv的工程菌所用質(zhì)粒pBW：作者所在實驗室保存。

1.1.2主要試劑和儀器總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBREx TaqTMII定量試劑盒：TaKaLa公司；5-氰基-2，3-二-（p-芐基-四唑氯化物）（5-cyano-2，3-ditolyl tetrazolium chloride，CTC）活細胞染料：美國Polyscience公司；5異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、胰蛋白胨：Sigma公司；酵母提取物：安琪酵母股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗所用引物由上海生物工程公司合成。發(fā)酵罐實時熒光定量PCR儀：美國產(chǎn)伯樂Bio-RADiCycler CFX96TM；微量紫外分光光度計：美國產(chǎn)Quawell Q5000型；常規(guī)分光光度計：美國產(chǎn)MAPADA UV-1800型；臺式離心機：美國產(chǎn)Thermo Scientific FRESCOL-7型；熒光顯微鏡：日本產(chǎn)OLYMPUSBX53F型生物熒光顯微鏡。

1.1.3培養(yǎng)基

1）LB種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，酵母粉 5，瓊脂糖20；pH 7.0。

2）TB/SB種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，酵母粉24，KH2PO42.31，K2HPO49.58，甘油10；pH 7.0。

3）TB/SB發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 24，酵母粉48，KH2PO422.31，K2HPO49.58，甘油25；pH 7.0。

4）Booster補料培養(yǎng)基（g/L）：甘油 714，酵母粉50，（NH4）2SO425。

1.1.4培養(yǎng)方法E.coli W3110在LB平板上37℃過夜培養(yǎng)后，挑單菌落接種至TB/SB搖瓶培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600=4），取100 mL種子液接種至2 L的TB/SB發(fā)酵培養(yǎng)基。使用荷蘭applikon ez-control-5 L發(fā)酵罐進行工作體積為2 L的分批補料發(fā)酵，溫度恒定控制在（30±0.1）℃，通過補加體積分數(shù)17%磷酸或體積分數(shù)25%氨水維持pH 7.0±0.05?？諝饬髁烤S持在2 L/（L·min），必要時通入1 L/（L·min）O2，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)控確保溶氧體積水平達到發(fā)酵罐中飽和溶氧的30%左右。在快速生長階段末期（DO Spiking），開始利用預(yù)先校準的蠕動泵以6mL/（h·L）流量補料。穩(wěn)定期初期添加終濃度100μmol/L的IPTG誘導外源ScFv表達，工程菌培養(yǎng)需要添加四環(huán)素至終質(zhì)量濃度15μg/mL（使用0.2μm醋酸纖維過濾膜過濾除菌）。

1.2檢測OD600和細胞干質(zhì)量（DCW）

使用紫外分光光度計OD600檢測菌體濃度。使用臺式離心機以12 000 g轉(zhuǎn)速離心1mL發(fā)酵上清液10min，棄上清液后在烘箱內(nèi)以90℃烘干至恒質(zhì)量，分析天平稱量干質(zhì)量。

1.3VBNC數(shù)目測量

1.3.1樣品處理在發(fā)酵不同階段收集樣品發(fā)酵液1 mL，使用0.01 mol/L PBS 10倍梯度稀釋發(fā)酵液，選取合適稀釋倍數(shù)稀釋液100μL涂布在LB瓊脂糖平板上計算CFU。同時，選取合適稀釋倍數(shù)稀釋液100μL，離心機上9 000 g，4℃離心3min后棄去上清液，用0.01mol/L PBS洗滌沉淀兩遍。

1.3.2CTC染色CTC染色活細胞計數(shù)參照Noor等［12-14］所述并稍微改動。100μLCTC溶液（0.01mol/L PBS溶液配制）加入到樣品中至終濃度為3mmol/L，然后在200 r/min、25℃搖床內(nèi)避光孵育染色 30 min?；罴毎ㄟ^電子傳遞可將CTC還原成CTF（CTC formazan，CTF），在細胞膜上形成紅色可見熒光沉淀。

1.3.3熒光顯微鏡計數(shù)如Hobbie等［15］描述，細胞隨后通過黑色聚碳酸酯膜 （孔徑0.2μm，直徑13 mm，Sartorius AG）過濾收集。利用生物熒光顯微鏡100倍油鏡（U Plan Semi Apochromat objective 100X/1.3，oil）和10倍目鏡（Widefield eyepiece 10X，focusable），隨機挑選10個視野計數(shù)并求平均值和標準差，視野中30～50細胞為宜，。OLYMPUS系列濾片為BP425-445 exc./FF593/BA628-640 em.。菌數(shù)計算

式（1）中：E為樣品中細菌總數(shù)（個）；X為各計數(shù)視野細菌總數(shù)的平均值（個）；S1為濾膜面積（mm2）；S2為顯微鏡油鏡的視野面積 （mm2）；V為待測VBNC細菌液的體積（mL）。VBNC數(shù)目等于同一樣品中活菌數(shù)減去CFU數(shù)目。

1.4RNA提取、cDNA合成和Real Time PCR檢測m RNA表達水平

取1 mL發(fā)酵液細胞（5×106～107個），立即以8 000 g（4℃，2 min）離心，棄去上清液，RT-PCR分析前沉淀于液氮中保存。按照TaKaRa RNAiso Plus總RNA提取試劑操作說明書提取E.coli細胞樣品中總RNA?？俁NA的質(zhì)量和純度通過測定OD260和OD280吸光度和2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢驗。根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑 （PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）說明書去除基因組DNA后反轉(zhuǎn)成cDNA，反應(yīng)體系和步驟為：總RNA 500 ng，5×g DNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，RNase Free dH2O補足至10μL，42℃反應(yīng)2 min。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及步驟為：去完基因組后反應(yīng)液5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL，RT Primer Mix 2.0μL，5×PrimeScript Buffer2（實時）2.0μL，RNase Free dH2O 1.0μL，補足至 10μL，37℃反轉(zhuǎn)錄15min，85℃5 s。進行Real Time PCR反應(yīng)，用到的引物序列見表1。使用TaKaRa SYBR○R Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）定量試劑反應(yīng)體系如下：SYBR○R Premix Ex TaqTM II（2x）5μL，PCR Forward Primer（10μmol/L）0.3μL，PCR Reverse Primer（10μmol/L）0.3μL，cDNA模板1μL，Sterile ddH2O 3.4μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。退火溫度根據(jù)不同引物有所不同。實時熒光定量PCR儀中進行RT-PCR，使用Sigma Plot Software對實驗結(jié)果分析。用2-△△Ct方法計算基因表達豐度。

表1　RT-PCR實驗引物序列Table 1　Sequences of the primers used in RT-PCR

1.5工程菌與野生菌相關(guān)脅迫基因與自溶基因表達水平比較方法

工程菌與野生菌平行發(fā)酵培養(yǎng)，分別在相同培養(yǎng)時間點3，6，7.5，9，12，15，24 h取樣；檢測上述自溶基因和脅迫基因表達量。

式（2）中：R為相對表達率，Eg為工程菌基因相對表達量，Ey為野生菌基因相對表達量。

1.6細胞自溶程度定義

工程菌和野生菌在第15 h進入穩(wěn)定期達到最大生物量，定義其后減少的生物量占最大生物量的比值為自溶程度

1.7酶聯(lián)免疫分析法（Elisa）檢測上清液和菌體中ScFv表達水平

將0.25 mg/mLHSA包被緩沖液加入96孔微孔板，100μL/孔，4℃過夜。去除包被液，每孔用PBST洗滌5次，加入150μL封閉液，37℃孵育1 h。同上洗滌5次，分別加入抗體樣品和對照液，50μL/孔，2復(fù)孔/樣品，37℃孵育1 h。同上每孔洗滌5次，每孔加入50μL酶標抗體HRP-proteinA（武漢博士德生物工程有限公司），37℃孵育1 h。同上每孔洗滌5次，加底物與顯色劑（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）混合液 100μL，37℃避光孵育15 min，再加入100μL 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在450 nm波長下用酶標儀檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1工程菌與野生菌自溶時間、程度及外源蛋白質(zhì)表達對比

發(fā)酵預(yù)實驗中DO spiking（說明初始甘油已經(jīng)耗盡）總是出現(xiàn)在（11.5±1）h，所以第9小時開始補料。1 h后添加IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導外源蛋白質(zhì)表達，此時OD600大于40。如圖1所示，工程菌生長狀態(tài)略差于野生菌，但工程菌和野生菌都大致在發(fā)酵15 h后進入穩(wěn)定期，不同的是野生菌維持穩(wěn)定期至24 h后開始自溶，而工程菌比不表達外源蛋白質(zhì)的野生菌細胞自溶提前6 h發(fā)生，第24小時自溶程度為18.3%，明顯高于野生菌。

本實驗中所用工程菌E.coli W3110所包含的質(zhì)粒為pBW（其中包含scFv基因），ScFv的表達受T7A3強啟動子調(diào)控，這套表達系統(tǒng)在宿主菌中只有極微弱的基底活動。如圖1所示，添加IPTG之前，細胞上清液和發(fā)酵液中幾乎沒有檢測到ScFv，說明構(gòu)建工程菌細胞ScFv分子基因的本底表達水平極低。而當補料1 h后添加IPTG，ScFv基因以0.906 mg/（g·h）的速度被快速誘導表達形成，其在誘導后3.5 h內(nèi)產(chǎn)量達到最大并積累在胞內(nèi)后，只有約占總產(chǎn)量1/5的ScFv分泌胞外上清液中。而不帶ScFv分子基因的野生菌幾乎沒有ScFv表達?？梢钥闯?，帶有外源基因質(zhì)粒的導入對細胞生長產(chǎn)生輕微抑制作用，外源蛋白質(zhì)的大量誘導表達與細胞提前自溶存在關(guān)聯(lián)性，這也是E.coli作為宿主細胞提高表達外源分泌蛋白質(zhì)產(chǎn)量的瓶頸所在［16］。

圖1　工程菌與野生菌自溶情況及外源蛋白質(zhì)表達對比Fig.1　Com parison of cell lysis and ScFv expression between Engineered E.coli and w ild-type E.coli

2.2工程菌與野生菌細胞活性對比

由圖2可知，工程菌在第10小時 （對數(shù)期后期）IPTG誘導外源蛋白質(zhì)大量表達后，CFU數(shù)目立即呈指數(shù)級下降，但10～18 h內(nèi)活細胞數(shù)目只是略微下降，說明外源蛋白質(zhì)大量表達積累對細胞產(chǎn)生毒害作用，導致大部分細胞活性降低成為VBNC狀態(tài)，這也是外源蛋白質(zhì)表達后活細胞數(shù)目略微下降，細胞沒有立即自溶的原因。第18小時后工程菌細胞發(fā)生大幅自溶，其活細胞數(shù)目呈指數(shù)級下降，而此時CFU數(shù)目下降幅度變緩，第24小時后CFU基本不變，這種現(xiàn)象說明發(fā)生自溶的細胞主要是VBNC狀態(tài)的細胞。野生菌同樣在第15小時后出現(xiàn)CFU指數(shù)下降，至24 h大部分細胞成為VBNC細胞后開始大幅自溶。

圖2　工程菌與野生菌活菌數(shù)、CFU數(shù)目對比Fig.2　Com parison of viable cell number and CFU between engineered E.coli and w ild-type E.coli

2.3工程菌與野生菌抗脅迫基因和自溶基因表達對比

2.3.1工程菌與野生菌熱脅迫應(yīng)激相關(guān)基因表達對比圖3是工程菌與野生菌熱脅迫應(yīng)激相關(guān)基因的動態(tài)行為對比，表明工程菌培養(yǎng)時間6～15 h內(nèi)，工程菌抗脅迫基因表達量高于野生菌，特別是添加IPTG誘導外源蛋白質(zhì)表達后，脅迫基因表達出現(xiàn)波峰現(xiàn)象。第6、7.5、9 h的rpoH基因表達量分別是野生菌相同時刻的3.17、3.60、2.77倍，說明外源基因的導入和基因工程改造對宿主菌產(chǎn)生了一些不利影響，一定程度上觸發(fā)了細胞內(nèi)熱脅迫應(yīng)激系統(tǒng)。而誘導表達外源蛋白質(zhì)過程中，第12小時時工程菌rpoH基因表達上調(diào)至野生菌的5.46倍，可見外源蛋白質(zhì)表達使這種作用表現(xiàn)得更加明顯。但是第13.5、15小時rpoH表達量又出現(xiàn)回落，甚至第24小時表達量低于野生菌數(shù)分之一，繼續(xù)監(jiān)測發(fā)酵結(jié)束時rpoH表達量，發(fā)現(xiàn)兩菌表達量幾乎檢測不到，所以數(shù)據(jù)上趨近于1。

圖3　大腸桿菌熱脅迫應(yīng)激相關(guān)基因相對表達率Fig.3　Relative expression rate of heat stresses response genes in E.coli

大腸桿菌熱應(yīng)激機理，rpoH基因編碼Sigma32調(diào)節(jié)子，通過調(diào)控dnaK/J-grpE和groEL/groES等分子伴侶蛋白基因，負責細胞熱脅迫應(yīng)激，降解錯配蛋白質(zhì)，阻止蛋白質(zhì)錯誤折疊，或使錯誤折疊蛋白質(zhì)復(fù)性［17-18］。原核生物的熱休克蛋白質(zhì)DnaK/DnaJ連接在未折疊好的多肽疏水片段來維持可溶性和防止聚集，而GrpE觸發(fā)核苷酸交換使DnaK和DnaJ從多肽上分離 （催化DnaK/DnaJ/多肽分解）［19-20］。大腸桿菌熱脅迫應(yīng)激反應(yīng)能迅速誘導熱休克蛋白質(zhì)（Heat Shock Proteins，HSPs）產(chǎn)生，隨后經(jīng)過一段適應(yīng)期HSPs合成速率下降至一個新的平衡水平。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，rpoH基因控制的熱脅迫相關(guān)基因 dnaK，dnaJ，groES，groEL的表達趨勢與rpoH一致，說明這些基因的表達是受rpoH調(diào)節(jié)子的嚴控。

2.3.2工程菌與野生菌酸脅迫應(yīng)激相關(guān)基因表達對比圖4是與酸脅迫相關(guān)的基因H-NS，rpoS，gadE，gadX的表達動態(tài)，其中H-NS在外源蛋白表達過程中的第12小時是野生菌的-28.8倍，而rpoS是6.12倍，值得注意的是，工程菌中g(shù)adE的表達在未誘導前第9小時高出工程菌200多倍，但是隨后在第12小時出現(xiàn)大幅下降但仍維持在高水平表達，gadE高水平表達的同時激活gad酸抗性系統(tǒng)中g(shù)ad脫羧酶和逆向轉(zhuǎn)運基因如gadX，這也說明外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生的脅迫能引起不同基因在不同水平上的差異。第15小時后發(fā)現(xiàn)工程菌這些基因和熱脅迫基因明顯低于野生菌表達水平，同時大量工程菌細胞在12～18 h內(nèi)成為VBNC細胞，并在18 h后開始出現(xiàn)強烈的細胞自溶，而野生菌出現(xiàn)自溶要比工程菌晚數(shù)小時，這也說明mRNA表達水平從某種意義上來說可以反映細胞的活性。繼續(xù)檢測至發(fā)酵結(jié)束后第48小時，發(fā)現(xiàn)工程菌與野生菌表達量基本持平?？赡茉诎l(fā)酵罐中，在第15至24小時表達外源蛋白質(zhì)工程菌細胞活性下降，細胞抗脅迫能力變?nèi)酢?/p>

H-NS基因是酸抗性（Acid resistance，AR）調(diào)節(jié)系統(tǒng)的高級調(diào)節(jié)子，促進rpoS mRNA降解和抑制某些氨基酸依賴的AR系統(tǒng)如gadX，adiY，cadC等調(diào)節(jié)子的表達［21-22］。所以當外源蛋白質(zhì)表達產(chǎn)生脅迫后，H-NS表達量反而降低，其對rpoS的抑制作用解除，直接或者間接地促進了gad酸抗性系統(tǒng)基因的表達。gadE是編碼谷氨酸鹽依賴型酸抗性系統(tǒng)的中心激活元件，H-NS直接或間接通過EvgA，YdeO，GadX和GadW等抑制gadE表達［23］，從結(jié)果可見，gadE在工程菌中表達量超出野生菌數(shù)百倍，差異巨大。

圖4　大腸桿菌酸脅迫應(yīng)激相關(guān)基因相對表達率Fig.4　Relative expression rate of acid stresses response genes in E.coli

2.3.3工程菌與野生菌氧脅迫應(yīng)激相關(guān)基因表達對比圖5顯示大腸桿菌中編碼超氧化物歧化酶的sodA［24］，編碼過氧化氫酶HPll的 katE［25］被認為能夠應(yīng)對突然氧脅迫對細胞造成的蛋白質(zhì)羰基化損傷［26］，IPTG誘導后第12小時高出數(shù)倍，但隨細胞生長速率下降到很低水平。

圖5　大腸桿菌氧脅迫應(yīng)激相關(guān)基因相對表達率Fig.5　Relative expression rate of oxygen stresses response genes in E.coli

2.3.4工程菌與野生菌自溶途徑相關(guān)基因表達對比圖6是Murata等發(fā)現(xiàn)的σE引導的自溶途徑基因的表達變化圖譜。外源蛋白質(zhì)表達前，工程菌rpoE基因表達低于野生菌，但外源蛋白質(zhì)表達后的第12小時，rpoE高水平表達，而ompA、ompC穩(wěn)定地稍高表達隨后驟降，而ompW、ompX雖然分別在第9小時和第6小時表達量突降，但外源蛋白質(zhì)表達過程中的第12小時后，其表達量同樣急升后再降低。rpoE編碼的σE最早是在研究編碼熱刺激σH因子的rpoH基因時被定義成σE轉(zhuǎn)錄因子，σE調(diào)控相關(guān)基因來修復(fù)熱刺激或其他外界脅迫造成的折疊異常的周質(zhì)蛋白質(zhì)或膜蛋白質(zhì)［27］。而Murata等［11，28］于2012年系統(tǒng)地闡述了一條完整的σE引導的細胞自溶途徑，即當細胞受到pH脅迫（pH stress）、氧化脅迫（Oxidative stress）、溫度脅迫（Heat shock）和營養(yǎng)物匱乏（Nutrient starvation）等環(huán)境脅迫時，未折疊好的周質(zhì)蛋白質(zhì)在周質(zhì)空間或細胞膜上積累到一定程度，σE蛋白質(zhì)在細胞質(zhì)內(nèi)被激活，調(diào)節(jié)sRNA-micA和rybB的基因轉(zhuǎn)錄，然后通過這兩個sRNA與同源mRNA的相互影響以及核糖核酸酶的降解作用，降低ompA、ompC和ompW外膜蛋白質(zhì)mRNA水平，進而減少這3個膜蛋白質(zhì)的表達，導致外膜缺陷，引起細胞的自溶。但是Murata等是基于大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)在對數(shù)期和穩(wěn)定期過表達rpoE基因，發(fā)現(xiàn)σE引導的自溶途徑使受損的VBNC細胞發(fā)生自溶。而在發(fā)酵罐細胞自溶過程中并沒有發(fā)現(xiàn)rpoE基因的持續(xù)性高表達。已知ompA作為細胞外膜極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)維持細胞菌體形態(tài)和親水化合物的跨膜傳遞，ompC是大腸桿菌細胞內(nèi)主要的陽離子選擇性孔蛋白質(zhì)［29］，它們在外源蛋白質(zhì)表達后表達量較野生菌降低。ompW編碼革蘭氏陰性菌中β-折疊小外膜蛋白質(zhì)應(yīng)對環(huán)境變化，但ompW，ompX的表達機制目前并不清楚，在結(jié)果中可以看出，細胞自溶過程中外膜蛋白基因表達量顯著下降［30-32］。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因為外源蛋白質(zhì)大量表達產(chǎn)生強烈脅迫導致細胞受損VBNC積累，細胞內(nèi)σE啟動激活以清除這些VBNC細胞，受σE自溶途徑負調(diào)控的ompA和ompC表達量減少，細胞外膜結(jié)構(gòu)破壞，隨后自溶發(fā)生［33］。這和基于搖瓶發(fā)現(xiàn)σE引導細胞自溶的現(xiàn)象一致。然而也發(fā)現(xiàn)，這些自溶相關(guān)基因在15 h后較野生菌表達量明顯下降，不同于Murata等利用rpoE基因的瞬時表達系統(tǒng)，其受誘導后rpoE基因持續(xù)高表達。分析自溶現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，σE引導的自溶現(xiàn)象特異性在穩(wěn)定期發(fā)生，當rpoE基因被誘導表達后，σE相關(guān)調(diào)控基因上下調(diào)，某些基因在時間上特異性表達增強或受阻［11］。這也許能說明在外源蛋白質(zhì)表達前，工程菌中rpoE并沒有高水平表達而導致自溶。

圖6　大腸桿菌σE引導的自溶途徑基因相對表達率Fig.6　Relative expression rate of cell lysis genes derected byσEin E.coli

3　結(jié)語

工程菌誘導表達的第10至18小時內(nèi)，ScFv高效表達至36.08 mg/L，且大部分積累在細胞內(nèi)。由脅迫基因轉(zhuǎn)錄水平可知，第10至15小時脅迫相關(guān)基因表達活躍，熱脅迫應(yīng)激基因rpoH，dnaK，dnaJ，groES，groEL表達量較野生菌高1～10倍不等；酸脅迫途徑基因H-NS表達量降低，其對酸脅迫應(yīng)激基因rpoS，gadE，gadX等的抑制作用解除，表達量較野生菌高至數(shù)十倍不等，甚至gadE出現(xiàn)超高表達（～237倍）；氧脅迫應(yīng)激基因sodA，katE表達量較野生菌高1～8倍不等。說明外源蛋白質(zhì)高效表達并積累在細胞內(nèi)引起多重細胞脅迫應(yīng)激反應(yīng)。由細胞生長狀態(tài)可知，外源蛋白質(zhì)表達后活細胞數(shù)維持在1010個/L，而CFU數(shù)目卻從第9小時的7.19×1010個/L驟降至第18小時的2.43×108個/L，說明大部分細胞成為VBNC細胞，而野生菌在此期間因無外源蛋白質(zhì)表達，細胞內(nèi)脅迫基因表達水平較工程菌低，所以大部分活細胞進入VBNC狀態(tài)出現(xiàn)在第24小時，比工程菌晚6 h。

工程菌和野生菌明顯細胞自溶現(xiàn)象分別發(fā)生在第18小時和第24小時，其生物量大幅降低，活細胞數(shù)目大幅降低，而CFU數(shù)目稍微降低，說明工程菌和野生菌發(fā)生細胞自溶的主要是VBNC狀態(tài)細胞。自溶相關(guān)基因rpoE在第12小時表達量達到最高，其調(diào)控的外膜蛋白ompA，ompC，ompW，ompX隨后表達量下降，但發(fā)酵罐中細胞在第12小時并沒有立即發(fā)生自溶現(xiàn)象，這和搖瓶水平自溶途徑啟動發(fā)生細胞自溶現(xiàn)象的結(jié)果有所不同。第10至18小時內(nèi)，工程菌相關(guān)脅迫基因和自溶基因表達量較野生菌低數(shù)倍至數(shù)十倍不等，原因是野生菌在這段時間內(nèi)處于穩(wěn)定期，細胞內(nèi)脅迫基因表達相對活躍，而工程菌中細胞活性驟降或死亡，抗脅迫能力極低。這個觀點可以在第24小時野生菌細胞活性下降發(fā)生自溶后，相關(guān)基因表達率持平得到印證。而σE引導的細胞自溶途徑中的關(guān)鍵調(diào)控元件rpoE并沒有在這段時間持續(xù)性高表達，說明細胞內(nèi)可能存在其他途徑導致細胞自溶。

通過研究知，發(fā)酵罐中發(fā)生細胞自溶的主要是VBNC細胞。因此，結(jié)合細胞脅迫應(yīng)激和自溶機理研究大腸桿菌生產(chǎn)過程中ScFv表達，對發(fā)酵罐中VBNC形成原因和數(shù)量變化以及控制細胞自溶過程至關(guān)重要?？梢酝ㄟ^進一步調(diào)查VBNC數(shù)目變化，了解評估外部或內(nèi)部脅迫對細胞的影響，以界定細胞生長狀態(tài)——維持存活還是發(fā)生自溶。

現(xiàn)在，以改造sigma因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控子為基礎(chǔ)的基因工程和合成代謝設(shè)計，已經(jīng)成為調(diào)節(jié)細菌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，提高細菌抗逆性和代謝物產(chǎn)量等菌種改造的重要工具［34］。Martin等［35］運用系統(tǒng)生物學的原理和方法，構(gòu)建脅迫誘導反饋調(diào)節(jié)機制來控制重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)，已經(jīng)實現(xiàn)通過脅迫誘導型啟動子感應(yīng)脅迫后來下調(diào)重組蛋白基因表達。進一步探索工程菌細胞中sigma因子引導的脅迫和自溶機制，將有助于尋找分子改造的靶點來提高細胞抗性和構(gòu)建自溶控制開關(guān)，從而平衡外源蛋白表達和細胞生長，實現(xiàn)產(chǎn)量的最大化。

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Cell Lysis Analysis of E.coli Expressing ScFv in Bioreactor

HUWeiguo1，2，3，AN Zhanfei1，2，3，LIU Xiuxia1，2，3，DAIXiaofeng1，2，3，YANG Yankun*1，2，3，BAIZhonghu1，2，3
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermention Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Cell lysis is a process problem in the protein expression using bacterial host.Under the same fermentation condition，the differences in the expression of foreign protein and cell activity between engineered and w ild-type Escherichia coli W 3110 expressed by the humanized single antibody fragments（ScFv）were studied.The resultsshowed thathigh expression and accumulation of heterologous protein in the engineered E.coli cellswere found，most living cells entered viable but nonculturable（VBNC）state 6 h in advance and the occurrence of cell lysis compared w ith w ild-type.Thought the analysis of transcription levels of both E.coli c，we found that the process of ScFv expression causing overshoot phenomenon of multiple stressed responses pathway genes included rpoH，dnaK，dnaJ，groES，groEL in heat stress response pathway，rpoS，gadE，gadX in acidstress response pathway，sodA，katE in oxygen stress response patheway.However，during cell lysis process in the fermentation tank，the expression of membrane protein gene ompA，ompC，ompW，ompX was significantly decreased，but rpoE did notappear to continue to be high expression.These findingsprovideusnew ideas to improve the resistanceofengineering bacteria cellsand control cells lysis.

engineering cell lysis，VBNC，σEpathway，stress response，bioreactor

Q 815

A

1673—1689（2016）09—0978—09

2014-11-29

國家973計劃項目（2013CB733602）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項項目（JUSRP51401A）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程項目。

楊艷坤（1978—），男，河北石家莊人，理學博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事微生物學、基因工程、分子遺傳、蛋白質(zhì)的分離純化等方面的研究。E-mail：yangyankun@jiangnan.edu.cn