響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶法提取青蛇果多酚工藝及其抗氧化活性

張 迪，劉 洋，李書藝,2,（.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué) 與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué) 湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430023）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶法提取青蛇果多酚工藝及其抗氧化活性

張 迪1，劉 洋1，李書藝1,2,*
（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué) 與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué) 湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430023）

以高酸度蘋果、富含原花青素的青蛇果為原料，采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了復(fù)合酶輔助提取青蛇果多酚的工藝參數(shù)。結(jié)果表明：最適多酚提取的復(fù)合酶為纖維素酶和果膠酶（質(zhì)量比2∶1）、酶解溫度62 .5 ℃、提取時(shí)間82.9 min、pH 3.7，多酚得率最高可達(dá)5.07%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，所選響應(yīng)面模型合適，并能廣泛用于青蛇果多酚的分析和預(yù)測(cè)。同時(shí)，酶法輔助提取青蛇果多酚的粗提物還具有較好的Fe3＋還原能力和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，其對(duì)DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50值）為22.72 ?g/mL，可以作為一種良好的食品添加劑和抗氧化劑深度開發(fā)利用。

青蛇果；多酚；復(fù)合酶法；響應(yīng)面設(shè)計(jì)；抗氧化性

我國(guó)是世界上蘋果產(chǎn)業(yè)規(guī)模最大的國(guó)家，2012年我國(guó)蘋果栽培面積和總產(chǎn)量分別達(dá)到2.3×104km2和3.8×107t[1]。蘋果中含有豐富的植物纖維、可溶性糖、礦物質(zhì)、蘋果酸、維生素、蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)。其中多酚類物質(zhì)主要為酚酸（如綠原酸）、原花青素（兒茶素、表兒茶素及其聚合物）和黃酮（以槲皮素為主），因其對(duì)蘋果汁顏色、風(fēng)味，如苦澀味、收斂性等的影響，越來(lái)越受到人們的關(guān)注[2-4]。研究表明，蘋果多酚不僅具有抗衰老、抗腫瘤、抑菌等的生物活性，還可作為食品添加劑和抗氧化劑用于肉制品，特別是腌制品中[5-6]。近年來(lái)，為了提高蘋果及其加工副產(chǎn)物中多酚的有效利用，研究者們已通過(guò)多種途徑，如有機(jī)溶劑提取、超聲波、微波輔助提取等試圖提高蘋果多酚的得率和活性[7-8]，但始終無(wú)法避免大量有機(jī)試劑如甲醇和乙醇的使用，造成了不可避免的環(huán)境污染和能源浪費(fèi)。基于蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀和蘋果多酚的多重功效，研究開發(fā)蘋果酚類物質(zhì)對(duì)改善我國(guó)蘋果加工企業(yè)的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，增加企業(yè)、果農(nóng)經(jīng)濟(jì)效益固然意義深遠(yuǎn)，但尋找更加綠色、低碳、環(huán)保的生產(chǎn)工藝，才真正符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高效安全制造和可持續(xù)發(fā)展的原則。

生物酶法（主要是纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等及其復(fù)合酶類）作為提取生物活性成分的新技術(shù)已十分成熟，并得到廣泛的應(yīng)用[9-10]。相對(duì)于超聲、微波法在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的局限性，酶處理方法在成本和使用上更加簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備和工藝的要求也較少[11]。酶反應(yīng)條件溫和，選擇性強(qiáng)，但目前為止仍未見用于蘋果多酚的提取和制備中。青蛇果（Malus domestica Borkh.）是一種高酸度的蘋果，源自美國(guó)，且富含原花青素[12-13]；肖俊松等[4]研究表明，青蛇果原花青素以低聚體為主，可通過(guò)TSK HW-40 s樹脂對(duì)原花青素B2和C1的純品進(jìn)行制備。因此，本課題采用生物酶法定向可控地制備了青蛇果多酚，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了復(fù)合酶低能耗分離提取多酚的條件工藝，并對(duì)粗提物的抗氧化活性進(jìn)行研究。以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用蘋果資源、提高蘋果產(chǎn)業(yè)附加值提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蛇果購(gòu)于本地超市，原產(chǎn)地秘魯。

纖維素酶（10 000 U/g）、果膠酶（30 000 U/g）合肥Biosharp生物科技有限公司；福林-酚試劑 美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇、沒(méi)食子酸、鐵氰化鉀等（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100分光光度計(jì) 美國(guó)尤尼科公司；水浴鍋鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Buchi公司。

1.3 方法

1.3.1 青蛇果多酚的提取

取5 g去核青蛇果切塊，放入0.1%的硫酸氫鈉溶液中浸泡數(shù)分鐘，然后取出在研缽中將其搗碎，并轉(zhuǎn)移至燒杯中。向燒杯中加入50 mL蒸餾水，50 ℃水浴加熱60 min，再通過(guò)200目濾布過(guò)濾，粗濾液于4 000 r/min離心10 min，上清液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮（至15 mL）后為青蛇果多酚粗提液，冷凍干燥可得蛇果粗提物粉末[4]。

1.3.2 粗提液多酚含量的測(cè)定

多酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法[14]，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在760 nm波長(zhǎng)測(cè)定反應(yīng)液吸光度，樣品多酚含量以沒(méi)食子酸的相對(duì)值表示，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

式中：K為青蛇果多酚得率/%；ρ為所測(cè)樣液的多酚含量/（mg/mL）；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積/mL；m為青蛇果質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 酶種類及其質(zhì)量濃度對(duì)多酚得率的影響

在青蛇果多酚的酶法制備過(guò)程中，影響多酚得率最重要的因素是酶的種類和有效質(zhì)量濃度。為研究這一因素對(duì)多酚得率的影響規(guī)律，本試驗(yàn)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了設(shè)置：控制酶解反應(yīng)溫度60 ℃、酶解pH 4，然后分別選擇不同質(zhì)量濃度的纖維素酶、果膠酶以及兩種酶的復(fù)合酶，使之與青蛇果進(jìn)行持續(xù)90 min的酶反應(yīng)。對(duì)提取液進(jìn)行同1.3.1節(jié)的過(guò)濾、離心和濃縮后，測(cè)定其多酚含量和得率，從而得到最優(yōu)的復(fù)合酶配比。

1.3.3.2 酶解時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

選取最優(yōu)復(fù)合酶，控制其他反應(yīng)條件（如酶解溫度、pH值）同1.3.3.1節(jié)，分別測(cè)定酶解時(shí)間為30、60、90、120、150 min時(shí)青蛇果多酚的得率。

1.3.3.3 酶解溫度對(duì)多酚得率的影響

選取最優(yōu)復(fù)合酶，控制其他反應(yīng)條件（如酶解時(shí)間、pH值）同1.3.3.1節(jié)，分別測(cè)定酶解溫度為30、40、50、60、70 ℃時(shí)青蛇果多酚的得率。

1.3.3.4 pH值對(duì)多酚得率的影響

選取最優(yōu)復(fù)合酶，控制其他反應(yīng)條件（如酶解溫度、時(shí)間）同1.3.3.1節(jié)，分別測(cè)定pH值為2、3、4、5、6時(shí)青蛇果多酚的得率。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)最優(yōu)復(fù)合酶的酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）和pH值（C）3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以期優(yōu)化青蛇果多酚的復(fù)合酶提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1。對(duì)各因素水平條件下青蛇果提取液的多酚含量進(jìn)行測(cè)定，并以計(jì)算所得青蛇果多酚的得率為響應(yīng)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)回歸分析。

表1 復(fù)合酶提取青蛇果多酚的響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Coded levels and corresponding actual values of factors used in in Box-Behnken design

1.3.5 青蛇果多酚的抗氧化活性

1.3.5.1 Fe3＋還原能力

采用普魯士藍(lán)法[15]，配制4 mmol/L鐵氰化鉀溶液、10%三氯乙酸溶液、2 mmol/L FeCl3溶液和pH 6.5的磷酸緩沖液。多酚可通過(guò)還原Fe3＋為Fe2＋，與鐵氰化鉀螯合形成一種藍(lán)色化合物，螯合物含量越高，該溶液在700 nm波長(zhǎng)處的吸光度就越大，即表示樣品還原Fe3＋生成Fe2＋的能力越強(qiáng)。以蒸餾水替代樣品為空白，相應(yīng)質(zhì)量濃度VC為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力

DPPH自由基是一種以氮為中心的化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的自由基，可用來(lái)評(píng)價(jià)多酚的抗氧化能力[16]。將 青蛇果多酚粗提物配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（20、40、80、100、200、400 μg/mL），取樣液2 mL加入等體積2 mmol/L DPPH溶液，充分混勻，于25 ℃避光反應(yīng)30 min。取出后，測(cè)定其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。用蒸餾水作空白，VC為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算DPPH自由基的清除率，如式（2）所示。并以清除率達(dá)到50%時(shí)提取物的質(zhì)量濃度表示其抗氧化能力，即IC50值（半數(shù)抑制濃度）。

式中：A0為空白對(duì)照組的吸光度；A1為樣品反應(yīng)組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶種類及其質(zhì)量濃度對(duì)多酚得率的影響

根據(jù)福林-酚法，各因素水平條件下青蛇果多酚提取液的多酚含量可通過(guò)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.008 5x＋0.045 6（R2＝0.997 6）進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明（表2），不同種類和配比的酶在質(zhì)量濃度不同（即酶活不同）的情況下，對(duì)青蛇果多酚的得率影響顯著，且多酚得率隨酶質(zhì)量濃度的提升呈現(xiàn)先增大后略有減少的趨勢(shì)。果膠酶、纖維素-果膠復(fù)合酶（質(zhì)量比1∶1、1∶2、2∶1）均在質(zhì)量濃度為2.05 mg/mL時(shí)，使青蛇果多酚的得率達(dá)到最大；而纖維素酶的質(zhì)量濃度達(dá)到2.55 mg/mL時(shí)，多酚得率才出現(xiàn)峰值。其中，由質(zhì)量濃度2.05 mg/mL的復(fù)合酶（質(zhì)量比2∶1）輔助提取時(shí)，青蛇果多酚的得率最高達(dá)到5.35%。因此本研究擬定質(zhì)量濃度為2.05 mg/mL的纖維素-果膠復(fù)合酶（質(zhì)量比2∶1）為最優(yōu)復(fù)合酶，并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表2 酶種類和質(zhì)量濃度對(duì)青蛇果多酚粗提液多酚得率的影響Table 2 Effect of enzyme type and concentration on the yield of polyphenols from Granny Smith apple

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

圖1 酶解時(shí)間對(duì)青蛇果多酚得率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on extraction yield of polyphenols from Granny Smith apple

由圖1可見，在90 min的提取時(shí)間內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，青蛇果多酚的得率逐漸上升；而90 min后得率逐步下降?？赡芘c 酶發(fā)揮作用的最適反應(yīng)時(shí)間和溫度有關(guān)，提取時(shí)間越長(zhǎng)未必越適合酶活力的發(fā)揮。因此，理想的青蛇果酶解時(shí)間為90 min，此時(shí)多酚得率最高。

2.1.3 酶解溫度對(duì)多酚得率的影響

圖2 酶解溫度對(duì)青蛇果多酚得率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on extraction yield of polyphenols from Granny Smith apple

由圖2可見，低于60 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活性也升高，多酚得率也隨之提高；但溫度超過(guò)60 ℃后，多酚得率開始下降，說(shuō)明當(dāng)溫度升高到一定程度時(shí)，酶蛋白開始受熱變性，使酶的活性降低，從而降低了多酚得率。因此擬確定青蛇果多酚提取的最佳酶解溫度應(yīng)約為60 ℃。

2.1.4 pH值對(duì)多酚得率的影響

圖3 pH值對(duì)青蛇果多酚得率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction yield of polyphenols from Granny Smith apple

由圖3可見，當(dāng)提取液pH 2.0～4.0時(shí)，青蛇果多酚得率隨著pH值升高而提高，在pH值大于4.0后青蛇果多酚得率隨著pH值的升高而下降。結(jié)果表明復(fù)合酶在pH 4.0條件下活性較好，因此將酶解最佳pH值定為4.0，此時(shí)青蛇果多酚的得率最高。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示 ，當(dāng)纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比2∶1（添加量2.05 mg/mL）、酶解時(shí)間90 min、酶解溫度60 ℃、pH 4.0時(shí)，青蛇果多酚有最大得率。青蛇果多酚提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果 如表3所示。根據(jù)1.3.4節(jié)中的設(shè)計(jì)將酶解時(shí)間、酶解溫度和pH值作變換，以青蛇果多酚得率為響應(yīng)值（Y），共設(shè)17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12 個(gè)為析因點(diǎn)，1 個(gè)為中心點(diǎn)，試驗(yàn)進(jìn)行了5 次，以估計(jì)誤差。利用Design-Expert 9.0軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn) 行多元回歸擬合，得到多酚得率對(duì)以上因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y＝5.14－0.031A＋0.017B－0.006 25C－0.015AB＋0.063AC－0.045BC－0.11A2－0.08B2－0.052C2。

表3 青蛇果多酚提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design for response surface analysis and corresponding results of polyphenol extraction from Granny Smith apple

2.2.2 回歸模型的方差分析

表4 多酚得率二次多項(xiàng)式回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the regression model for the extraction yield of polyphenols from Granny Smith apple

對(duì)酶輔助提取青蛇果多酚的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，以檢驗(yàn)方程的有效性和各因素的偏回歸系數(shù)，回歸模型的方差分析如表4所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，該試驗(yàn)選用的模型極顯著（P＜0.01），方差的失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.358 4＞0.05），即模型選擇合適；同時(shí)，所選模型的校正決定系數(shù)R2=0.922 9，表明此模型能解釋92.29%的結(jié)果值變化，僅有總變異7.71%不能用該模型解釋，基本可用于復(fù)合酶輔助提取青蛇果多酚得率的分析和預(yù)測(cè)。表4顯示，在此試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，除二次項(xiàng)AC、C2顯著（P＜0.05），A2、B2極顯著（P＜0.01）外，其余項(xiàng)均不顯著。

2 .2.3 響應(yīng)面交互作 用分析與最佳提取條件的確定

圖4 各因素交互作用對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of the effects of various hydrolysis conditions on the extraction yield of polyphenols from Granny Smith apple

如圖4所示，通過(guò)對(duì)3 個(gè)曲面的觀察可以預(yù)測(cè)和檢驗(yàn)變量的響應(yīng)值以及確定變量之間的 相互關(guān)系[17]，響應(yīng)面越陡，反映出各因素之間的兩兩交互作用越顯著。同樣，等高線的形狀也可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[18]。由響應(yīng)面的陡峭程度可知，酶解時(shí)間對(duì)青蛇果多酚得率的影響最大，其次是浸提液pH值和酶解溫度，這與方差分析結(jié)果一致。等高線圖顯示，固定酶解溫度60 ℃時(shí)，酶解時(shí)間與pH值的交互作用最顯著（圖4b）；相較而言，當(dāng)浸提液pH 4時(shí)，酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用較弱（圖4a）。

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)分析的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design-Expert 9.0 軟件，可獲得青蛇果多酚的最佳酶輔助提取條件，即酶解時(shí)間82.9 min、酶解溫度62.5 ℃、pH 3.7。在此條件下，青蛇果多酚得率最高，為5.15%。為驗(yàn)證此模型的可靠性，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，青蛇果多酚的實(shí)測(cè)平均得率為5.07%；與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為1.55%，說(shuō)明模型可以較好地反映出青蛇果多酚提取的條件，也再次證明了通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合酶提取青蛇果多酚的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化是可行的。

2.3 青蛇果多酚的抗氧化活性

圖5 不同質(zhì)量濃度青蛇果多酚對(duì)FFee33＋的還原能力Fig.5 Ferric ion reducing capacities of different concentration levels of polyphenols from Granny Smith apple

2.3.1 青蛇果多酚對(duì)Fe3＋的還原能力測(cè)定青蛇果多酚對(duì)Fe3＋的還原力，實(shí)際上是對(duì)提取物的供電子能力進(jìn)行檢驗(yàn)，還原力較強(qiáng)的物質(zhì)理論上也能更好地提供電子；一般條件下，抗氧化活性與樣品的還原能力有明顯的相關(guān)性，抗氧化能力的強(qiáng)弱能夠通過(guò)還原能力的強(qiáng)弱間接反映出來(lái)[19]。如圖5所示，不同質(zhì)量濃度的多酚樣品和VC均對(duì)Fe3＋具有一定的還原能力。雖然相同質(zhì)量濃度條件下青蛇果多酚的還原能力不如VC，但不難看出，即使是未經(jīng)深度純化和富集的多酚粗提物，隨著質(zhì)量濃度的增大，F(xiàn)e3＋還原力也呈現(xiàn)不斷增高的趨勢(shì)，表現(xiàn)出青蛇果多酚的抗氧化性和開發(fā)前景。

2.3.2 青蛇果多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖6 不同質(zhì)量濃度青蛇果多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activities of different concentration levels of polyphenols from Granny Smith apple

自由基通常指化學(xué)性質(zhì)較活潑的物質(zhì)，但存活期限極短；而DPPH自由基不同，其為化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定的自由基。因此，可通過(guò)DPPH自由基分析法，對(duì)抗氧化劑清除自由基的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)[20]。如圖6所示，青蛇果多酚和VC均對(duì)DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除力，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，青蛇果多酚對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增強(qiáng)并與VC接近，最大時(shí)可達(dá)90%以上。同時(shí)，數(shù)據(jù)處理表明青蛇果多酚粗提物清除DPPH自由基的IC50值約為22.72 μg/mL，屬于具有較強(qiáng)抗氧化活性的一類物質(zhì)，可深度開發(fā)。

3 討 論

通過(guò)生物酶法提取植物中的生物活性成分，實(shí) 際上是在傳統(tǒng)的溶劑提取方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)植物細(xì)胞壁的構(gòu)成，利用酶反應(yīng)所具有的高度專一性特點(diǎn)，選擇相應(yīng)的酶，將細(xì)胞壁的組成成分水解或降解，使有效成分充分暴露出來(lái)并溶解、混懸于溶劑中，從而提高得率[21-22]。蘋果，特別是青蛇果中含有大量果膠質(zhì)和纖維素類物質(zhì)，而青蛇果多酚幾乎被以纖維素和果膠為主要構(gòu)成的細(xì)胞壁所包圍[23-24]，因此本實(shí)驗(yàn)選用纖維素酶和果膠酶對(duì)蘋果果肉進(jìn)行酶解，并基于以上原理建立了復(fù)合酶法提取青蛇果多酚的工藝，以期得到較高的得率。采用復(fù)合酶輔助提取青蛇果肉多酚的最佳工藝條件為：纖維素酶和果膠酶復(fù)配（添加量2.05 mg/mL，質(zhì)量比2∶1）、酶解溫度62.5 ℃、水解時(shí)間82.9 min、pH 3.7。在此條件下，青蛇果多酚的得率可達(dá)5.07%，與傳統(tǒng)非酶法提取的青蛇果多酚相比提高了近50%（1.3.1節(jié)所得為傳統(tǒng)提取法蛇果多酚的粗提液，其多酚得率僅為3.47%）。更值得一提的是，酶法輔助整個(gè)提取過(guò)程無(wú)試劑污染，實(shí)現(xiàn)了綠色提取，符合低碳經(jīng)濟(jì)的原則。且其工藝較為簡(jiǎn)單，操作方便起來(lái)快捷、制備率較高，而且對(duì)環(huán)境污染較小，適用于蘋果多酚的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

另外，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)復(fù)合酶提取青蛇果多酚的抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，該多酚粗提物的Fe3＋還原能力和DPPH自由基清除能力均不如陽(yáng)性對(duì)照VC，但它們始終處于同一數(shù)量級(jí)。一般來(lái)說(shuō)，欲得到純度更高的植物多酚，粗提物還需經(jīng)過(guò)多級(jí)柱層析的富集和純化，如AB-8、XAD-7HP、LX-1等[3,5]，均是適于分離純化蘋果多酚的樹脂填料。上述水提青蛇果多酚的得率已可達(dá)到5%以上，倘若進(jìn)一步純化，其多酚含量或純度至少會(huì)提升10～20 倍[25-26]。因此，本方法所優(yōu)化提取的青蛇果多酚實(shí)際上是一種良好的天然抗氧化劑的前體物質(zhì)，極具深入研究和開發(fā)的價(jià)值。

[1] 蘇梅. 我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在的問(wèn)題及對(duì)策[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2013(2): 306-308.

[2] 常亞飛, 何云華, 黃淑萍, 等. 不同存儲(chǔ)溫度對(duì)蘋果多酚和黃酮類化合物含量的影響[J]. 應(yīng)用化工, 2015, 44(2): 217-219.

[3] 賀金娜. 蘋果多酚的制備、成分鑒定及其抗氧化性研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2014.

[4] 肖俊松, 曹雁平, 龔玉石, 等. 青蛇果原花青素分離和低聚體純品的制備[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(17): 113-119. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.17.026.

[5] 龐偉. 蘋果多酚的分離純化及抗氧化性研究[D]. 西安: 西北大學(xué), 2007.

[6] 李桂星, 胡曉丹, 孫紅男, 等. 模擬胃液條件下蘋果多酚對(duì)亞硝酸鹽的清除作用[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(11): 1-4.

[7] 王賢萍, 張倩茹, 尹蓉, 等. 超聲波輔助提取蘋果多酚優(yōu)化條件的研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊), 2014(7): 12-15.

[ 8] 艾志錄, 郭娟, 王育紅, 等. 微波輔助提取蘋果渣中蘋果多酚的工藝研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2006, 22(6): 188-191. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6819.2006.06.040.

[9] 王華斌, 王珊, 傅力. 酶法提取石榴皮多酚工藝研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2012, 12(6): 56-65. DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2012.06.009.

[10] 李浡, 李雙石, 蘭蓉, 等. 酶法提取葡萄藤莖中多酚物質(zhì)的含量比較研究[J]. 釀酒科技, 2 015(7): 38-40. DOI:10.13746/j.njkj.2014510.

[11] 楊云裳, 李帥斌, 李春雷, 等. 酶法浸提釀酒葡萄果渣中多酚的最優(yōu)工藝[J]. 蘭州理工大學(xué)報(bào), 2013, 39(3): 61-64. DOI:10.13295/j.cnki. jlut.2013.03.020.

[12] GU L, KELM M, HAMMERSTONE J, et al. Concentrations of proanthocyanidins in common foods and estimations of normal consumption[J]. Journal of Nutrition, 2004, 134: 613-617.

[13] HAMMERSTONE J, LAZARUS S, SCHMITZ H. Procyanidin content and variation in some commonly consumed foods[J]. Journal of Nutrition, 2000, 130: 2086-2092.

[14] VRHOVSEK U, RIGO A, TONON D, et al. Quantitation of polyphenols in different apple varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52: 6532-6538. DOI:10.1021/jf049317z.

[15] 周瑋婧. 荔枝皮原花青素的提取、純化以及抗氧化活性研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[16] ARDESTANI A, YAZDANPARAST R. Antioxidant and free radical scavenging potential of Achillea santolina extracts[J]. Food Chemistry, 2007, 104(1): 21-29. DOI:10.1016/j.foodchem.2006.10.066.

[17] 慕運(yùn)動(dòng). 響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào), 2001, 22(3): 91-94.

[18] 杜玉蘭, 黎慶濤, 王遠(yuǎn)輝. 響應(yīng)面法優(yōu)化鼠尾藻中脂質(zhì)的提取工藝[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2008, 20(6): 1091-1094. DOI:10.3969/ j.issn.1001-6880.2008.06.035.

[19] 楊小蘭, 袁婭, 郭曉暉, 等. 超高壓處理對(duì)不同品種獼猴桃漿多酚含量及其抗氧化活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(1): 73-77.

[20] 郭麗萍. 香蕉皮中多酚物質(zhì)抗氧化性能的研究[D]. 南寧: 廣西大學(xué), 2006.

[21] 王敏, 陸兆新, 呂鳳霞, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取銀杏葉總黃酮[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(3): 117-121. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2010.04.018.

[22] 汪志慧, 孫智達(dá), 謝筆鈞. 響應(yīng)面法優(yōu)化雙酶法提取蓮房原花青素[J].食品科學(xué), 2011, 32(4): 64-68.

[23] ALK F, FIALHO E. Polyphenol content and antioxidant capacity in organic and conventional plant foods[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2010, 23: 561-568. DOI:10.1016/j.jfca.2010.01.003.

[24] EWA C, ANNA G, WIKTOR A. Contents of polyphenols in fruit and vegetables[J]. Food Chemistry, 2006, 94: 135-142. DOI:10.1016/ j.foodchem.2004.11.015.

[25] 金瑩, 孫愛東. 大孔樹脂純化蘋果多酚的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(4): 160-162. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2007.04.035.

[26] 賀金娜, 曹棟, 史蘇佳. 大孔樹脂純化蘋果多酚的工藝優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2014, 40(5): 135-141. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ ts.2014.05.026.

Optimization of Multi-Enzymatic Extraction of Polyphenols from Granny Smith Apple and Their Antioxidant Activity

ZHANG Di1, LIU Yang1, LI Shuyi1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Hubei Provincial Key Laboratory for Agricultural Products Processing and Conversion, Wuhan Polytechnic University, Wu han 430023, China)

Granny Smith apple, an apple cultivar with high acidity, is rich in polyphenols, such as procyanidins. In this study, the extraction of polyphenols from Granny Smith apple by multi-enzymatic hydrolysis was optimized by the combined use of single factor method and Box-Behnken design. A mixture of cellulose and pectinase (2:1, m/m) was found to be the most efficient enzyme for the extraction of polyphenols. The maximum yield of polyphenols of 5.07% was obtained when the enzymatic extraction was done at 62.5 ℃ for 82.9 min with an initial pH of 3.7. According to the statistical analysis, the response surface model developed could be used to analyze and predict the extraction of polyphenols from Granny Smith apple effectively. Additionally, the polyphenols extracted from Granny Smith apple exhibited significant Fe3+reducing capacity and DPPH free radical scavenging activity and the half-inhibition concentration (IC50) for scavenging of DPPH free radical was 22.72 ?g/mL, showing that the extract is a good source of antioxidants, and could be further utilized and explored as a useful food additive or antioxidant.

Granny Smith apple; polyphenol; multi-enzymatic extraction; response surface methodology; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201604009

TS201.2

A

1002-6630（2016）04-0051-07

張迪, 劉洋, 李書藝. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶法提取青蛇果多酚工藝及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 51-57.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604009. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Di, LIU Yang, LI Shuyi. Optimization of the multi-enzymatic extraction of polyphenols from Granny Smith apple and their antioxidant activity[J]. Food Science, 2016, 37(4): 51-57. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201604009. http://www.spkx.net.cn

2015-06-24

武漢輕工大學(xué)本科生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（CXXL20151003）

張迪（1993—），男，學(xué)士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：zd1208@126.com

*通信作者：李書藝（1987—），女，講師，博士，研究方向?yàn)楣δ苁称放c食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：lishuyisz@sina.com