香葉醇對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜增生的抑制作用

江金垚，徐西子

香葉醇對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜增生的抑制作用

江金垚，徐西子

目的研究香葉醇對(duì)球囊損傷大鼠頸動(dòng)脈損傷后血管內(nèi)膜新生的影響及可能的機(jī)制。方法20只雄性成年SD大鼠，隨機(jī)均分為4組。（1）假手術(shù)組:不予以球囊損傷。（2）對(duì)照組:予以球囊損傷，不予以藥物干預(yù)。（3）低濃度組:球囊損傷后每日口服香葉醇50 mg/kg。（4）高濃度組:球囊損傷后每日口服香葉醇200 mg/kg。制作球囊損傷模型，2周后留取球囊損傷段血管制作病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色法測(cè)量內(nèi)膜與中膜（I/M）比值，免疫組化法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)，用積分光密度（IOD）值表示，并測(cè)定組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，對(duì)照組I/M比值、IOD值、8-OHdG及MDA水平均升高；與對(duì)照組比較，低濃度組I/M比值、IOD值、8-OHdG均降低，但MDA水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高濃度組與對(duì)照組比較I/M比值、IOD值、8-OHdG及MDA水平均降低，且較低濃度降低更明顯（P＜O.05）。結(jié)論香葉醇抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生，其機(jī)制可能與下調(diào)PCNA蛋白表達(dá)，抑制活性氧的產(chǎn)生有關(guān)。

頸動(dòng)脈損傷；血管內(nèi)膜；氧化性應(yīng)激；大鼠，Sprague-Dawley；疾病模型，動(dòng)物；香葉醇

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是當(dāng)前治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要手段，但PCI治療易產(chǎn)生支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosis，ISR）。盡管支架制作工藝的不斷改進(jìn)使ISR發(fā)生率從最初裸金屬支架時(shí)代的40%～50%降至目前藥物涂層支架時(shí)代的5%～10%，但研究顯示ISR仍是PCI術(shù)后的主要并發(fā)癥［1］。因此，尋求新的方法預(yù)防PCI術(shù)后再狹窄具有重要意義。香葉醇是一種天然植物醇，具有抗增殖［2］、阻滯細(xì)胞周期［3］、抗氧化應(yīng)激［4］、誘導(dǎo)凋亡［5］等作用。最近研究顯示，香葉醇能顯著降低血漿總膽固醇、三酰甘油水平［6］及脂肪代謝酶的表達(dá)［7］，表明其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的心血管保護(hù)作用。但是，目前尚少見有關(guān)香葉醇是否有抗ISR作用的研究。本研究通過建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，觀察香葉醇對(duì)球囊損傷之后血管新生內(nèi)膜形成的影響，探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料清潔級(jí)成年雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量（280±5）g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Cordis 2F球囊導(dǎo)管、香葉醇（Sigma公司，美國），增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）免疫組化試劑盒（博士德生物工程，中國），丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程，中國），8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）檢測(cè)試劑盒（Biosouce公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 頸動(dòng)脈球囊損傷模型制備大鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)3.6%的水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，備皮消毒，沿頸前正中切口切開頸部皮膚，游離左側(cè)頸動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，血管夾夾閉近心端頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，切開頸外動(dòng)脈，自切口處插入直徑2F球囊導(dǎo)管至頸總動(dòng)脈，以1.3 kg/cm2壓力擴(kuò)張球囊，并來回抽拉3～4次，使頸總動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷，退出球囊導(dǎo)管，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近端，移除頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈血管夾恢復(fù)血流，制備模型備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和處理20只大鼠隨機(jī)數(shù)字表法均分為4組，每組5只。（1）假手術(shù)組:不予以球囊損傷。（2）對(duì)照組:予以球囊損傷，不予以藥物干預(yù)。（3）低濃度組:球囊損傷后每日口服香葉醇50 mg/kg。（4）高濃度組:球囊損傷后每日口服香葉醇200 mg/kg。通過對(duì)照組與假手術(shù)組比較觀察球囊損傷對(duì)血管內(nèi)膜增生的刺激作用，通過低、高濃度組與對(duì)照組比較觀察不同濃度香葉醇對(duì)球囊損傷后血管內(nèi)膜增生的抑制作用。各組大鼠喂養(yǎng)2周后腹腔注射苯巴比妥處死，留取球囊損傷血管段，部分保存于4%甲醛以備形態(tài)學(xué)及免疫組化檢測(cè)。部分保存于-80℃冰箱以備氧化應(yīng)激等相關(guān)檢測(cè)。

1.2.3 形態(tài)學(xué)檢測(cè)取球囊損傷血管段制作石蠟切片，采用蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，并通過ImageJ 1.45計(jì)算內(nèi)膜與中膜（intima to media，I/M）比值［8］。

1.2.4 免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法檢測(cè)PCNA表達(dá)石蠟切片常規(guī)脫蠟，修復(fù)，血清封閉。低、高濃度組及對(duì)照組加入1∶100稀釋的抗PCNA抗體，假手術(shù)組加入磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗，4℃保存，而后常規(guī)加入二抗、顯色劑，棕褐色顆粒狀產(chǎn)物為陽性標(biāo)記。并通過ImageJ 1.45計(jì)算染色強(qiáng)度，用積分光密度（integrated optical density，IOD）值表示［8］。

1.2.5 香葉醇對(duì)球囊損傷血管氧化應(yīng)激的影響（1）球囊損傷血管中氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-OHdG的測(cè)定。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定，取保存于-80℃冰箱中的損傷血管段標(biāo)本吸干稱質(zhì)量，而后充分研磨，加入適量PBS混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清并定容。按試劑盒說明書所示操作并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，終止反應(yīng)后于波長450 nm的酶標(biāo)儀上讀取光密度（OD）值，根據(jù)OD值查找對(duì)應(yīng)濃度，計(jì)算每克組織的8-OHdG含量（濃度×容積÷取樣量）。（2）MDA的測(cè)定。取保存于-80℃冰箱中的損傷血管段標(biāo)本吸干稱質(zhì)量，而后充分研磨，按試劑盒說明書設(shè)空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)試管及對(duì)照管，95℃水浴40 min，冷卻，經(jīng)4 000 r/min，離心10 min，取上清液，分光光度計(jì)532 nm處測(cè)定OD值。測(cè)定樣本中蛋白含量，計(jì)算MDA含量:MDA=（測(cè)定管OD-測(cè)定空白管OD）÷（標(biāo)準(zhǔn)管OD-標(biāo)準(zhǔn)空白管OD）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷取樣量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用xˉ±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜變化對(duì)照組較假手術(shù)組I/M比值升高，血管內(nèi)膜增生明顯；與對(duì)照組比較，低、高濃度組I/M比值降低，血管內(nèi)膜增生受到抑制，且高濃度組較低濃度組抑制內(nèi)膜增生的效應(yīng)更明顯（P＜0.05），見表1、圖1。

Tab.1Comparison of I/M ratio，IOD，8-OHdG and MDA values between four groups表1 各組I/M比值、IOD值、8-OHdG及MDA比較

2.2 香葉醇對(duì)球囊損傷血管內(nèi)膜PCNA表達(dá)的影響對(duì)照組IOD值較假手術(shù)組升高，PCNA陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，低、高濃度組IOD值降低，血管內(nèi)膜增生受到抑制，且高濃度組較低濃度組抑制PCNA表達(dá)的效應(yīng)更明顯（P＜0.05），見表1、圖2。

2.3 香葉醇對(duì)球囊損傷血管氧化應(yīng)激的影響對(duì)照組8-OHdG和MDA較假手術(shù)組均增加（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，低濃度組8-OHdG釋放受抑制，但MDA水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高濃度組8-OHdG和MDA均受抑制，且其較低濃度組抑制效應(yīng)更明顯（P＜0.05），見表1。

Fig.1Effects of GOH on balloon injury-induced neointimal hyperplasia in rat carotid arteries（HE，×100）圖1 香葉醇對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的影響（HE，×100）

Fig.2Effects of GOH on PCNA expression in rat carotid arteries（immunohistochemical staining，×100）圖2 香葉醇對(duì)血管壁PCNA表達(dá)的影響（免疫組化染色，×100）

3 討論

目前，對(duì)于PCI術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生機(jī)制，一般認(rèn)為是由于球囊擴(kuò)張破壞粥樣硬化斑塊，致血小板黏附、聚集和激活造成。研究認(rèn)為，活化的血小板可釋放多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，引起平滑肌細(xì)胞增生、白細(xì)胞募集和凝血瀑布激活，平滑肌細(xì)胞由收縮狀態(tài)轉(zhuǎn)變到合成狀態(tài)，從血管中膜開始增殖，并逐漸從中膜遷移至內(nèi)膜，隨后形成新生內(nèi)膜，各種炎性細(xì)胞如單核細(xì)胞、T細(xì)胞和少量的B細(xì)胞在這一過程中被募集，再加上透明質(zhì)酸、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致血管再狹窄的發(fā)生［9］。PCI術(shù)后血管再狹窄實(shí)際是局部血管損傷后的再修復(fù)過程，這個(gè)過程中涉及血管彈性回縮，血栓形成，炎癥因子活化，以及血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡［10］。

天然香葉醇是一種抗癌劑，其作用包括抑制細(xì)胞遷移、下調(diào)PCNA表達(dá)、抑制ERK信號(hào)通路磷酸化、抑制活性氧生成等，從而抑制細(xì)胞增殖，抑制B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）家族蛋白等表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2，11］。相關(guān)研究認(rèn)為，香葉醇具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［6-7］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低、高濃度組I/M比值降低，表明血管內(nèi)膜增生受到明顯抑制，且高濃度組較低濃度組抑制內(nèi)膜增生的效應(yīng)更明顯，提示香葉醇具有抗新生內(nèi)膜形成的作用，香葉醇能對(duì)抗PCI術(shù)后的血管再狹窄。

PCNA又稱為細(xì)胞周期蛋白（Cyclin），是一種核內(nèi)蛋白質(zhì)，是DNA聚合酶δ的輔因子，集中分布在增殖細(xì)胞有絲分裂G1晚期和S早期的核仁，參與DNA合成與復(fù)制，其合成和細(xì)胞DNA的復(fù)制呈直接相關(guān)，對(duì)細(xì)胞增殖起重要調(diào)控作用［12］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低、高濃度組IOD值降低，血管內(nèi)膜增生受到抑制，且高濃度組較低濃度組抑制PCNA表達(dá)的效應(yīng)更明顯，表明香葉醇可抑制細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)，這與香葉醇抑制頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜形成結(jié)果一致。

8-OHdG是敏感的DNA損害標(biāo)志物，因一個(gè)羥基接在鳥嘌呤的第8個(gè)碳上而形成。DNA損害過程由氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的羥自由基所誘導(dǎo)，因而可將其可作為氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。MDA是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物，是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用而產(chǎn)生。由于介入性動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后，局部血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞可通過NADH/NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生活性氧，活性氧作為第二信使可改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)平衡狀態(tài)，直接或間接激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)蛋白激酶及轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致血管再狹窄的發(fā)生［13］，因此，活性氧的產(chǎn)生對(duì)血管再狹窄的發(fā)生起到了重要作用，本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，對(duì)照組8-OHdG和MDA均增加；與對(duì)照組比較，低濃度組8-OHdG釋放受抑制，但MDA水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高濃度組與對(duì)照組比較，8-OHdG和MDA均受抑制，且較低濃度組抑制效應(yīng)更明顯。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了香葉醇對(duì)血管新生內(nèi)膜的抑制作用，其作用機(jī)制涉及香葉醇下調(diào)PCNA蛋白表達(dá)，抑制活性氧的產(chǎn)生，香葉醇對(duì)預(yù)防PCI后血管再狹窄能起到很好的作用。然而，本研究設(shè)計(jì)的濃度對(duì)照較少，尚不能明確揭示香葉醇抑制血管新生內(nèi)膜形成及其相關(guān)機(jī)制的劑量依賴效應(yīng)，后續(xù)有待進(jìn)一步研究深入。

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（2016-04-11收稿2016-06-01修回）

（本文編輯陸榮展）

Geraniol attenuates vascular smooth muscle cell proliferation in rat carotid artery balloon injury model

JIANG Jinyao△，XU Xizi
Department of Cardiology，the Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China

ObjectiveTo evaluate the effects of geraniol（GOH）on neointima hyperplasia in rat carotid artery balloon injury model，and explore the potential molecular mechanisms associated with this effect.MethodsTotally 20 male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into sham operation group（without balloon injury），control group（with balloon injury），low concentration group（with 50 mg/kg GOH intervention after balloon injury）and high concentration group（with 200 mg/kg GOH intervention after balloon injury）.The intima to media（I/M）area ratio of neointima was measured by hematoxylin-eosin（HE）staining.The expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）was measured by immunohistochemical staining at 14thday after operation.As the marker of oxidative stress，the levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine（8-OHdG）and malondialdehyde（MDA）were measured by enzyme linked inmmnosorbent assay（ELISA）. ResultsThe I/M ratio，IOD，8-OHdG and MDA values were increased in control group compared with those of sham group. The I/M ratio，IOD and 8-OHdG values were reduced in low concentration group compared with those of control group.But there was no significant difference in MDA level between low concentration group and control group.The I/M ratio，IOD，8-OHdG and MDA values were significantly reduced in high concentration group compared with those of control group，which showed a more significant inhibitory effect than that of low concentration group（P＜0.05）.ConclusionGOH could attenuate balloon iniury induced neointima hyperplasia，which might be related to its effect on inhibiting expression of PCNA and decreasing oxidative stress.

carotid artery injuries；tunica intima；oxidative stress；rats，Sprague-Dawley；disease models，animal；Geraniol

R543.5

A

10.11958/20160290

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟科（郵編300211）

江金垚（1987），男，碩士，主要從事冠心病基礎(chǔ)研究