張桂賢，劉大衛(wèi)，聶衛(wèi)，張一，劉韋鋆，劉洪斌△

P2X7R拮抗劑對(duì)小鼠慢性胰腺炎的作用及機(jī)制研究

張桂賢1，劉大衛(wèi)1，聶衛(wèi)1，張一2，劉韋鋆2，劉洪斌1△

目的探討嘌呤能P2X7受體（P2X7R）拮抗劑——氧化三磷酸腺苷（OxATP）和亮藍(lán)G（BBG）在抑制下游靶蛋白——核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NLRP3）炎性體活化和慢性胰腺炎（CP）胰腺纖維化進(jìn)程中的作用及可能機(jī)制。方法40只C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、CP模型組、OxATP組和BBG組。除正常對(duì)照組腹腔注射與處理組等體積的生理鹽水外，其余組均通過(guò)腹腔注射雨蛙素法制作CP小鼠模型（6周）。造模結(jié)束后，CP模型組、OxATP組和BBG組分別予以腹腔注射生理鹽水、OxATP（20 μL，300 μmol/L）和BBG（20 μL，10 μmol/L）處理，連續(xù)注射2周。然后處死各組小鼠并取胰腺組織，行病理學(xué)檢查，以HE染色對(duì)胰腺病理組織學(xué)（炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺泡萎縮及纖維化程度）進(jìn)行評(píng)分，天狼星紅染色和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）免疫組化染色分別對(duì)胰腺纖維化程度進(jìn)行評(píng)估；免疫組化法檢測(cè)胰腺P2X7R、NLRP3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）中的累積光密度（IOD）值。結(jié)果與正常對(duì)照組比，CP模型組炎癥損傷組織學(xué)評(píng)分增加，胰腺纖維化程度顯著增加，P2X7R、NLRP3和Caspase-1免疫組化IOD值顯著升高（P＜0.05）；與CP模型組相比，OxATP和BBG組炎癥損傷組織學(xué)評(píng)分降低，HE染色纖維化評(píng)分、天狼星紅染色和α-SMA免疫組化染色均顯著減輕（P＜0.05），胰腺P2X7R、NLRP3和Caspase-1 IOD值均明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)2X7R拮抗劑OxATP和BBG能夠顯著減輕CP小鼠模型的慢性炎癥和纖維化程度，阻斷P2X7R-NLRP3炎性體信號(hào)通路，這有望成為治療CP及其纖維化進(jìn)程的一種潛在新策略。

胰腺炎，慢性；纖維化；嘌呤能P2X7受體；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3；氧化三磷酸腺苷；亮藍(lán)G；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是各種病因引起的胰腺組織功能呈不可逆性改變的慢性炎癥性疾病。CP基本病理特征包括胰腺實(shí)質(zhì)慢性炎癥損害、間質(zhì)纖維化、胰腺實(shí)質(zhì)鈣化、胰管擴(kuò)張及胰管結(jié)石等［1］。CP臨床上主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的上腹部疼痛和胰腺內(nèi)外分泌功能不全，極大地影響患者的工作和生活質(zhì)量［2］。迄今，CP的發(fā)病機(jī)制尚未明確，也無(wú)理想治療方案。P2X7R-核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NLRP3）是多種慢性炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，與肺、腎等器官纖維化關(guān)系密切，但目前對(duì)其與CP胰腺纖維化的關(guān)系研究尚少。本研究采用反復(fù)注射雨蛙素的方法誘導(dǎo)CP小鼠模型［3］，通過(guò)分析氧化三磷酸腺苷（Oxidized ATP，OxATP）和亮藍(lán)G（Brilliant Blue G，BBG）對(duì)嘌呤能P2X7受體（Purinergic P2X7 receptor，P2X7R）的拮抗作用，探究NLRP3炎性體信號(hào)通路在CP纖維化過(guò)程中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（批號(hào):11400700097218）。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，于動(dòng)物中心屏障級(jí)動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)，每籠5只，所用飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)（批號(hào):15063231）。墊料為普通級(jí)玉米芯墊料（批號(hào):15019811）。飲用水為純凈水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物自由攝食、飲水，12 h交替照明，室溫23℃± 2℃，相對(duì)濕度（55±5）%。

1.2 主要試劑及儀器（1）樣品與試劑。雨蛙素、Ox-ATP及BBG均購(gòu)自Sigma公司；天狼星紅及天青石藍(lán)液購(gòu)自FLuka公司；羊多克隆抗體anti-P2X7R（稀釋至1∶400）、兔多克隆抗體anti-NLRP3（稀釋至1∶200）、山羊多克隆抗體半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1，稀釋至1∶400）均購(gòu)自Santa Cruz公司。（2）實(shí)驗(yàn)儀器。DM4000B型研究級(jí)顯微鏡、RM2235/2245型切片機(jī)、ASP300全自動(dòng)組織脫水機(jī)及DM750P型偏振光顯微鏡均購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3 模型制作與分組40只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、CP模型組、OxATP組和BBG組，每組10只。正常對(duì)照組在整個(gè)8周研究期間均腹腔注射與處理組動(dòng)物等體積生理鹽水；其余各組動(dòng)物均采用反復(fù)腹腔注射雨蛙素的方法制作小鼠CP模型，單次注射劑量為50 μg/kg，1次/h，6次/d，每周一、三、五注射，連續(xù)6周。在前期藥效學(xué)預(yù)實(shí)驗(yàn)及急性毒性實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)［4-5］，在第7～8周，CP模型組改為腹腔注射等體積生理鹽水，2次/d，連續(xù)2周；OxATP組和BBG組則分別腹腔注射P2X7R拮抗劑OxATP（20 μL，300 μmol/L）和BBG（20 μL，10 μmol/L）2次/d，連續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，頸椎脫臼處死所有動(dòng)物，快速剪取胰腺組織，一部分迅速置于液氮中冷凍，剩余胰腺組織10%福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，供HE、免疫組化和苦味酸-天狼星紅染色。

1.4 HE染色及炎癥損傷程度評(píng)分將10%福爾馬林固定的胰腺組織按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行石蠟包埋，4 μm切片。CP損傷的嚴(yán)重程度確定:由病理醫(yī)師采用盲法在未知分組的情況下，隨機(jī)抽取每只小鼠胰腺的任意3個(gè)部位病理切片，每個(gè)組織切片讀取10個(gè)不同視野，對(duì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺泡萎縮及纖維化程度進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［6-7］。

1.5 胰腺膠原含量檢查及定量分析一部分組織切片采用苦味酸-天狼星紅染色，以評(píng)估胰腺組織膠原含量。每組10只動(dòng)物各需制作一張切片。切片進(jìn)行脫蠟處理后，用0.1%（W/V）天狼星紅-飽和苦味酸溶液在室溫下染色1 h，然后用蒸餾水沖洗、Mayer蘇木精復(fù)染和1%鹽酸分化，自來(lái)水堿化后脫水并封片?？辔端?天狼星紅染色后的切片在偏振光顯微鏡200倍率下觀察，通過(guò)偏光顏色的差異對(duì)胰腺組織膠原類(lèi)型及其表達(dá)程度進(jìn)行分析，用Image-Pro Plus 6圖像分析軟件（Media Cybernetics，MD，USA）在同一個(gè)圖像中，通過(guò)量化不同的顏色、分布分析Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的含量（以視野中黃紅色及綠色膠原面積表示）和膠原容積分?jǐn)?shù)（CVFS），CVFS=（綠色膠原面積+黃紅色膠原面積）/總面積（指照片視野面積）×100%。

1.6 胰腺組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）免疫組化染色各組取10只樣本，采用過(guò)氧化物酶ABC試劑盒（Vector aboratories）進(jìn)行α-SMA免疫組化染色，光鏡下觀察并使用Leica DM4000B顯微鏡采集記錄200倍率下的圖像。以高倍鏡視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)估胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic stellate cells，PSCs）的活化，觀察胰腺纖維化程度。

1.7 胰腺P2X7R、NLRP3和Caspase-1免疫組化（IHC）染色采用過(guò)氧化物酶ABC試劑盒（Vector aboratories）進(jìn)行免疫組化染色，以檢測(cè)胰腺組織中P2X7R、NLRP3和Caspase-1表達(dá)水平。使用Leica LAS Extended Annotation模塊的軟件進(jìn)行處理及定量分析。每組各10只動(dòng)物樣本，每只動(dòng)物各需3張切片，分別檢測(cè)3種蛋白。蛋白表達(dá)量以累積光密度（IOD）值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果及胰腺慢性炎癥損傷組織學(xué)評(píng)分與正常對(duì)照組相比，CP模型組小鼠胰腺可見(jiàn)明顯的慢性炎癥及纖維化，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)異常、腺泡萎縮、纖維化和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而OxATP和BBG兩組炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腺泡萎縮及纖維化程度評(píng)分較CP模型組均明顯降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。與正常對(duì)照組比較，CP模型小鼠胰腺出現(xiàn)了廣泛纖維化，且主要集中在胰腺的導(dǎo)管和血管的周?chē)^所示），而OxATP和BBG組小鼠胰腺纖維化則明顯減輕（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Tab.1Histopathological scores of pancreas in three groups表1 各組小鼠胰腺病理組織學(xué)評(píng)分（n=10，分）

Tab.1Histopathological scores of pancreas in three groups表1 各組小鼠胰腺病理組織學(xué)評(píng)分（n=10，分）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與CP模型組比較，P＜0.05

組別CP模型組OxATP組BBG組F炎細(xì)胞浸潤(rùn)3.49±0.31 2.34±0.28a 2.52±0.29a 341.731＊＊腺泡萎縮2.84±0.36 1.81±0.34a 1.90±0.33a 156.860＊纖維化3.27±0.42 2.19±0.36a 2.03±0.37a 168.770＊

2.2 胰腺纖維化改變

2.2.1 各組膠原含量變化比較在偏振光照射下，Ⅰ型膠原蛋白顯示為黃紅色，Ⅲ型膠原顯示為綠色。CP模型組、OxATP組和BBG組膠原含量和CVFS較正常對(duì)照組均明顯增加（均P＜0.05），并且3組均以Ⅰ型膠原蛋白為主，Ⅲ型膠原蛋白含量相對(duì)較少；OxATP組和BBG組膠原含量和CVFS均低于CP模型組（均P＜0.05），見(jiàn)圖2、表2。

Tab.2Changes of CVFS in the pancreas in four groups表2 各組小鼠胰腺組織纖維化CVFS及膠原含量的變化（n=10）

Tab.2Changes of CVFS in the pancreas in four groups表2 各組小鼠胰腺組織纖維化CVFS及膠原含量的變化（n=10）

＊＊P＜0.01；a與正常對(duì)照組比較，b與CP模型組比較，P＜0.05

組別CVFS（%）正常對(duì)照組CP模型組OxATP組BBG組FⅠ型膠原蛋白面積（像素點(diǎn)/ 200倍視野）74.23±3.22 968.62±56.70a 494.34±34.34ab 282.96±17.57ab 1 120.021＊＊Ⅲ型膠原蛋白面積（像素點(diǎn)/ 200倍視野）72.55±3.16 144.55±12.09a 96.54±8.38ab 88.63±6.68ab 127.452＊＊2.05±0.19 48.96±3.38a 23.65±1.41ab 18.48±0.86ab 957.290＊＊

2.2.2 各組α-SMA免疫組化檢測(cè)結(jié)果比較在CP誘導(dǎo)下，PSCs明顯增多。正常對(duì)照組、CP模型組、OxATP組和BBG組高倍鏡視野下PSCs陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（個(gè)）分別為3.00±1.00，28.30±4.93，9.70±1.53， 16.00±1.73，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.518，P＜0.05）。CP模型組α-SMA水平明顯高于正常對(duì)照組、OxATP組和BBG組，見(jiàn)圖3。

Fig.3The expressions of α-SMA in pancreatic tissues detected by IHC method（IHC，×200）圖3 各組胰腺組織中α-SMA的表達(dá)情況（IHC，×200）

2.3 各組P2X7R、NLRP3和Caspase-1檢測(cè)結(jié)果比較與正常對(duì)照組相比，CP模型組胰腺組織中P2X7R、NLRP3和Caspase-1的表達(dá)明顯升高；而OxATP和BBG組胰腺組織中P2X7R、NLRP3和Caspase-1表達(dá)較CP模型組降低（均P＜0.05），見(jiàn)表3、圖4。

Tab.3Quantitative analysis of cumulative light density（IOD）changes in P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 in four groups表3 各組P2X7R、NLRP3和Caspase-1的IOD值變化（n=10）

Tab.3Quantitative analysis of cumulative light density（IOD）changes in P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 in four groups表3 各組P2X7R、NLRP3和Caspase-1的IOD值變化（n=10）

＊＊P＜0.01；a與正常對(duì)照組比較，b與CP模型組比較，P＜0.05

組別正常對(duì)照組CP模型組OxATP組BBG組F P2X7R 0.51±0.07 28.03±2.71a 10.01±1.26ab 16.02±1.94ab 418.712＊＊NLRP3 2.04±0.33 23.01±2.52a 8.52±0.75ab 12.03±1.47ab 335.628＊＊Caspase-1 4.53±0.46 20.01±2.05a 6.02±0.54ab 14.01±1.74ab 270.089＊

3 討論

P2X7R作為一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控元件，參與了許多重要的生理和病理過(guò)程，包括胚胎發(fā)育［8］、免疫系統(tǒng)的成熟、神經(jīng)退行性疾?。?］、炎癥［10］和癌癥［11］等。作為一種危險(xiǎn)信號(hào)傳感器，P2X7R在炎癥部位充當(dāng)了監(jiān)測(cè)三磷酸腺苷（ATP）釋放的報(bào)警信號(hào)，廣泛參與了NLRP3炎性體的活化，在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［12-13］。

纖維化通常被定義為組織中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過(guò)量積累［14-15］。胰腺纖維化是CP的共同病理特點(diǎn)，現(xiàn)在多認(rèn)為其主要由PSCs激活引起［16-17］。α-SMA是PSCs活化的標(biāo)志物，其活化與多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。新近研究發(fā)現(xiàn)，P2X7R在器官纖維化疾病中具有重要作用，如肺纖維化［18-19］、腎間質(zhì)纖維化和肝纖維化［20-21］。CP是一種慢性非可控性炎癥過(guò)程，其發(fā)生多認(rèn)為起源于胰腺腺泡細(xì)胞。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，酶原顆粒通常是觸發(fā)這種慢性炎癥的關(guān)鍵［22-23］。然而，P2X7R在CP及其纖維化進(jìn)程中的作用研究尚少見(jiàn)。

Fig.4The expressions of P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 in pancreatic tissues（IHC，×200）圖4 各組胰腺組織中P2X7R、NLRP3和Caspase-1表達(dá)（IHC法，×200）

本研究顯示，雨蛙素反復(fù)刺激后，HE染色、天狼星紅染色及α-SMA免疫組化染色結(jié)果均顯示，除正常對(duì)照組外的小鼠胰腺均發(fā)生了明顯的慢性炎癥及纖維化，CP模型組膠原含量較正常對(duì)照組明顯增加，α-SMA水平、P2X7R、NLRP3和Caspase-1的表達(dá)明顯升高，表明小鼠纖維化變化與P2X7RNLRP3信號(hào)途徑中的P2X7R、NLRP3及Caspase-1蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)一致；而在使用P2X7R拮抗劑OxATP和BBG治療后，與CP模型組比較，HE染色病理及纖維化評(píng)分顯示OxATP和BBG組胰腺慢性炎癥和纖維化均明顯減輕；天狼星紅染色和α-SMA免疫組化染色也顯示OxATP和BBG組胰腺慢性炎癥和纖維化明顯改善，表明兩種拮抗劑對(duì)P2X7RNLRP3炎性體信號(hào)通路均有拮抗作用，提示P2X7R在CP及其纖維化進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。筆者推測(cè)其可能作用機(jī)制為CP慢性炎癥引起胰腺慢性損傷時(shí)，腺泡細(xì)胞釋放的細(xì)胞外ATP可通過(guò)結(jié)合P2X7R而發(fā)揮啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的作用:P2X7R的激活啟動(dòng)了NLRP3炎性體的裝配，一旦組裝成炎性體，NLRP3則可介導(dǎo)Caspase-1的激活，后者能夠切割白細(xì)胞介素-1β前體（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）和白細(xì)胞介素-18前體（pro-interleukin-18，pro-IL-18），使其成為具有活性的成熟形式；這些細(xì)胞因子能夠通過(guò)自分泌或旁分泌信號(hào)上調(diào)多種信號(hào)通路，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1這一纖維化反應(yīng)中重要介質(zhì)的增加，同時(shí)促進(jìn)了胰腺PSCs的活化，而PSCs是慢性胰腺炎關(guān)鍵的促纖維化細(xì)胞。

綜上所述，P2X7R-NLRP3炎性體信號(hào)通路活化在CP慢性炎癥及纖維化過(guò)程中有重要作用。P2X7R、NLRP3和Caspase-1等關(guān)鍵蛋白分子的級(jí)聯(lián)活化，伴隨著胰腺由慢性炎癥、腺泡細(xì)胞破壞、炎性滲出增加，以及腺泡萎縮、膠原物質(zhì)增加，從而逐步誘導(dǎo)PSCs活化，最終形成了胰腺纖維化的發(fā)展過(guò)程，而使用拮抗劑阻斷P2X7R-NLRP3炎性體信號(hào)通路，可顯著抑制胰腺的慢性炎癥及纖維化進(jìn)程，這可能成為治療CP及其纖維化的一種潛在方法。

（圖1、2見(jiàn)插頁(yè)）

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（2016-07-13收稿2016-08-30修回）

（本文編輯陸榮展）

Protective effects of P2X7R antagonist on chronic pancreatitis in mice

ZHANG Guixian1，LIU Dawei1，NIE Wei1，ZHANG Yi2，LIU Weiyun2，LIU Hongbin1△
1 Tianjin Institute of Medical and Pharmacological Sciences，Tianjin 300020，China；2 State Administration of Traditional Chinese Medicine，Chinese Medicine Scientific Research Three Level Laboratory，Tianjin Nankai Hospital△

ObjectiveTo investigate the role of purinergic 2X7 receptor（P2X7R）and its downstream target-NLRP3 inflammasome activation in the process of pancreatic fibrosis in a mouse model of chronic pancreatitis（CP）.MethodsForty C57BL/6 mice were randomly divided into normal control group，CP group，P2X7R antagonist oxidized ATP（OxATP）group and brilliant blue G（BBG）group.The chronic pancreatitis model was induced by repeated intraperitoneal injection of the cholecystokinin analogue caerulein with the dose of 50 μg/kg for six weeks.Normal saline，OxATP（20 μL，300 μmol/L）or BBG（20 μL，10 μmol/L）were administered for CP group，OxATP group and BBG group for two weeks after the last caerulein injection.Then all mice were sacrificed and the histopathological changes of the pancreas，especially the fibrotic degrees were evaluated by HE stain，fibrosis score，Sirius red staining and α-SMA immunohistochemical stain.The pancreatic P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 expressions were detected by immunohistochemistry respectively to compare the changes between the groups，and explore the role of P2X7R-NLRP3 signaling pathway in pancreatic fibrosis.ResultsCompared with the normal control group，the scores of pancreatic fibrosis and the expressions of P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 in pancreas were significantly increased in CP model group（P＜0.05）.Compare to CP group，the pancreatic chronic inflammation and the fibrosis indices such as HE fibrosis score，Sirius red staining and α-SMA immunohistochemical stain were ameliorated obviously in OxATP and BBG groups（P＜0.05）.And expressions of P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 in the pancreas were allreduced greatly in both OxATP and BBG groups（P＜0.05）.ConclusionP2X7R antagonist OxATP and BBG can significantly decrease pancreatic chronic inflammation and fibrosis in the mouse model of CP，which suggests that the blockade of P2X7RNLRP3 inflammasome signaling pathway may represent a novel therapeutic strategy for CP and its fibrotic process.

pancreatitis，chronic；fibrosis；purinergic P2X7 receptor；nucleotide-binding oligomerization domain like receptor 3；oxidized adenosine triphosphate；brilliant blue G；Caspase-1

R576.2

A

10.11958/20160679

天津市衛(wèi)生計(jì)生委科技基金項(xiàng)目（2014KY39）

1天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所（郵編300020）；2天津市南開(kāi)醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室

張桂賢（1981），女，助理研究員，主要從事藥理學(xué)研究

△通訊作者E-mail:jtss@sina.com