多元模塊工程在代謝工程中的應(yīng)用與研究進(jìn)展

劉丁玉，孟嬌，王智文，陳濤，趙學(xué)明

（1天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2教育部系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津 300072；3天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072）

多元模塊工程在代謝工程中的應(yīng)用與研究進(jìn)展

劉丁玉1，2，3，孟嬌1，2，3，王智文1，2，3，陳濤1，2，3，趙學(xué)明1，2，3

（1天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2教育部系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津 300072；3天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072）

隨著代謝工程理論體系的發(fā)展，代謝工程的研究方法目前已從對單一途徑的調(diào)控轉(zhuǎn)變?yōu)閷φ麄€代謝網(wǎng)絡(luò)的全局調(diào)控。同時，為了在工業(yè)微生物領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)與化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模相當(dāng)?shù)纳餆捴七^程，代謝工程需要一套通用的菌株優(yōu)化策略。其中關(guān)鍵問題之一，是解決代謝通量的不平衡。本文介紹了基于傳統(tǒng)的理性代謝工程與近年來興起的組合工程中存在的問題，研究者提出了一種模塊化的代謝網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化策略——多元模塊工程（multivariate modular metabolic engineering，MMME）。闡述了多元模塊工程的原理和方法，列舉了其常用的調(diào)控技術(shù)和手段，在此基礎(chǔ)上綜述了近年來模塊化策略在代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，提出了該策略面臨的主要問題并展望了其未來的發(fā)展方向。

多元模塊工程；代謝工程；組合工程；合成生物學(xué)

人們利用微生物進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)已經(jīng)有悠久的歷史，發(fā)酵產(chǎn)品遍布食品、藥品、能源、化工等多個領(lǐng)域。在此基礎(chǔ)上，BAILEY和STEPHANOPOULOS于1991年最先提出了代謝工程的概念。經(jīng)過二十多年的研究與發(fā)展，人們在利用微生物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)方面取得了顯著成效［1］。代謝工程最早致力于利用系統(tǒng)已知計量關(guān)系、動力學(xué)方程及相關(guān)知識對細(xì)胞表型進(jìn)行理性修飾［2］，目前在這方面取得了輝煌的成果并產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響［3］。這些理論和技術(shù)目前仍被人們不斷地深入發(fā)展和研究。代謝工程前期研究已經(jīng)取得了豐碩成果［4］，其一條重要原則是消除代謝途徑中的瓶頸，使代謝通量的分配達(dá)到平衡以獲得期望的目標(biāo)表型［5］。

在代謝工程理論體系發(fā)展的二十年間，隨著“后基因組時代”的到來，大量的基因組、蛋白質(zhì)組、代謝物組學(xué)數(shù)據(jù)已被獲得［6］，人工合成基因片段的成本顯著下降［7］，對胞內(nèi)代謝機制的研究更加精確［8］。因此，代謝工程的研究重點已經(jīng)逐漸從對單一基因或途徑的擾動發(fā)展到對整個細(xì)胞代謝通路的調(diào)控［9］。代謝工程的研究方法（toolbox）已經(jīng)從傳統(tǒng)對單個基因或單一途徑的調(diào)控［10］轉(zhuǎn)變?yōu)閷φ麄€細(xì)胞的基因表達(dá)和代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全局調(diào)控［11］。

為了在工業(yè)微生物領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)與化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模相當(dāng)?shù)纳餆捴七^程，代謝工程需要具備一套標(biāo)準(zhǔn)的通用的菌株優(yōu)化策略［12］。其關(guān)鍵點在于發(fā)現(xiàn)并有效地解決代謝通量的不平衡問題［13］。傳統(tǒng)理性代謝工程采用解調(diào)關(guān)鍵酶、基因敲除、過表達(dá)限速步驟基因等方法來解決代謝途徑中的瓶頸［14］。然而，由于生物系統(tǒng)的高度復(fù)雜性和生化反應(yīng)非線性的特點，完全理性預(yù)測和設(shè)計途徑平衡的最優(yōu)方案是很難實現(xiàn)的［4］。上述“極端”（過表達(dá)、基因敲除）的操作方法往往會給代謝途徑引入新的瓶頸。由于途徑中各基因的相關(guān)性，因此需要一種更加大尺度的調(diào)控多基因的方法來尋求代謝通量的最優(yōu)平衡。

近年來，隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大量基因編輯和調(diào)控工具的開發(fā)使一種“組合工程”策略被廣泛應(yīng)用。其與傳統(tǒng)理性代謝工程相比是一種隨機的、大尺度的優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)的方法。其中包括直接調(diào)控基因表達(dá)強度的方法，如構(gòu)建啟動子文庫和RBS文庫［15-16］。此外，還有利用轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的優(yōu)化方法gTME［17］，直接在基因組進(jìn)行多靶點操作的組合優(yōu)化方法，如MAGE［18］、CAGE［19］、TRMR［20］、CRMAGE［21］等。這些策略的共同點是先獲得大量不同突變組合的文庫，再利用高通量篩選技術(shù)從中獲得最優(yōu)表型［22］。雖然“組合工程”有很大的前景，但其廣泛的應(yīng)用受限于需要依靠表型（如顯色產(chǎn)物、產(chǎn)物耐受性等）的高通量篩選，許多目標(biāo)表型目前不具備高通量篩選的前提［23］。因此，基于以上兩種方法存在的問題，代謝工程研究者開發(fā)了一種模塊化的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控策略——多元模塊工程（multivariate modular metabolic engineering，MMME）［24］。這種模塊化思想與理性代謝工程相比更加簡單通用，不需要對某個基因或某條途徑的機理詳細(xì)認(rèn)知，與“組合工程”相比卻更加系統(tǒng)和理性，而且避免了高通量的篩選過程，因此近年來被廣泛應(yīng)用于代謝網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化。本文闡述了多元模塊工程的原理和方法，列舉了其常用的調(diào)控技術(shù)和手段，在此基礎(chǔ)上綜述了近年來模塊化策略在代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，提出了該策略面臨的主要問題并展望了其未來的發(fā)展方向。

1　多元模塊工程的原理

多元模塊工程與傳統(tǒng)理性代謝工程和組合工程有所不同，如表1所示，是一種介于這兩者之間的代謝工程策略。其工程思路是將整個代謝通路分成不同的模塊，再利用代謝工程技術(shù)與合成生物學(xué)調(diào)控元件對各個模塊的強度進(jìn)行調(diào)節(jié)以及協(xié)調(diào)不同模塊的表達(dá)，最終達(dá)到對整個代謝通路的優(yōu)化。多元模塊工程思想來源于對細(xì)胞信號通路的模塊化行為的理解和啟發(fā)［25］，代謝網(wǎng)絡(luò)中的各種酶可以按照途徑分支、化學(xué)組成或酶學(xué)特性分成一系列模塊。只需構(gòu)建少數(shù)的模塊組合，就可以在大范圍內(nèi)優(yōu)化代謝通路。

表1　不同代謝工程策略的對比

多元模塊工程的原理如圖1所示，對非線性的代謝網(wǎng)絡(luò)機制，用一系列模塊重新劃分代謝網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控不同模塊強度的平衡表達(dá)，以解調(diào)或消除途徑瓶頸。將復(fù)雜的代謝系統(tǒng)簡單化，通過轉(zhuǎn)錄、后轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的機制調(diào)控模塊表達(dá)，模塊間強度配置可用多元統(tǒng)計方法進(jìn)行篩選，巧妙地通過一系列的模塊重新劃分傳統(tǒng)代謝網(wǎng)絡(luò)，更利于調(diào)整通量平衡和消除途徑中的瓶頸。一般來講，當(dāng)以一個操縱子形式表達(dá)一個代謝途徑時，這條途徑的反應(yīng)速率由這一途徑中反應(yīng)速率最慢的酶所決定。這意味著，途徑中有些酶的反應(yīng)速率難以達(dá)到其本身的最優(yōu)值。將整個途徑中相似反應(yīng)速率的酶歸為一個模塊，通過調(diào)整模塊表達(dá)量來平衡不同模塊的通量，從而使整體代謝網(wǎng)絡(luò)的效率最優(yōu)化。同時將代謝網(wǎng)絡(luò)重新劃分為幾個相互影響的模塊不僅能夠使復(fù)雜的代謝系統(tǒng)更加易于分析，而且每個獨立模塊內(nèi)部的基因表達(dá)可通過一系列的轉(zhuǎn)錄、后轉(zhuǎn)錄和翻譯機制進(jìn)行模塊內(nèi)部調(diào)節(jié)，模塊的強度可以用簡單的多元統(tǒng)計方法進(jìn)行評價。隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大量標(biāo)準(zhǔn)化調(diào)控原件的構(gòu)建以及基因序列合成成本的逐漸降低，意味著可以更加高效的構(gòu)建不同強度的模塊并迅速進(jìn)行檢測和分析。

圖1　多元模塊工程原理［12］

2　模塊強度的調(diào)控方法

目前模塊強度的調(diào)控主要依賴于質(zhì)粒拷貝數(shù)、啟動子、RBS序列，如圖2所示。模塊強度調(diào)控方法主要有質(zhì)?？截悢?shù)（高、中、低）、啟動子強度、RBS強度，3種方法通常結(jié)合使用，可以在大尺度強度范圍內(nèi)精確調(diào)控多個模塊的平衡表達(dá)。這3種調(diào)控方法簡單、經(jīng)濟(jì)，并且在同一宿主菌株中具有通用性，因此是多元模塊工程調(diào)控的首選。

圖2　模塊強度的調(diào)控方法

2.1質(zhì)?？截悢?shù)

作為一種簡單、便捷且效果顯著的方法，質(zhì)?？截悢?shù)的調(diào)節(jié)被頻繁地應(yīng)用于途徑平衡優(yōu)化。目前許多基因功能線路和代謝通路都是在質(zhì)粒上構(gòu)建，質(zhì)粒的拷貝數(shù)對基因線路的表達(dá)強度會產(chǎn)生一定影響。多種不同拷貝數(shù)質(zhì)?？梢栽诠I(yè)化菌株中實現(xiàn)各模塊不同水平的表達(dá)。目前利用質(zhì)粒拷貝數(shù)優(yōu)化模塊組合的最突出成果是XU等［26］利用其課題組自主開發(fā)的ePathBrick元件［27］，在大腸桿菌中協(xié)調(diào)表達(dá)與脂肪酸生產(chǎn)途徑相關(guān)的3個模塊，達(dá)到了該菌株中目前游離脂肪酸的最高產(chǎn)量。這個例子是多元模塊工程應(yīng)用的經(jīng)典案例，利用不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒簡單高效的調(diào)節(jié)3個模塊的強度，對8種模塊強度組合進(jìn)行評價，最終篩選到最優(yōu)組合。質(zhì)粒作為一種最通用、經(jīng)濟(jì)、方便的調(diào)控工具其優(yōu)勢在這個例子中被充分發(fā)揮。除此之外，在類黃酮［28-29］、烯萜類［30］等代謝途徑中均有以質(zhì)粒作為模塊優(yōu)化工具的成功案例。但質(zhì)粒表達(dá)基因的同時會給細(xì)胞帶來一定生理負(fù)擔(dān)，同時發(fā)酵后期可能出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。因此，隨著基因組編輯技術(shù)和生物標(biāo)準(zhǔn)化元件的發(fā)展，在基因組上通過基因表達(dá)元件的調(diào)控來擾動基因的表達(dá)成為了更好的選擇。

2.2啟動子調(diào)控

在細(xì)胞代謝通量各個水平的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控起著關(guān)鍵作用，啟動子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控中居于關(guān)鍵的地位［31］。轉(zhuǎn)錄水平的模塊調(diào)節(jié)優(yōu)化可通過不同啟動子來實現(xiàn)，啟動子的獲得途徑一般是，利用菌株已報道的不同強度啟動子，理性或半理性設(shè)計啟動子［32］，隨機篩選構(gòu)建啟動子文庫［33］。目前，大部分研究中會將質(zhì)?？截悢?shù)和啟動子調(diào)控聯(lián)合使用。WU等［29］以E.coli為宿主菌生產(chǎn)白藜蘆醇的研究中，將5個外源酶劃分為3個模塊，重新構(gòu)建了生產(chǎn)白藜蘆醇的代謝途徑。最初將3個模塊表達(dá)在3個質(zhì)粒上，白藜蘆醇產(chǎn)量只有3.03mg/L，進(jìn)一步利用E.coli中常用的強啟動子Trc、T7，結(jié)合不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒協(xié)調(diào)平衡3個模塊的強度，最終最優(yōu)菌株的產(chǎn)量達(dá)到35.02mg/L。從這個例子看出，將啟動子與質(zhì)?？截悢?shù)兩種調(diào)控方法結(jié)合使用，可以增大調(diào)控幅度，優(yōu)化設(shè)計方案，更加容易獲得最優(yōu)型菌株。除E.coli外，利用啟動子進(jìn)行模塊調(diào)控的方法在Bacillus subtilis［34］、Yeast［35］等其他模式菌株中也均有成功運用的案例。隨著目前啟動子工程技術(shù)的發(fā)展，利用啟動子調(diào)控相對于質(zhì)?？截悢?shù)具有更寬的調(diào)控范圍，同時啟動子調(diào)控除了可以在質(zhì)粒上實現(xiàn)外，還可通過基因編輯技術(shù)在基因組上實現(xiàn)，避免了過多的代謝負(fù)擔(dān)。

2.3RBS序列強度

RBS序列和蛋白翻譯的速率密切相關(guān)，能顯著影響目的蛋白表達(dá)量，因此是調(diào)控翻譯強度的重要元件。RBS序列一般用來調(diào)控單個基因的表達(dá)強度，不足以進(jìn)行整個模塊強度的調(diào)控，但同樣可以將其運用到模塊化策略中，RBS序列由于其方便操作和便于理性設(shè)計的因素，可以在單一途徑中運用模塊化思想調(diào)控多個基因的表達(dá)強度。作者課題組利用自主開發(fā)的MIPE系統(tǒng)［36］和RBS計算器［16］，調(diào)控核黃素操縱子上5個基因的RBS強度，通過不同組合的篩選，使最終菌株核黃素產(chǎn)量提高了2.6倍。

目前對模塊強度的調(diào)控方法主要以上述3種方法為主，自多元模塊工程策略誕生以來，短短幾年內(nèi)代謝工程研究者已經(jīng)將其應(yīng)用于多種途徑產(chǎn)品的生產(chǎn)，取得了顯著成果。如表2所示。

表2　近年來多元模塊工程在代謝工程中的應(yīng)用

3　多元模塊工程在代謝工程中的應(yīng)用

多元模塊工程作為代謝工程的一種重要菌株優(yōu)化策略，已分別在原核和真核的不同模式菌株中有成功的應(yīng)用案例。依據(jù)模塊劃分的方法，可將其在代謝工程中的應(yīng)用分為兩部分。

3.1依據(jù)代謝支路節(jié)點劃分模塊的應(yīng)用

以代謝支路為依據(jù)劃分模塊是最簡單有效的策略，將復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)按途徑節(jié)點分割，每條途徑作為一個模塊。一般這種方法不僅可以劃分菌株自身的代謝途徑，同時可以將引入的外源途徑與本身的內(nèi)源途徑結(jié)合起來重新劃分代謝網(wǎng)絡(luò)，這對有外源途徑引入的菌株是一種非常有效的平衡代謝通量的策略。

以代謝支路劃分模塊最經(jīng)典的例子是AJIKUMAR等［30］在大腸桿菌中生產(chǎn)紫杉醇類化合物的研究，這也是第一次明確提出模塊化的概念，也開啟了該思想在代謝工程領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

該研究以IPP為節(jié)點將整個途徑分為兩個模塊：一是上游的內(nèi)源MEP途徑模塊（dxs，idi，ispD，ispF）；二是兩個外源萜類化合物合成酶構(gòu)成的下游模塊。使用不同強度的啟動子和不同拷貝數(shù)質(zhì)粒組合調(diào)控上游和下游模塊的強度，協(xié)調(diào)兩個模塊通量平衡的同時也限制了副產(chǎn)物吲哚的積累。在作者構(gòu)建的不同模塊組合的菌株中，成功篩選了高產(chǎn)紫杉二烯的菌株，其最高產(chǎn)量能達(dá)到1g/L，是對照菌株的15000倍。這個例子中，上游MEP途徑由8個基因組成，用傳統(tǒng)策略調(diào)控需要對該途徑代謝機理有詳細(xì)的認(rèn)知，并且在默認(rèn)其屬于線性系統(tǒng)的條件下進(jìn)行，這會造成忽視很多非特異性效果（中間代謝物毒性、質(zhì)粒造成的負(fù)擔(dān)等）。但研究者將其簡化為由4個限速步驟基因組成的模塊，通過整體的調(diào)控模塊強度回避了復(fù)雜的非線性作用，從而以“小尺度”的設(shè)計優(yōu)化了大尺度的整體。將多元模塊工程的優(yōu)勢充分發(fā)揮出來，對后來研究者采用模塊化策略是一個很好的引導(dǎo)。

AJIKUMAR等成功運用多元模塊工程后，國內(nèi)外許多研究者追蹤了這項研究，成功的將該策略應(yīng)用到各自的研究中，目前在不同菌株，不同途徑中均有成功應(yīng)用多元模塊工程的范例。XU等［26］的研究也是根據(jù)途徑節(jié)點劃分模塊的典型例子，整個代謝網(wǎng)絡(luò)的15個基因依據(jù)中間代謝物節(jié)點被劃分為3個模塊，協(xié)調(diào)平衡模塊表達(dá)后使乙酰輔酶A的合成與丙?；o酶A的消耗之間達(dá)到平衡，最終菌株脂肪酸產(chǎn)量達(dá)到8.6g/L。DARMAWI等［37］將多元模塊工程運用于E.coli生產(chǎn)L-酪氨酸的研究中，以中間產(chǎn)物莽草酸為節(jié)點，將整個途徑分為上下游兩個模塊，逐步平衡兩個模塊的通量水平，結(jié)合組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步確定靶點，對基因做更加精細(xì)的調(diào)控?？朔酥拔墨I(xiàn)中對該產(chǎn)物途徑的研究僅局限于局部靶點而無法涉獵全局的缺點，是多元模塊工程與組學(xué)技術(shù)結(jié)合的范例。

ZHAO等［38］將多元模塊工程應(yīng)用于大腸桿菌中β胡蘿卜素的生產(chǎn)，將整個代謝系統(tǒng)劃分為5個模塊，其中2個直接參與β胡蘿卜素合成的模塊：上游是E.coli的自身的MEP途徑模塊，下游是整合到基因組的外源途徑模塊（crtE、crtB、crtl、crtY）。除此之外還設(shè)計了3個中心代謝模塊：ATP合成模塊，TCA循環(huán)模塊和PP途徑模塊。利用其課題組自主構(gòu)建的mRs文庫［39］對各個模塊的強度進(jìn)行理性優(yōu)化，根據(jù)不同優(yōu)化組合下菌體生長狀況和β胡蘿卜等產(chǎn)量協(xié)調(diào)各模塊間的表達(dá)強度，從而優(yōu)化整個系統(tǒng)的代謝平衡。通過多元模塊方法的調(diào)控，提高了生產(chǎn)β胡蘿卜素的前體物IPP和DMAPP以及輔因子ATP和NADPH的供給，成功獲得了穩(wěn)定的重組菌株，其產(chǎn)量可達(dá)2.1g/L，比對照菌株提高了74倍。該例子中的模塊劃分不僅涉及產(chǎn)物合成途徑，中心碳代謝相關(guān)模塊也被統(tǒng)籌考慮，這樣不但可以更加全面地優(yōu)化產(chǎn)物生成途徑的通量，同時將菌體生長情況也作為重要的參考指標(biāo)，最終可獲得既穩(wěn)定又高產(chǎn)的菌株。證明了用多元模塊工程的思路優(yōu)化代謝途徑，可以更加全面的考慮各種相關(guān)因素，從而獲得遺傳背景更加符合工業(yè)化生產(chǎn)的菌株。

LIU等［34］首次在Bacillus subtilis中成功的運用了模塊化策略，將N-乙酰葡糖胺的相關(guān)代謝途徑分為3個模塊：①N-乙酰葡糖胺合成模塊；②糖酵解模塊；③肽聚糖生成模塊。其中模塊1與產(chǎn)物生成直接相關(guān)，首先用不同強度啟動子調(diào)控模塊1內(nèi)部的通量平衡，使最終產(chǎn)量提高32%。模塊2、3均是競爭途徑模塊，用不同強度的弱化元件sRNA進(jìn)行調(diào)控，最終綜合優(yōu)化3個模塊的組合，使N-乙酰葡糖胺的最終產(chǎn)量達(dá)到31.65g/L。該研究對多元模塊工程的應(yīng)用更加精細(xì)，運用模塊化思路從單一模塊到多個模塊逐級調(diào)控，主次分明，效果顯著，為這一方法的應(yīng)用提供了重要參考。

同時ZHAO和LIU等的研究還有一個重要的共同點，即都基于優(yōu)良的合成生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化元件的運用（mRs文庫、sRNA），通過這些調(diào)控元件的運用使模塊調(diào)控更加理性且有針對性，可見多元模塊工程與高質(zhì)量的生物學(xué)元件相結(jié)合，可以達(dá)到事半功倍的效果，也是這一策略未來的重要發(fā)展方向。

近期多元模塊工程的又一顯著成果是CHEN等［35］在酵母中進(jìn)行高產(chǎn)富馬酸的途徑優(yōu)化。模塊化思想在該研究中得到更加深刻的充分發(fā)揮，研究者以丙酮酸為節(jié)點將中心碳代謝途徑分為3個模塊，分別是還原（支路）模塊、氧化（產(chǎn)物生成）模塊、副產(chǎn)物模塊，每個模塊由相應(yīng)支路中的關(guān)鍵酶構(gòu)成。該研究并不是像以往的多元模塊工程研究那樣調(diào)控3個模塊的平衡表達(dá)，而是運用轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的多種調(diào)控手段逐個對單一模塊進(jìn)行優(yōu)化，再將優(yōu)化后的3個模塊結(jié)合表達(dá)，最終使富馬酸產(chǎn)量達(dá)到33.13g/L。該成果也是模塊化策略在途徑工程中的一種體現(xiàn)，說明多元模塊工程未必是劃分模塊后硬性的平衡模塊間的表達(dá)，也代表了一種先分而治之再相互結(jié)合的途徑工程思維方式。

3.2依據(jù)代謝途徑中的關(guān)鍵酶劃分模塊的應(yīng)用

這種模塊劃分方法適用于更加復(fù)雜，多步驟以及代謝瓶頸突出的代謝網(wǎng)絡(luò)，把每個分支途徑中的限速酶作為一個模塊，以一個操縱子的形式在質(zhì)?；蛘系交蚪M上進(jìn)行表達(dá)，通過調(diào)控少數(shù)基因的表達(dá)達(dá)到調(diào)控不同代謝支路通量平衡的目的，是模塊化策略“化繁為簡”的充分體現(xiàn)。

WU等［28］在以E.coli生產(chǎn)松屬素的研究中，將整個網(wǎng)絡(luò)簡化為一個4模塊的系統(tǒng)。首先將底物到終產(chǎn)物的反應(yīng)以L-苯丙氨酸為節(jié)點分為上下游兩部分，上游部分是由葡萄糖生成L-苯丙氨酸的一系列反應(yīng)，將這部分簡化為由兩個關(guān)鍵步驟酶aroF、pheA組成的模塊1。同時，下游部分以酶的催化效率和消除代謝瓶頸為原則分別劃分為模塊2（PAL、4CL）、模塊3（CHS、CHI）。此外，為了增加另一重要前體物丙酰輔酶A的供應(yīng)，將其生成途徑的兩個關(guān)鍵酶matB、matC作為模塊4。由以上8個關(guān)鍵基因重新組成新的模塊途徑，既解決了重要前體物的供給又消除了原來途徑中的通量瓶頸，使松屬素的最終產(chǎn)量達(dá)到40.02mg/L。WU等的研究雖然是以代謝途徑中的關(guān)鍵酶來劃分模塊，但其每個模塊中的酶仍然是來源于同一條代謝支路，其模塊劃分思路仍然沿襲第一種方法，可以看作是第一種劃分方法的簡化。

YAO等［40］在E.coli中構(gòu)建丹參素合成途徑的研究則完全擺脫了代謝支路的局限，將整個途徑網(wǎng)絡(luò)中不同支路的基因按照酶的不同作用目的整合成4個模塊。模塊1為酪氨酸合成模塊（aroG，tryA，aroE），模塊2為葡萄糖利用模塊（ppsA，tktA，glk），模塊3為PEP-酪氨酸通路模塊（pckA，aroB，tyrB），模塊4為SHK-CHA通路模塊（aroL，aroA，evgA），其中每個模塊的基因并不處于同一條支路，以質(zhì)?？截悢?shù)和啟動子調(diào)控4個模塊的不同組合，最終菌株中，丹參素產(chǎn)量可達(dá)7.1g/L。由于不同代謝支路具有一定的相關(guān)性且單一反應(yīng)的通量與多種因素有關(guān)，因此該研究的模塊劃分策略與之前的研究相比更加理性，考慮的因素也更加全面。但這種模塊劃分方法目前依賴了于需要大量的研究基礎(chǔ)和理論積累，因此目前還無法在不同代謝網(wǎng)絡(luò)中大量使用，隨著系統(tǒng)生物學(xué)多種研究手段的發(fā)展以及研究者理論知識的積累，類似的研究方法會越來越廣泛的應(yīng)用。

4　展 望

多元模塊工程已經(jīng)成為代謝工程的一種重要研究方法，與其他代謝工程策略相比可以更加高效、系統(tǒng)、簡約地調(diào)控代謝通路中的通量平衡，其在短短幾年內(nèi)被應(yīng)用于多種代謝途徑的產(chǎn)品生產(chǎn)。它也為研究者們提出了一種研究代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制的策略，開發(fā)了一個應(yīng)對目前調(diào)控手段瓶頸的辦法。而且它的設(shè)計理論在多種宿主菌株以及不同代謝途徑中具有通用性，模塊化思想更有利于把代謝工程發(fā)展為更加系統(tǒng)和規(guī)范化的學(xué)科。多元模塊工程的未來發(fā)展趨勢主要為以下幾點。

（1）更加精確、理性地劃分模塊。模塊節(jié)點的選擇無疑是多元模塊工程最重要的環(huán)節(jié)，準(zhǔn)確、高效地劃分模塊是實現(xiàn)代謝通量平衡和優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)。目前的模塊劃分主要是從已知的代謝支路和途徑中的關(guān)鍵酶出發(fā)，隨著代謝通量分析技術(shù)和多種“組學(xué)”技術(shù)的發(fā)展，未來的研究者們對模塊的劃分將更加精確，模塊調(diào)控效果更佳突出。

（2）應(yīng)用更加多樣、系統(tǒng)化的模塊調(diào)控方法。目前模塊表達(dá)水平的調(diào)控主要依賴于質(zhì)粒拷貝數(shù)、啟動子等“粗糙”的調(diào)控手段，隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的多種新的調(diào)控工具和元件將被運用（TIGRs［41］、SSR［42］等）。

（3）實現(xiàn)多模塊、大尺度的模塊組裝和調(diào)控。為了擴(kuò)大調(diào)控范圍和引入更加復(fù)雜的外源途徑，除了運用更多轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的調(diào)控元件外，多模塊的組裝和整合也是未來的重要發(fā)展方向。近年來開發(fā)的大量DNA組裝技術(shù)（Gbison［43］、CLIVA［44］、GoldenGate［45］）和基因組編輯技術(shù)（CIChE［46］）都有應(yīng)用于多元模塊工程的潛力。此外，近期在細(xì)胞與分子克隆領(lǐng)域倍受關(guān)注的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，可以更加高效、多位點地修飾基因組和進(jìn)行DNA片段的編輯。本文作者課題組LI等［47］利用此技術(shù)對E.coli生產(chǎn)β胡蘿卜素的代謝途徑進(jìn)行修飾，在短時間內(nèi)測試了33個基因組位點操作，構(gòu)建了超過100株不同基因型的菌株，可見該技術(shù)的應(yīng)用潛力。以上這些技術(shù)都為未來構(gòu)建更加復(fù)雜、龐大的模塊代謝網(wǎng)絡(luò)提供了可能。

未來的代謝工程研究中，隨著各種“生物工具”的運用和分析技術(shù)的提高，多元模塊工程與理性代謝工程和組合工程之間將會有更多的交叉，三者的界限也會越來越“模糊”。這3種策略相互彌補，結(jié)合使用，會更加高效地構(gòu)建出期望的生物表型。

［1］ PERALTA-YAHYA P P，ZHANG F Z，DEL CARDAYRE S B，et al. Microbial engineering for the production of advanced biofuels［J］. Nature，2012，488：320-328.

［2］ LO T M，TEO W S，LING H，et al. Microbial engineering strategies to improve cell viability for biochemical production［J］. Biotechnology Advances，2013，31：903-914.

［3］ KEASLING J D. Manufacturing molecules through metabolic engineering［J］. Science，2010，330：1355-1358.

［4］ BAILEY J E，SBURLATI A，HATZIMANIKATIS V，et al. Inverse metabolic engineering：a strategy for directed genetic engineering of useful phenotypes［J］. Biotechnol. Bioeng.，2002，79：568-579.

［5］ STEPHANOPOULOS G，SINSKEY A J. Metabolic engineering—methodologies and future prospects［J］. Trends in Biotechnology，1993，11：392-396.

［6］ ALPER H，STEPHANOPOULOS G. Metabolic engineering challenges in the post-genomic era［J］. Chemical Engineering Science，2004，59：5009-5017.

［7］ PARK J H，LEE S Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production［J］. Curr. Opin. Biotechnol.，2008，19：454-460.

［8］ STAFFORD D E，STEPHANOPOULOS G. Metabolic engineering as an integrating platform for strain development［J］. Current Opinion in Microbiology，2001，4：336-340.

［9］ WOOLSTON B M，EDGAR S，STEPHANOPOULOS G. Metabolic engineering：past and future［J］. Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng.，2013，4：259-288.

［10］ KLEIN-MARCUSCHAMER D，AJIKUMAR P K，STEPHANOPOULOS G. Engineering microbial cell factories for biosynthesis of isoprenoid molecules：beyond lycopene［J］. Trends Biotechnol.，2007，25：417-424.

［11］ TYO K E，KOCHARIN K，NIELSEN J. Toward design-based engineering of industrial microbes［J］. Curr. Opin. Microbiol.，2010，13：255-262.

［12］ KAMM B，KAMM M. Principles of biorefineries［J］. Appl. Microbiol. Biotechnol.，2004，64：137-145.

［13］ PITERA D J，PADDON C J，NEWMAN J D，et al. Balancing a heterologous mevalonate pathway for improved isoprenoid production in Escherichia coli［J］. Metab. Eng.，2007，9：193-207.

［14］ XU P，BHAN N，KOFFAS M A. Engineering plant metabolism into microbes：from systems biology to synthetic biology［J］. Curr. Opin. Biotechnol.，2013，24：291-299.

［15］ ALPER H，F(xiàn)ISCHER C，NEVOIGT E，et al. Tuning genetic control through promoter engineering［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102：12678-12683.

［16］ SALIS H M，MIRSKY E A，VOIGT C A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression［J］. Nat. Biotechnol.，2009，27：946-950.

［17］ SANTOS C N S，XIAO W，STEPHANOPOULOS G. Rational，combinatorial，and genomic approaches for engineering L-tyrosine production in Escherichia coli［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109：13538-13543.

［18］ WANG H H，ISAACS F J，CARR P A，et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution［J］. Nature，2009，460：894-898.

［19］ ISAACS F J，CARR P A，WANG H H，et al. Precise manipulation of chromosomes in vivo enables genome-wide codon replacement［J］. Science，2011，333：348-353.

［20］ WARNER J R，REEDER P J，KARIMPOUR-FARD A，et al. Rapid profiling of a microbial genome using mixtures of barcoded oligonucleotides［J］. Nat Biotechnol，2010，28：856-862.

［21］ RONDA C，PEDERSEN L E，SOMMER M O，et al. CRMAGE：CRISPR Optimized MAGE recombineering［J］. Sci. Rep.，2016，6：19452.

［22］ COBB R E，SI T，ZHAO H. Directed evolution：an evolving and enabling synthetic biology tool［J］. Curr. Opin. Chem. Biol.，2012，16：285-291.

［23］ CHOU H H，KEASLING J D. Programming adaptive control to evolve increased metabolite production［J］. Nat. Commun.，2013，4：2595.

［24］ BIGGS B W，DE PAEPE B，SANTOS C N，et al. Multivariate modular metabolic engineering for pathway and strain optimization［J］. Current Opinion in Biotechnology，2014，29：156-162.

［25］ HARTWELL L H，HOPFIELD J J，LEIBLER S，et al. From molecular to modular cell biology［J］. Nature，1999，402：C47-C52.［26］ XU P，GU Q，WANG W，et al. Modular optimization of multi-gene pathways for fatty acids production in E.coli［J］. Nat. Commun.，2013，4：1409.

［27］ XU P，VANSIRI A，BHAN N，et al. ePathBrick：a synthetic biology platform for engineering metabolic pathways in E.coli［J］. ACS Synth. Biol.，2012，1：256-266.

［28］ WU J，DU G，ZHOU J，et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for （2S）-pinocembrin production from glucose by a modular metabolic strategy［J］. Metab. Eng.，2013，16：48-55.

［29］ WU J，LIU P，F(xiàn)AN Y，et al. Multivariate modular metabolic engineering of Escherichia coli to produce resveratrol from L-tyrosine［J］. J. Biotechnol.，2013，167：404-411.

［30］ AJIKUMAR P K，XIAO W H，TYO K E，et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli［J］. Science，2010，330：70-74.

［31］ KEASLING J D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering［J］. Metab. Eng.，2012，14：189-195.

［32］ BLAZECK J，GARG R，REED B，et al. Controlling promoter strength and regulation in Saccharomyces cerevisiae using synthetic hybrid promoters［J］. Biotechnology and Bioengineering，2012，109：2884-2895.

［33］ SIEGL T，TOKOVENKO B，MYRONOVSKYI M，et al. Design，construction and characterisation of a synthetic promoter library for fine-tuned gene expression in actinomycetes［J］. Metab. Eng.，2013，19：98-106.

［34］ LIU Y，ZHU Y，LI J，et al. Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production［J］. Metab. Eng.，2014，23：42-52.

［35］ CHEN X，ZHU P，LIU L. Modular optimization of multi-gene pathways for fumarate production［J］. Metab. Eng.，2016，33：76-85.

［36］ LI Y，GU Q，LIN Z，et al. Multiplex iterative plasmid engineering for combinatorial optimization of metabolic pathways and diversification of protein coding sequences［J］. ACS Synth. Biol.，2013，2：651-661.

［37］ JUMINAGA D，BAIDOO E E，REDDING-JOHANSON A M，et al. Modular engineering of L-tyrosine production in Escherichia coli［J］. Appl. Environ. Microbiol.，2012，78：89-98.

［38］ ZHAO J，LI Q，SUN T，et al. Engineering central metabolic modules of Escherichia coli for improving beta-carotene production［J］. Metab. Eng.，2013，17：42-50.

［39］ LU J，TANG J，LIU Y，et al. Combinatorial modulation of galP and glk gene expression for improved alternative glucose utilization［J］. Appl. Microbiol .Biotechnol.，2012，93：2455-2462.

［40］ YAO Y F，WANG C S，QIAO J，et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for production of salvianic acid A via an artificial biosynthetic pathway［J］. Metab. Eng.，2013，19：79-87.

［41］ PFLEGER B F，PITERA D J，SMOLKE C D，et al. Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes［J］. Nat Biotechnol.，2006，24：1027-1032.

［42］ EGBERT R G，KLAVINS E. Fine-tuning gene networks using simple sequence repeats［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109：16817-16822.

［43］ GIBSON D G，YOUNG L，CHUANG R Y，et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases［J］. Nat Methods，2009，6：343-345.

［44］ ZOU R，ZHOU K，STEPHANOPOULOS G，et al. Combinatorial engineering of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate pathway using cross-lapping in vitro assembly（CLIVA）method［J］. PLoS One，2013，8（11）：e79557.

［45］ ENGLER C，KANDZIA R，MARILLONNET S. A one pot，one step，precision cloning method with high throughput capability［J］. PloS One，2008，3（11）：e3647.

［46］ TYO K E，AJIKUMAR P K，STEPHANOPOULOS G. Stabilized gene duplication enables long-term selection-free heterologous pathway expression［J］. Nat. Biotechnol.，2009，27：760-765.

［47］ LI Y，LIN Z，HUANG C，et al. Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genome editing［J］. Metab. Eng.，2015，31：13-21.

Progress and application on multivariate modular metabolic engineering in metabolic engineering

LIU Dingyu1，2，3，MENG Jiao1，2，3，WANG Zhiwen1，2，3，CHEN Tao1，2，3，ZHAO Xueming1，2，3
（1School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2Key Laboratory of Systems Bioengineering，Ministry of Education，Tianjin 300072，China；3Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering，Tianjin 300072，China）

With the development of metabolic engineering，the metabolic engineering research method of single pathway regulation has evolved into global metabolic network regulation. In order to realize the chemical industrial vision of ‘biorefineries' in the field of industrial biotechnology，metabolic engineering requires a systematic study with well-defined principles and tools. One of the key problems is balancing metabolic flux. Based on the traditional，rational metabolic engineering and the rise of the problems existing in the combinatorial engineering in recent years，the researchers proposed a modular metabolic network optimization strategy using multiple module projects. The modular strategies in progress of application in metabolic engineering during recent years are summarized. In addition，the main problem and future direction of this strategy to optimize metabolic pathways are presented in light of the current knowledge of multiple module application.

multivariate modular metabolic engineering；metabolic engineering；combinatorial engineering；synthetic biology

Q819

A

1000-6613（2016）11-3619-08

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.11.035

2016-04-19；修改稿日期：2016-05-27。

國家自然科學(xué)基金（NSFC-21576200，NSFC-21576191）、國家973計劃（2012CB725203）及天津市自然科學(xué)基金（15JCQNJC06000）項目。

劉丁玉（1987—），男，博士研究生，E-mail dingyuliu@tju.edu.cn；孟嬌（1990—），女，碩士研究生，E-mail jiaomeng@tju.edu.cn。聯(lián)系人：王智文，博士，講師。E-mail zww@tju.edu.cn。