楊朋欣 丁國杰 劉可姝 張春媛 王彬/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司

水貂出血性肺炎滅活疫苗（B型）生產(chǎn)工藝的建立

楊朋欣 丁國杰 劉可姝 張春媛 王彬/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司

水貂出血性肺炎是由綠膿桿菌（又稱銅綠假單胞菌，Pseudomonas aeruginosa）感染引起的一種高度致死性傳染病，多發(fā)于每年9至11月份，該菌可通過患病水貂形成的飛沫及氣溶膠傳播。發(fā)病急、死亡快，所以又稱銅綠假單胞菌肺炎，以呼吸困難、口鼻出血、突發(fā)性死亡為主要特征，死后典型癥狀為口鼻流出血樣泡沫，剖檢肺臟呈彌漫性出血。

一般對(duì)該病的控制采取抗生素治療，但該方法易產(chǎn)生耐藥性，因此疫苗的制備是控制該病較好的手段，本研究對(duì)B型綠膿桿菌疫苗制備生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得安全、免疫效力良好的滅活產(chǎn)品，為水貂多價(jià)疫苗和聯(lián)苗產(chǎn)品的制備提供理論依據(jù)。

一、材料

1.菌株。水貂綠膿桿菌血清B型SD004株由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心保存。

2.主要試劑及儀器。甲醛溶液和NaCl均購自國藥集團(tuán)；LB和TSB均購自O(shè)XOID；發(fā)酵罐購自福州福爾流體設(shè)備有限公司。

二、方法

（一）一級(jí)種子的繁殖

還原綠膿桿菌B型SD004株凍干菌種，劃線接種含5%牛血清肉湯瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)典型菌落，接種5.0 ml含5%牛血清肉湯培養(yǎng)基，37℃，180 r/min，培養(yǎng)16 h，經(jīng)純檢合格后，作為一級(jí)種子。

（二）二級(jí)種子的繁殖

將檢驗(yàn)合格的一級(jí)種子按培養(yǎng)基總量的1%接種含5%牛血清肉湯培養(yǎng)基，37℃ 180 r/min，培養(yǎng)16 h，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為二級(jí)種子。

（三）發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化

將各生產(chǎn)用菌種按培養(yǎng)液總量的1%接種TSB，生物發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，37℃通氣培養(yǎng)24 h，自第6 h開始，每2 h收獲菌液，按此工藝平行3次，其攪拌速度為180 r/min，取樣并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，取三次試驗(yàn)結(jié)果的平均值，分別繪制該菌各血清型的生長曲線。

（四）滅活工藝優(yōu)化

將制備好的水貂綠膿桿菌濃縮菌液分為成5組，分別加入終濃度為0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的甲醛溶液，同時(shí)設(shè)未滅活對(duì)照，37℃滅活24 h，60 r/h，分別于第12、14、16、18、20、22和24小時(shí)取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。

（五）安全性試驗(yàn)

按照優(yōu)化后的生產(chǎn)工藝制備疫苗分別進(jìn)行對(duì)非靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)，對(duì)靶動(dòng)物單劑量和超劑量安全性試驗(yàn)。

1.對(duì)非靶動(dòng)物的安全性試驗(yàn)。疫苗腹腔接種5只18～20 g小鼠，0.3 ml/只，另5只作為對(duì)照，接種后觀察14日，記錄小鼠局部及全身反應(yīng)情況。

2.靶動(dòng)物單劑量和超劑量免疫安全性試驗(yàn)。選取15只2月齡水貂，隨機(jī)分為3組，5只/組，分別進(jìn)行免疫，單劑量組1.0 ml/只，超劑量組2.0 ml/只，另5只為對(duì)照。免疫后觀察14日，記錄水貂局部及全身反應(yīng)情況。

（六）效力試驗(yàn)

1.對(duì)水貂的效力試驗(yàn)。取2～5月齡健康易感水貂10只，隨機(jī)分為2組，每組5只。第1組水貂皮下注射疫苗1.0 ml/只；第2組水貂不免疫作為對(duì)照。免后21日，兩組水貂分別滴鼻接種10LD50的SD004株菌液0.2 ml，攻毒后觀察7日。對(duì)照組水貂應(yīng)全部死亡，免疫 組水貂應(yīng)至少保護(hù)4只。

2.對(duì)小鼠的效力試驗(yàn)。取體重18～20 g清潔級(jí)昆明小鼠20只，隨機(jī)分為 2組，每組10只。第1組小鼠各腹腔注射疫苗0.3 ml；第2組小鼠不免疫作為對(duì)照。免后21日，兩組小鼠分別滴鼻接種10LD50的SD004株菌液0.1ml，攻毒后觀察7日。對(duì)照組小鼠應(yīng)全部死亡，免疫組小鼠應(yīng)至少保護(hù)8只。

三、結(jié)果

（一）發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

培養(yǎng)B型菌液，以活菌計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制的生長曲線結(jié)果如圖1所示，在相同條件下，菌株在14～16 h培養(yǎng)范圍內(nèi)細(xì)菌存活數(shù)為高峰，考慮實(shí)際操作最佳培養(yǎng)時(shí)間為16 h。

（二）滅活工藝優(yōu)化結(jié)果

通過對(duì)滅活工藝進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)最終制備疫苗的甲醛含量，同時(shí)結(jié)合選擇甲醛濃度的滅活效果，結(jié)果如表1所示，37℃條件下，選擇按菌液總量的0.3%加入甲醛溶液，滅活24 h最為適合，能夠保證滅活效果。

表1　 37℃不同甲醛濃度下水貂綠膿桿菌的滅活效果

四、疫苗的安全性試驗(yàn)結(jié)果

（一）疫苗對(duì)非靶動(dòng)物的安全試驗(yàn)結(jié)果

疫苗對(duì)小鼠的安全性試驗(yàn)結(jié)果見表5，在觀察期內(nèi)小鼠全部健活，臨床表現(xiàn)正常、免疫局部和全身無不良反應(yīng)。

（二）最小使用日齡靶動(dòng)物單劑量免疫的安全試驗(yàn)結(jié)果

疫苗對(duì)最小使用日齡靶動(dòng)物單劑量免疫安全性試驗(yàn)結(jié)果見表3，單劑量接種2月齡水貂后，在觀察期內(nèi)水貂全部健活，臨床表現(xiàn)均正常、注射局部和全身無不良反應(yīng)，全部存活。

（三）靶動(dòng)物一次超劑量免疫安全性試驗(yàn)結(jié)果

疫苗對(duì)靶動(dòng)物一次超劑量免疫安全性試驗(yàn)結(jié)果見表4。超劑量接種2月齡水貂后，在觀察期內(nèi)水貂全部健活，臨床表現(xiàn)正常、免疫局部和全身無不良反應(yīng)，全部存活。

（四）疫苗的效力試驗(yàn)結(jié)果

1.對(duì)水貂的效力試驗(yàn)結(jié)果。B型滅活疫苗免后21日攻毒，疫苗免疫組水貂保護(hù)率為5/5，對(duì)照組水貂全部死亡（表5）。

2.對(duì)小鼠的效力試驗(yàn)結(jié)果。免后21日攻毒，三批疫苗免疫組小鼠保護(hù)率為9/10，對(duì)照組小鼠全部死亡（表6）。

表2　 對(duì)小鼠的安全性試驗(yàn)臨床觀察結(jié)果

表3　 對(duì)水貂最小使用日齡單劑量免疫安全性試驗(yàn)臨床觀察結(jié)果

表4　 靶動(dòng)物一次超劑量免疫安全性試驗(yàn)臨床觀察結(jié)果

表5　 對(duì)水貂的免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

表6　 對(duì)小鼠的免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

五、討論

中國于上世紀(jì)80年代初首次報(bào)道了水貂出血性肺炎病例，此后相繼有該病報(bào)道，調(diào)查發(fā)現(xiàn)中國各地水貂出血性肺炎B型菌株流行情況為8%～50%不等，由于各血清型之間無交叉保護(hù)，制備的單苗具有針對(duì)性。因此，研制一種防治水貂出血性肺炎的安全性好、保護(hù)效力高的滅活疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，本試驗(yàn)通過對(duì)制苗工藝的優(yōu)化獲得安全免疫效力較好的疫苗，在滅活時(shí)間上22 h也可以，但考慮到生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)等因素，選擇更為穩(wěn)定的24 h。

（略）