葉黃素對母鼠乳腺分泌IgA的促進作用

崔煥忠，張 輝，楊雨江，尹 劍，蘭海楠，鄭 鑫（吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

葉黃素對母鼠乳腺分泌IgA的促進作用

崔煥忠，張 輝，楊雨江，尹 劍，蘭海楠，鄭 鑫*
（吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

為明確葉黃素對母鼠乳腺分泌IgA能力的影響，本實驗對妊娠母鼠添加飼喂葉黃素，檢測母鼠血清中IgG、IgA和IgM含量變化，母鼠乳腺組織中IgA mRNA表達量和IgA抗體分泌細胞數量變化，以及仔鼠胃內容物中IgA濃度變化。結果表明：在妊娠21 d和分娩后7 d時，實驗組血清中IgG和IgA濃度顯著高于正常對照組（P＜0.05），IgM含量雖有升高，與正常對照組相比，無顯著性差異（P＞0.05）；乳腺組織中IgA mRNA表達量無顯著變化（P＞0.05）；分娩后14 d IgA抗體分泌細胞數量顯著增加（P＜0.05）；仔鼠胃內容物中IgA含量極顯著高于對照組（P＜0.01）。說明給妊娠母鼠添加飼喂葉黃素可以增強乳腺分泌IgA的能力。

母鼠；葉黃素；乳腺；IgA

葉黃素（lutein）屬于類胡蘿卜素（carotenoid），在蔬菜、水果、花卉和某些藻類生物中廣泛存在[1]。天然葉黃素具有獨特的生物學功能，目前對葉黃素的研究主要集中在抗氧化作用[2-3]、抑制腫瘤細胞增殖[4-7]、預防心血管與老年性疾病[8-10]以及對機體免疫功能的調節(jié)[11-13]。鑒于葉黃素安全無毒，已被作為食品補充劑在食品、飲料、化妝品、保健食品，甚至嬰幼兒食品中添加，研究開發(fā)以葉黃素為功能因子的功能性食品和膳食補充劑已成為食品產業(yè)中的研究熱點[6]。本實驗室前期研究表明，妊娠母鼠飼喂葉黃素，可以增強仔鼠被動免疫能力。被動免疫是新生兒能夠存活和健康生長的關鍵，而初乳和常乳是新生兒營養(yǎng)和免疫組成的來源，其中乳汁中IgA是提供新生兒消化道黏膜免疫主要免疫球蛋白。母鼠免疫水平高低直接影響新生仔鼠免疫水平，且乳腺分泌IgA能力的高低與仔鼠被動免疫密切相關，妊娠母鼠添加葉黃素提高仔鼠被動免疫水平是否是通過提高母鼠乳腺生成與分泌IgA能力來實現(xiàn)尚未見報道。本研究對妊娠母鼠添加飼喂葉黃素，檢測母鼠血清中免疫球蛋白及乳腺生成與分泌IgA水平，明確添加葉黃素對妊娠母鼠乳腺分泌IgA能力的影響，為富含葉黃素食品開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級健康7～8 周齡雌性昆明鼠50 只、雄性昆明鼠25 只，體質量24～28 g，購自于吉林大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（吉）2003-0001。

1.1.2 材料與試劑

葉黃素（純度為95%） 西安瑞林生物科技有限公司。

Mouse IgA、IgG及IgM酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）定量試劑盒 美國Bethyl公司；SABC three-step試劑盒 杭州博士德生物有限公司；RNAiso Plus Kit、PrimeScript RT?Reagent Kit with gDNA Eeaser（Perfect Real Time）、SYBR?Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus） 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及添加飼喂

小鼠購買后，給予1 周的時間適應環(huán)境，飼養(yǎng)環(huán)境為無致病菌，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21～24 ℃，相對濕度為48%～65%。1 周后開始實驗，將2 只雌鼠和1 只雄鼠于20：00放于同一籠中飼養(yǎng)，第二天8：00檢查陰道栓，選取陰道栓陽性的雌鼠32 只，隨機分為4 組，每組8 只，兩組為葉黃素添加實驗組，兩組為正常對照組。其中實驗一組用于母鼠妊娠7、14、21 d的血液樣品、母鼠分娩后7 d的血液樣品和乳腺組織樣品以及仔鼠出生7 d胃內容樣品的采集；實驗二組用于母鼠分娩后14 d血液樣品和乳腺組織樣品以及仔鼠出生14 d胃內容樣品的采集。所有實驗小鼠單籠飼養(yǎng)，參照張靜等[12]飼喂小鼠葉黃素的劑量1.2 mg/（kg·d）（以體質量計，下同）以及Kim等[14]飼喂犬的劑量，從妊娠開始實驗一組和實驗二組小鼠按每千克日糧添加50 mg葉黃素進行添加飼喂實驗，正常對照組小鼠飼喂正常日糧（含有葉黃素），添加時間為從母鼠妊娠開始至實驗結束。

1.2.2 樣品采集及處理

1.2.2.1 母鼠血液樣品的采集

分別于母鼠妊娠7、14、21 d、分娩后7 d和14 d時，乙醚麻醉實驗組和正常對照組各8 只母鼠，斷尾采集母鼠的血液樣品，樣品室溫放置1 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，分裝后，置于－20 ℃保存，用于免疫球蛋白含量的測定。

1.2.2.2 母鼠乳腺組織樣品的采集

分別于母鼠分娩后7 d和14 d時，乙醚麻醉實驗組和正常對照組各8 只母鼠，在完成上述血液樣品采集后，處死母鼠，采集乳腺組織，一部分乳腺組織樣品迅速用液氮凍存，用于IgA mRNA表達量的分析；另一部分乳腺組織樣品用10%福爾馬林中性固定液進行固定，用于免疫組化分析IgA抗體分泌細胞（IgA antibody-secreting cell，IgA ASC）數量。

1.2.2.3 仔鼠胃內容物樣品的采集

分別在仔鼠出生7 d和14 d時，每窩各取5 只仔鼠，實驗組和正常對照組各取40 只仔鼠，乙醚麻醉后處死仔鼠，采集胃內容樣品，分裝后，置于－20 ℃保存，用于IgA含量的測定。

1.2.3 母鼠血清中免疫球蛋白含量的測定

將血清樣品于室溫解凍，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋2 000 倍，按照Mouse IgA、IgG及IgM ELISA定量試劑盒說明書操作步驟，測定血清樣品中IgG、IgA及IgM的含量，根據樣品稀釋倍數，計算樣品中IgG、IgA及IgM的含量，分析妊娠7、14、21 d、分娩后7 d和分娩后14 d血清中免疫球蛋白含量的變化[14-15]。

1.2.4 實時熒光定量檢測乳腺組織 IgA mRNA表達量[16]

液氮研磨乳腺組織樣品，利用RNAiso Plus Kit提取樣品中總RNA，利用PrimeScript RT?Reagent Kit將RNA反轉錄為cDNA，按照SYBR?Premix Ex Taq? II說明書步驟進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），引物序列如下：IgA C段恒定區(qū)：正向引物5’-TGCACAGTTACCCATCCTGA-3’，反向引物5’-GCACCAGCACTTCTTTAGGG-3’；β-actin：正向引物5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’，反向引物5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。以β-actin為內參基因，采用ΔΔCt方法分析IgA mRNA表達變化。

1.2.5 免疫組化檢測乳腺IgA ASC數量

乳腺組織樣品用10%福爾馬林中性固定液固定24 h后，進行脫水、透明、浸蠟處理，包埋于石蠟中，制成6 μm厚度的切片，切片經烘片、脫蠟、復水后，利用SABC three-step試劑盒進行免疫反應，顯色結束后，再進行脫水透明和封片。每只母鼠隨機選取5 個不同400×電鏡下視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽性細胞數量。

1.2.6 仔鼠胃內容物中IgA含量的測定

將胃內容物樣品于室溫解凍，用含有蛋白酶抑制劑的PBS進行200 倍稀釋，利用ELISA定量試劑盒測定樣品中IgA含量。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 母鼠血清中免疫球蛋白的含量

圖1 母鼠血清中IgG（a）和IgA（b）含量（n==88）Fig. 1 Serum IgG (a) and IgA (b) concentrations in maternal mice (n = 8)

從妊娠開始至分娩后14 d，每隔7 d采血一次，利用ELISA定量試劑盒測定血清中IgG、IgA和IgM的含量，結果如圖1所示，從妊娠第7天開始，IgG和IgA含量開始升高，妊娠21 d時達到最高，妊娠21 d和分娩后7 d時均顯著高于正常對照組（P＜0.05），表明添加飼喂葉黃素可以增加母鼠血清中IgG和IgA水平；血清中IgM的含量與正常對照組相比，無顯著性差異（圖中未顯示）。

2.2 母鼠乳腺組織中IgA mRNA表達量

圖2 母鼠乳腺中IgA mRNA表達量（n==88）Fig. 2 IgA mRNA expression in maternal mammary glands (n = 8)

根據IgA C區(qū)恒定區(qū)序列設計1 對引物，實時熒光定量PCR檢測IgA mRNA表達量，結果如圖2所示，在分娩后7 d和14 d時，實驗組母鼠乳腺中IgA mRNA表達量與正常對照組相比均沒有顯著變化（P＞0.05）（圖中未顯示）。

2.3 母鼠乳腺組織中IgA ASC數量檢測結果

表1 母鼠乳腺中IgA ASC數（x =8）Table 1 Number of IgA ASC in maternal mammary glands (s, = 8)

表1 母鼠乳腺中IgA ASC數（x =8）Table 1 Number of IgA ASC in maternal mammary glands (s, = 8)

注：*. 與正常對照組相比，差異顯著（P＜0.05）。

組別IgA ASC數量/（個/10 000 μm2）分娩后7 d 分娩后14 d正常對照組 6.3±0.48.8±0.6實驗組 6.7±0.511.9±0.9*

免疫組化方法檢測IgA ASC數量，由表1可知，實驗組母鼠分娩后7 d和14 d IgA ASC數量均增加，并于分娩后14 d顯著高于正常對照組（P＜0.05）。

2.4 仔鼠胃內容物中的IgA含量

表2 仔鼠胃內容物中IgA含量測定結果（±s，n==4400）Table 2 IgA content in stomach contents of neonatal mice (, n = 40)

表2 仔鼠胃內容物中IgA含量測定結果（±s，n==4400）Table 2 IgA content in stomach contents of neonatal mice (, n = 40)

注：**. 與正常對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。

組別IgA含量/（μg/g）分娩后7 d分娩后14 d正常對照組14.1±3.141.9±4.5實驗組26.8±3.7**71.2±8.6**

檢測出生仔鼠胃內容物IgA含量，結果如表2所示，實驗組仔鼠在分娩后7 d和14 d胃內容物中IgA含量均極顯著高于正常對照組（P＜0.01）。

3 結論與討論

在化妝品、飲料和食品行業(yè)中作為食品添加劑和保健食品原料被廣泛使用的葉黃素，其在提高機體免疫能力方面的作用越來越被重視。研究表明，給禽類添加飼喂葉黃素，不僅可以有效阻止自由基對胚胎的過氧化損傷[17-18]，還可提高幼雛血清抗氧化水平[19]。種蛋中葉黃素含量高，孵化后其子代具有良好的淋巴細胞合成能力和細胞免疫能力。給雌鵪鶉及子代鵪鶉飼料中添加葉黃素，可以顯著提高卵黃中IgG水平，子代鵪鶉血清IgG的含量與葉黃素的添加量成正比，高劑量葉黃素可顯著提高1 日齡子鵪鶉血清中IgG水平[20]。

高品質乳汁對新生兒獲得最佳營養(yǎng)和被動免疫至關重要，IgA是乳汁中最主要的一種免疫球蛋白，可為新生兒提供保護對抗致病微生物抗原[21-22]。本研究開展了對妊娠母鼠添加飼喂葉黃素，檢測乳腺分泌IgA的能力，結果表明，添加飼喂葉黃素可以顯著增加母鼠血清中IgG和IgA含量，乳汁中和黏膜分泌物中的IgA可能來自于血清中IgA[23]，因此血清中IgA含量的增加有助于向乳汁中轉移。母鼠添加飼喂葉黃素，雖然乳腺組織中的IgA mRNA表達量沒有顯著變化，但乳腺中IgA ASC數量顯著增 加，表明乳腺分泌IgA的能力增強。分娩后14 d，仔鼠胃內容物中IgA含量升高極顯著，也反映出添加葉黃素可有效增加母鼠乳汁中IgA的含量，這與β-胡蘿卜素營養(yǎng)作用類似[24-25]。綜上，妊娠母鼠添加飼喂葉黃素，可有效增加乳腺分泌IgA的能力，有助于增強仔鼠被動免疫能力。因此，葉黃素作為保健食品原料或食品添加劑，可能提高母體乳汁中IgA的含量，提高新生兒被動免疫能力，促進人類健康。

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Promoting Effect of Lutein on the IgA Secretion Capacity of Mammary Glands in Maternal Mice

CUI Huanzhong, ZHANG Hui, YANG Yujiang, YIN Jian, LAN Hainan, ZHENG Xin*
(College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The present experiment was conducted to explore the effect of supplemental lutein on the serum concentrations of IgG, IgA and IgM, the mRNA expression of IgA C-region and the number of IgA antibody-secreting cells (ASC) in breast of maternal mice as well as IgA concentration in stomach contents of neonatal mice. Maternal mice were fed rodent feed or 50 mg/kg lutein-supplemented rodent feed during pregnancy and after parturition. The serum concentrations of IgG and IgA increased signifi cantly at 21 days of pregnancy and at 7 days after parturition (P < 0.05), but IgM concentration and the mRNA expression of IgA C-region were not signifi cantly affected by lutein supplementation (P > 0.05). The number of IgA ASC at 14 days after parturition (P < 0.05) and the IgA concentration in stomach contents of neonatal mice at 7 and 14 days after parturition were enhanced markedly (P < 0.01) in response to lutein supplemention. These results indicated that supplemental lutein for maternal mice is effective in enhancing the secretion of IgA in mammary glands.

maternal mouse; lutein; mammary glands; IgA

10.7506/spkx1002-6630-201611037

R392.9

A

1002-6630（2016）11-0214-04

崔煥忠, 張輝, 楊雨江, 等. 葉黃素對母鼠乳腺分泌IgA的促進作用[J]. 食品科學, 2016, 37(11): 214-217. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611037. http://www.spkx.net.cn

CUI Huanzhong, ZHANG Hui, YANG Yujiang, et al. Promoting effect of lutein on the IgA secretion capacity of mammary glands in maternal mice[J]. Food Science, 2016, 37(11): 214-217. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611037. http://www.spkx.net.cn

2015-08-23

吉林省科技廳國際科技合作項目（20130413037GH）；吉林省科技廳自然科學基金項目（20140101028JC）

崔煥忠（1973—），男，副教授，博士研究生，研究方向為動物營養(yǎng)免疫調控。E-mail：huanzhongcui@163.com

*通信作者：鄭鑫（1965—），女，教授，博士，研究方向為動物營養(yǎng)調控。E-mail：zhengxinjilin@126.com