羅　杰　王建沅　周成旭　嚴(yán)小軍　徐繼林　駱其君　馬　斌　吳小凱

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

紅光下培養(yǎng)方式對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞增殖及其活力的影響

羅杰王建沅周成旭嚴(yán)小軍徐繼林駱其君馬斌吳小凱

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

雨生紅球藻；綠色細(xì)胞；紅光；培養(yǎng)方式

研究重點(diǎn)針對(duì)雨生紅球藻綠色游動(dòng)細(xì)胞的增殖培養(yǎng)階段，分析了在利于細(xì)胞增殖的紅光條件下，幾種培養(yǎng)方式的調(diào)整對(duì)增殖過(guò)程和細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示：（1）在紅光下，增殖平臺(tái)期維持時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞活力穩(wěn)定，細(xì)胞中性脂無(wú)累積，但進(jìn)入平臺(tái)期前，細(xì)胞中性脂有規(guī)律波動(dòng)，進(jìn)入平臺(tái)期后相對(duì)穩(wěn)定； 通過(guò)更新率為20%的半連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)產(chǎn)出較批次培養(yǎng)提高57%； 半連續(xù)培養(yǎng)中細(xì)胞呈現(xiàn)脅迫調(diào)節(jié)的時(shí)間較批次培養(yǎng)晚。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，半連續(xù)培養(yǎng)下細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)鹽吸收能力降低。（2）初始接種密度與細(xì)胞增殖速率及細(xì)胞光合活力呈負(fù)相關(guān)：初始密度低的細(xì)胞增殖速率較高，細(xì)胞光合作用活力高。（3）在培養(yǎng)過(guò)程中添加CO2時(shí)，最大密度均有提高，達(dá)6.0×105cells/mL，較無(wú)添加組提高54%； 細(xì)胞分裂速率均有提高，但紅光下較白光下增殖速率高（分別為0.223/d和0.198/d）； 添加CO2降低培養(yǎng)液pH，利于維持適宜增殖的pH環(huán)境。葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及細(xì)胞粒徑在紅光和白光下有顯著差異：紅光下，F(xiàn)v/Fm顯著高于白光下； 紅光下補(bǔ)充CO2顯著減小細(xì)胞粒徑，而白光下粒徑無(wú)顯著變化。研究結(jié)果顯示，在紅光下，采用間斷式半連續(xù)培養(yǎng)補(bǔ)充CO2培養(yǎng)綠色游動(dòng)細(xì)胞，有利于提升細(xì)胞活力與產(chǎn)出。

蝦青素是一種次生類(lèi)胡蘿卜素，具有艷麗的色澤以及強(qiáng)的抗氧化能力，被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品添加劑、化妝品和醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域［1］。能合成蝦青素的生物有甲殼類(lèi)生物、酵母以及一些微型藻類(lèi)。蝦青素也可人工合成［2］。雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種淡水單細(xì)胞綠藻。其休眠孢囊內(nèi)蝦青素含量可占到細(xì)胞干重的4%［3］。不僅如此，紅球藻來(lái)源的天然蝦青素生物活性及其安全性均高于人工合成蝦青素或其他生物來(lái)源的蝦青素［4，5］，因此，紅球藻是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蝦青素的理想材料。

培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的工業(yè)實(shí)踐依賴(lài)于紅球藻的生物學(xué)特征。紅球藻生活史周期有典型的綠色游動(dòng)細(xì)胞期和紅色休眠孢囊期。綠色游動(dòng)細(xì)胞具有高的光合效率及細(xì)胞活性，以及活躍的細(xì)胞分裂能力，是紅球藻生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)高生物量的關(guān)鍵階段； 受環(huán)境條件脅迫時(shí)，細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)入紅色休眠孢囊階段，此期細(xì)胞分裂速率下降并大量累積蝦青素［6］，是蝦青素生產(chǎn)的關(guān)鍵階段。因此，工業(yè)生產(chǎn)上常采用兩步法培養(yǎng)［7，8］：第一步，綠色細(xì)胞增殖培養(yǎng)，以獲得最大生物量為階段目標(biāo)； 第二步，通過(guò)光、鹽、營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫或添加胡蘿卜素合成的前體底物等手段［9，10］，達(dá)到蝦青素最大最優(yōu)化累積。另外，細(xì)胞在兩步驟轉(zhuǎn)換過(guò)程中可能因脅迫造成死亡而造成生產(chǎn)損失，轉(zhuǎn)換界面階段細(xì)胞狀態(tài)也是整個(gè)工藝流程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11］。并且，對(duì)高活力的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行脅迫，所能合成的蝦青素比細(xì)胞活力低的細(xì)胞合成的蝦青素含量更高［12—14］。因此，以高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蝦青素為目標(biāo)進(jìn)行紅球藻培養(yǎng)時(shí)，獲得最大密度且高活力的綠色細(xì)胞是產(chǎn)量與質(zhì)量的基礎(chǔ)保障［15］。但是，生產(chǎn)實(shí)踐中一個(gè)關(guān)鍵的瓶頸即是綠色游動(dòng)細(xì)胞生物量低［16，17］，細(xì)胞密度一般都低于5.0×105cells/ mL［18］。其原因與紅球藻細(xì)胞對(duì)環(huán)境條件變化異常敏感有關(guān)，常造成培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞分裂速度慢、活力低。因此，如何優(yōu)化綠色細(xì)胞增殖條件獲得最大最優(yōu)化細(xì)胞產(chǎn)出是第一步生產(chǎn)的關(guān)鍵。

光強(qiáng)和光質(zhì)都對(duì)細(xì)胞分裂、細(xì)胞狀態(tài)及其周期間轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響［19］。紅色光質(zhì)能促進(jìn)雨生紅球藻綠色細(xì)胞生長(zhǎng)已被大多數(shù)研究者所接受并不斷進(jìn)行其條件優(yōu)化的研究［14，20，21］。吳霞等將紅色轉(zhuǎn)光膜應(yīng)用于紅球藻養(yǎng)殖，發(fā)現(xiàn)生物量明顯得到了改善，比普通聚乙烯塑料薄膜提高了8.8%以上［22］。在綠色細(xì)胞培養(yǎng)階段，增加紅色光質(zhì)比例可以明顯利于綠色細(xì)胞增殖［23］。王建沅等［24］研究了紅光下紅球藻增殖過(guò)程受營(yíng)養(yǎng)鹽調(diào)節(jié)特征發(fā)現(xiàn)，由于起始營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)初期增殖、細(xì)胞最大產(chǎn)量以及增殖時(shí)間都有影響，認(rèn)為半連續(xù)培養(yǎng)是適宜紅球藻綠色細(xì)胞生長(zhǎng)的一種培養(yǎng)方式。雖然不少研究已經(jīng)證明，光質(zhì)在紅球藻生產(chǎn)蝦青素全程具有重要的作用，尤其是兩步培養(yǎng)法工藝中分別提供紅、藍(lán)單色光質(zhì)可有效提高階段目標(biāo)培養(yǎng)物產(chǎn)量，并且LED光照技術(shù)也為優(yōu)化工藝提供了條件。但是，分段分光質(zhì)方法尚未廣泛應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中、紅球藻不同株系特征及其各種養(yǎng)殖條件常各不相同，要保障成功且可持續(xù)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，尚需大量綜合研究與分析。

本研究針對(duì)雨生紅球藻綠色細(xì)胞培養(yǎng)階段的優(yōu)化調(diào)節(jié)進(jìn)行研究，分析紅光條件下幾種培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞增殖及其過(guò)程的影響。主要比較了批次培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程差異； 批次培養(yǎng)方式下，不同初始接種密度對(duì)細(xì)胞增殖過(guò)程的影響； 以及批次培養(yǎng)中補(bǔ)充CO2對(duì)細(xì)胞增殖過(guò)程及細(xì)胞粒徑的影響，以期為紅球藻生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供理論參考。

1　材料與方法

1.1藻種與培養(yǎng)基

雨生紅球藻購(gòu)于中科院水生所，品系為797。于寧波大學(xué)微藻種質(zhì)室保種，保種及實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為BG11或NMB3#培養(yǎng)基［24］。

1.2實(shí)驗(yàn)方法與條件設(shè)置

紅光條件下，紅球藻的半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)過(guò)程比較取預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)期藻液，接種至6個(gè)裝有新鮮配制NMB3#培養(yǎng)基的錐形瓶中，初始接種密度為3.2×104cells/mL，體積為400 mL。各取3瓶設(shè)置批次培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)目標(biāo)。半連續(xù)培養(yǎng)方式下，待各組增殖至平臺(tái)期時(shí)，進(jìn)行更新處理，每次更新20%，共進(jìn)行3次間隔時(shí)間為6d的更新（F1、F2、F3）。各組均置于溫度為23℃、紅色LED光照為36 μmol/（m2·s）（L∶D=12∶12）的培養(yǎng)室中。在培養(yǎng)過(guò)程中，隔天分別取樣，檢測(cè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度、氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度變化以及細(xì)胞中性脂變化。用Water-PAM葉綠素?zé)晒鈨x檢測(cè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)。細(xì)胞密度以浮游植物計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)（北京普利特儀器公司）。氮磷濃度以Smartchem 全自動(dòng)化學(xué)分析儀200分析，實(shí)驗(yàn)中取水樣凍存，待全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后低溫避光解凍后檢測(cè)。細(xì)胞中性脂檢測(cè)參考王金娜等［25］的方法，以尼羅紅試劑進(jìn)行細(xì)胞染色后，檢測(cè)吸光值進(jìn)行分析。

在紅光條件下不同初始接種密度對(duì)紅球藻批次培養(yǎng)細(xì)胞增殖及其過(guò)程的影響取預(yù)培養(yǎng)至平臺(tái)初期紅球藻液，密度約為5.0×104cells/mL，以新鮮配制NMB3#培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)纬刹煌♂尪鹊?組初始接種密度，稀釋比例分別為：密度Ⅰ（藻液/培養(yǎng)液=1∶5）、密度Ⅱ（藻液/培養(yǎng)液=1∶10）、密度Ⅲ（藻液/培養(yǎng)液=1∶15）、密度Ⅳ（藻液/培養(yǎng)液= 1∶20）。實(shí)驗(yàn)水體200 mL，設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。置于溫度為25℃、紅色LED光照為65 μmol/（m2·s）（L∶D=12∶12）的培養(yǎng)室中。每日上下午各搖瓶一次。隔天分別取樣檢測(cè)細(xì)胞密度和葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化。

添加CO2對(duì)批次培養(yǎng)細(xì)胞增殖過(guò)程及其細(xì)胞大小的影響取預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)期的藻液（1.5×105cells/ mL） 500 mL，接種至1000 mL BG11培養(yǎng)液中（3000 mL錐形瓶，培養(yǎng)水體體積1500 mL），初始密度為5.0×104cells/mL。為了比較復(fù)合白色光源和紅色LED光源下微藻受CO2影響的差異，本研究于相同光強(qiáng)的白光與紅光條件下，分別設(shè)置CO2添加組與不加CO2的對(duì)照組，形成紅光實(shí)驗(yàn)組（加CO2）RLED+ CO2和對(duì)照組RLED以及白光實(shí)驗(yàn)組（加CO2）CWh+ CO2及其對(duì)照組CWh。各3平行，置于溫度為25℃，光照強(qiáng)度為30 μmol/（m2·s）（L ：D=12 ：12）的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每日定期搖瓶三次。采用4L CO2鋼瓶，通過(guò)磁力閥以及CO2細(xì)化器，通入微量細(xì)化CO2，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CO2添加組的添加量設(shè)為0.3 mL/min，晝通夜關(guān)。每12h 取樣檢測(cè)培養(yǎng)液pH，隔天檢測(cè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm。為了分析細(xì)胞大小在培養(yǎng)過(guò)程中的相應(yīng)變化，本實(shí)驗(yàn)隔天取樣，以CASY顆粒計(jì)數(shù)儀（Innovatis，Germany）檢測(cè)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞粒徑。

1.3數(shù)據(jù)分析

其中：N為T(mén)天時(shí)的細(xì)胞濃度，N0為初始細(xì)胞濃度。

細(xì)胞生產(chǎn)力［cells/（mL·d）］按以下公式計(jì)算［26］：細(xì)胞生產(chǎn)力=，

其中：Ct1與Ct2分別為t1、t2所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度。

氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽消耗速率的計(jì)算方法：r（%/d）=

數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行制圖，采用SPSS 13.0單因素方差分析（one way ANOVA）執(zhí)行Duncan檢測(cè)分析條件的顯著性（P＜0.05說(shuō)明條件影響顯著）。采用Bivariate過(guò)程pearson相關(guān)系數(shù)雙邊檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（P＜0.05說(shuō)明相關(guān)性顯著，P＜0.01說(shuō)明變量之間相關(guān)性極顯著）。

2　結(jié)果

2.1在紅光條件下紅球藻的半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)過(guò)程比較

細(xì)胞密度變化紅球藻在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的光照條件下能維持穩(wěn)定的細(xì)胞增殖，并且在進(jìn)入平臺(tái)期后，批次培養(yǎng)及半連續(xù)方式下，藻細(xì)胞均能較長(zhǎng)時(shí)間維持于綠色游動(dòng)細(xì)胞狀態(tài)而不下沉。細(xì)胞增殖情況如圖1A所示。對(duì)半連續(xù)方式實(shí)驗(yàn)組，分別在培養(yǎng)的第18、第24、第30天進(jìn)行20%更新。由圖中結(jié)果可以看出，在細(xì)胞增殖至平臺(tái)初期后，進(jìn)行第1次更新時(shí)（18d），細(xì)胞密度回落至2.2×105cells/mL，但能在2d內(nèi)增殖至更新前相同水平（3.3×105cells/mL），而從相似密度的指數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞（10d）批次培養(yǎng)增殖至該密度時(shí)需要8d時(shí)間。從細(xì)胞生產(chǎn)力角度的分析結(jié)果（圖1B）可以看出，半連續(xù)培養(yǎng)方式可以顯著提高細(xì)胞生產(chǎn)力：其細(xì)胞生產(chǎn)力顯著大于批次培養(yǎng)平臺(tái)期的細(xì)胞生產(chǎn)力（P＜0.05）。由批次培養(yǎng)最后收獲（36d，3平行總計(jì)）的細(xì)胞數(shù)為2.1×108cells，半連續(xù)培養(yǎng)下總計(jì)收獲的細(xì)胞數(shù)為3.3×108cells，提高57%。從圖1B還可以看出，進(jìn)行半連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，3次不同更新時(shí)間下細(xì)胞增殖能力有所不同，平臺(tái)初期更新細(xì)胞的增殖恢復(fù)最快，細(xì)胞生產(chǎn)力最高，平臺(tái)后期更新時(shí)，細(xì)胞生產(chǎn)力顯著降低（P＜0.05）。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化由圖2可以看出，在半連續(xù)培養(yǎng)方式下，更新培養(yǎng)液能顯著提高細(xì)胞的光合能力。批次培養(yǎng)至平臺(tái)后期時(shí)，F(xiàn)v/Fm和qP均下降，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞光合能力相對(duì)下降，電子傳遞速率也趨于下降。而在半連續(xù)培養(yǎng)方式下，更新培養(yǎng)液后的Fv/Fm、qP和ETR均恢復(fù)至高于批次培養(yǎng)組，說(shuō)明其細(xì)胞光合能力提高。從NPQ的變化特征來(lái)看，指數(shù)增殖及平臺(tái)前期和中期細(xì)胞的NPQ值相對(duì)穩(wěn)定且數(shù)值較低，批次培養(yǎng)至平臺(tái)后期時(shí)NPQ值顯著增加，半連續(xù)培養(yǎng)在第3次更新后期NPQ值也相對(duì)增加，說(shuō)明細(xì)胞提高光保護(hù)響應(yīng)。半連續(xù)培養(yǎng)方式下NPQ提高的時(shí)間較批次培養(yǎng)時(shí)間推遲，顯示細(xì)胞響應(yīng)變化延后。

培養(yǎng)液氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽消耗特征在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的營(yíng)養(yǎng)鹽條件下，營(yíng)養(yǎng)鹽消耗迅速，8—10d 后，氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽均消耗至低水平（圖3A，B），細(xì)胞增殖進(jìn)入平臺(tái)前期。批次培養(yǎng)時(shí)，進(jìn)入平臺(tái)期后，氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽維持低值，細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定。在半連續(xù)培養(yǎng)方式下，更新培養(yǎng)液后，對(duì)氮的消耗迅速，3次更新的每日消耗率依次為42%、40%和33%，前面的兩次更新后，氮濃度迅速均回復(fù)低水平。第3次更新時(shí)，氮的消耗速率降低，后續(xù)消耗率維持在16%—22%，顯示隨著更新次數(shù)增加，對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽消耗速率降低。指數(shù)增殖期對(duì)磷的消耗率與氮消耗有相似的特點(diǎn)，指數(shù)期最高（圖3C，D），批次培養(yǎng)進(jìn)入平臺(tái)期后，仍然有磷元素的吸收消長(zhǎng)。在半連續(xù)更新培養(yǎng)中，磷的消耗速率較氮消耗速率低（P＜0.05）。

圖1　半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)中雨生紅球藻細(xì)胞密度及細(xì)胞生產(chǎn)力變化Fig. 1　The cell growth and productivity in batch culture and fed-batch culture

圖2　半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化Fig. 2　The change of chlorophyll fluorescence parameters in batch culture and fed-batch culture

圖3　半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)方式下氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽消耗特征Fig. 3　Nitrogen and phosphorus consumptions in batch culture and fed-batch culture

細(xì)胞中性脂變化以尼羅紅熒光染料對(duì)紅球藻細(xì)胞中性脂進(jìn)行染色，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化，分析細(xì)胞增殖過(guò)程中中性脂的相對(duì)變化特征，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，單位細(xì)胞中性脂的熒光值變化處于最低4最高10的相對(duì)區(qū)間中，全程平均為6.0 FI/cell，且培養(yǎng)始末的中性脂水平相當(dāng)（7.0 FI/cell）； 從接種初始到細(xì)胞指數(shù)增殖時(shí)期至平臺(tái)前期（0—16d），細(xì)胞中性脂含量呈規(guī)律升降波動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)入平臺(tái)期后，升降變化消失，單位細(xì)胞中性脂含量相對(duì)穩(wěn)定。雖然圖4顯示平臺(tái)后期批次培養(yǎng)的單位細(xì)胞中性脂低于半連續(xù)培養(yǎng)組，但因指數(shù)期時(shí)即顯示該特征，可能與兩種培養(yǎng)方式無(wú)關(guān)。在3次更新中，細(xì)胞中性脂沒(méi)有顯著的變化（P＞0.05）。

圖4　半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)方式下紅球藻細(xì)胞中性脂的相對(duì)變化Fig. 4　The variation of cellular neutral fatty acid in batch culture and fed-batch culture

2.2在紅光條件下，不同初始接種密度對(duì)紅球藻批次培養(yǎng)細(xì)胞增殖過(guò)程影響

細(xì)胞密度的變化不同初始密度下藻細(xì)胞增殖情況如圖5所示。從圖中可以看出，在本研究的接種密度下，細(xì)胞迅速增殖沒(méi)有停滯期。初始密度高的藻細(xì)胞其增殖速率越低，呈反相關(guān)關(guān)系（圖6）。在增殖結(jié)束后，較低密度的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組最終生物量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖5　不同初始接種密度下雨生紅球藻的細(xì)胞增殖Fig. 5　The cell proliferation from different initial cell densities

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化不同初始密度接種時(shí)，初始密度高的藻細(xì)胞光合活性明顯低于初始密度低的光合活性，表現(xiàn)為初始密度高的密度Ⅰ組Fv/Fm和ETR在培養(yǎng)全程處于相對(duì)低水平，F(xiàn)v/Fm僅在其初始狀態(tài)以下波動(dòng)； 而初始密度相對(duì)較低的密度Ⅲ和密度Ⅳ組，F(xiàn)v/Fm和ETR較初始水平有一定的提升。這說(shuō)明初始密度差異可影響細(xì)胞光合能力，初始接種密度低有利于提高細(xì)胞光合能力。但是NPQ和qP各組之間全程沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

圖6　不同初始接種密度下的紅球藻細(xì)胞增殖速率Fig. 6　The cell growth rate of different initial cell densities

2.3添加CO2對(duì)批次培養(yǎng)細(xì)胞增殖過(guò)程及細(xì)胞大小的影響

細(xì)胞密度及細(xì)胞粒徑變化本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)靜置培養(yǎng)的雨生紅球藻液以細(xì)化散氣的方式添加純CO2，研究白色日光燈光源和紅色LED光源條件下，添加CO2對(duì)綠色細(xì)胞增殖過(guò)程的影響。結(jié)果顯示：添加CO2有助于紅球藻綠色細(xì)胞的增殖，具體表現(xiàn)為延滯期顯著縮短、細(xì)胞分裂速率提高（圖8a，b）。其中，紅光和白光下通氣組細(xì)胞增殖速率分別為：0.223/d、0.198/d，無(wú)添加的對(duì)照組分別為：0.168/d、0.190/d，添加CO2對(duì)紅光下的增殖速率促進(jìn)作用明顯。從細(xì)胞大小變化來(lái)看，紅光下添加CO2實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞粒徑顯著小于對(duì)照組（P＜0.05）（圖8c）。其中，實(shí)驗(yàn)組平均粒徑為（14.6±2.4） μm，對(duì)照組為（17.6±2.6） μm。在 白光下添加CO2比對(duì)照組細(xì)胞粒徑雖有降低但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖8d）。對(duì)細(xì)胞生產(chǎn)力分析結(jié)果也顯示（圖9），在紅光下添加CO2對(duì)細(xì)胞生產(chǎn)力有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），在白光下則無(wú)穩(wěn)定的促進(jìn)作用，其后期的對(duì)照組細(xì)胞生產(chǎn)力大于實(shí)驗(yàn)組。

藻液pH及藻細(xì)胞光合能力（Fv/Fm）變化兩種光照條件無(wú)添加C O2情況下，p H維持在10.0±0.5的較高水平，并呈現(xiàn)出“晝升夜降”的穩(wěn)定波動(dòng)（圖10A，B）。在添加CO2的實(shí)驗(yàn)組中，培養(yǎng)液pH均顯著下降，在本實(shí)驗(yàn)中添加細(xì)化后的純CO2，pH可維持在7—8，使紅球藻處于最適pH環(huán)境。

在不同光照條件下，以細(xì)化散氣方式添加純CO2對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ的最大光合效率Fv/Fm的影響主要體現(xiàn)在細(xì)胞增殖后期，此期紅光下與白光下實(shí)驗(yàn)組的Fv/Fm均顯著大于無(wú)CO2對(duì)照組（P＜0.05）（圖10C，D）。說(shuō)明添加CO2可有助于提升紅球藻綠色細(xì)胞的光合作用活力。

圖7　不同初始接種密度下的紅球藻細(xì)胞增殖過(guò)程中的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化Fig. 7　The variation of chlorophyll fluorescence parameters during cell proliferation from different initial cell densities

圖8　紅光與白光條件下通入CO2對(duì)細(xì)胞增殖與細(xì)胞粒徑變化的影響Fig. 8　The cell growth and cell size under red and white light conditions with CO2bubbling in or not

3　討論

獲得最大生物量是雨生紅球藻生產(chǎn)中的第一要?jiǎng)?wù)。提升生物量的前提需提升紅球藻綠色細(xì)胞活力［27］。因?yàn)?，雖然蝦青素的含量及合成速率在紅球藻各個(gè)生活周期中顯著不同，但蝦青素的積累速率在游動(dòng)細(xì)胞和不動(dòng)細(xì)胞中是相同的，游動(dòng)細(xì)胞中蝦青素含量低是因?yàn)樗暮铣伤俾蔬h(yuǎn)低于細(xì)胞的分裂速率［6］。所以，任何可限制細(xì)胞分裂的因素都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂速率下降，從而導(dǎo)致個(gè)體細(xì)胞內(nèi)蝦青素的快速累積。因此在紅球藻的培養(yǎng)中可著眼于游動(dòng)細(xì)胞活力的提升。

圖9　紅光與白光條件下添加CO2對(duì)細(xì)胞生產(chǎn)力的影響Fig. 9　The cell productivity under red and white light conditions with CO2bubbling in or not

圖10　添加CO2差異條件下培養(yǎng)液pH與藻細(xì)胞Fv/Fm變化Fig. 10　The variation of pH and Fv/Fmin different CO2condition

3.1紅光下半連續(xù)培養(yǎng)利于提升細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活力

光照影響雨生紅球藻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)紅，也是光生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)過(guò)程中需要考慮的關(guān)鍵因素之一。紅球藻細(xì)胞對(duì)光的變化異常敏感，不同波長(zhǎng)的光質(zhì)在生產(chǎn)兩個(gè)階段可能產(chǎn)生互逆的影響。綠色游動(dòng)細(xì)胞階段提供適宜光強(qiáng)的紅光，消除了白光環(huán)境下因短波長(zhǎng)光照對(duì)綠色游動(dòng)細(xì)胞造成的脅迫，有利于其細(xì)胞維持長(zhǎng)時(shí)間的綠色游動(dòng)狀態(tài)，維持高光合潛能以及增殖活力，從而有利于實(shí)施半連續(xù)培養(yǎng)方式。本研究結(jié)果顯示，批次培養(yǎng)下平臺(tái)期維持較長(zhǎng)時(shí)間，光合熒光參數(shù)顯示其細(xì)胞光合能力穩(wěn)定，中性脂沒(méi)有顯著累積。中性脂通常是細(xì)胞受到脅迫時(shí)大量累積［28］，說(shuō)明細(xì)胞沒(méi)有受到相關(guān)脅迫。但中性脂含量在增殖過(guò)程中的波動(dòng)與細(xì)胞色素組成變化是否有相關(guān)性值得深入研究。半連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)出較批次培養(yǎng)大。光合熒光參數(shù)在每次更新時(shí)能恢復(fù)至批次培養(yǎng)時(shí)的水平，同期中性脂相對(duì)高于批次培養(yǎng)組，但未超出初始狀態(tài)。在培養(yǎng)后期，細(xì)胞密度仍然穩(wěn)定時(shí)，批次培養(yǎng)的NPQ值顯著增加，顯示細(xì)胞出現(xiàn)自我保護(hù)的代謝。半連續(xù)培養(yǎng)NPQ后期也顯著提高，說(shuō)明此方式下細(xì)胞相應(yīng)的光保護(hù)代謝只是推遲但是仍然出現(xiàn)。Wang等［11］研究認(rèn)為，以已經(jīng)開(kāi)始脅迫保護(hù)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行脅迫轉(zhuǎn)紅，有利于保護(hù)更多的細(xì)胞不受損失并且能累積更大量的蝦青素。紅球藻增殖后的培養(yǎng)液中會(huì)累積抑制細(xì)胞進(jìn)一步增殖或抑制細(xì)胞活力的物質(zhì)。因此，生產(chǎn)工藝上，是長(zhǎng)期批次培養(yǎng)的綠色細(xì)胞還是半連續(xù)培養(yǎng)獲得的更多細(xì)胞更利于轉(zhuǎn)紅培養(yǎng)，尚待研究證明。

3.2補(bǔ)充CO2促進(jìn)雨生紅球藻生長(zhǎng)以及降低細(xì)胞粒徑

紅球藻培養(yǎng)過(guò)程中pH會(huì)不斷上升，常常達(dá)10.0以上。但大多數(shù)的研究顯示，紅球藻生長(zhǎng)的最適pH在中性偏堿的環(huán)境［29］。本研究無(wú)CO2添加組最高pH可達(dá)10.7，但細(xì)胞仍能增殖，光合熒光參數(shù)亦無(wú)顯著下降，說(shuō)明紅球藻對(duì)高pH環(huán)境有一定的耐受性，這與崔寶霞等［30］的研究結(jié)果相似。但是，單純調(diào)節(jié)pH變化對(duì)紅球藻增殖的影響不明顯，增殖過(guò)程中，通過(guò)酸堿調(diào)節(jié)pH在6.8—10.0，其增殖能力沒(méi)有顯著差異［13，14］。韋韜等［31］研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的CO2（600 cm3/m3）有利于綠色細(xì)胞光合作用的進(jìn)行，同時(shí)維持培養(yǎng)液的pH在合適的范圍，從而促進(jìn)紅球藻的快速生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，紅光下補(bǔ)充CO2不僅能使pH處于適宜范圍，還可以顯著影響細(xì)胞增殖和光合能力，并能降低細(xì)胞粒徑。

紅球藻細(xì)胞粒徑變化在生產(chǎn)工藝的改進(jìn)上可能有重要意義。在綠色細(xì)胞培養(yǎng)中，因細(xì)胞年齡、不同遮光等原因，造成一次培養(yǎng)物中不同的細(xì)胞所含細(xì)胞色素各異，形成細(xì)胞均質(zhì)性差異大，是紅球藻綠色細(xì)胞高密度增殖局限的重要原因。不同于其他微型藻類(lèi)，紅球藻群體中單細(xì)胞可獲得條件的優(yōu)化是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。紅球藻細(xì)胞具有特征性的透明質(zhì)套狀的細(xì)胞壁，該細(xì)胞壁與原生質(zhì)體之間的距離隨條件變化有明顯的差異。即使不考慮該特征與處于培養(yǎng)水體中細(xì)胞與細(xì)胞間的空間競(jìng)爭(zhēng)是否相關(guān)，其變化必然影響細(xì)胞的大小。相對(duì)而言，小粒徑細(xì)胞比大粒徑細(xì)胞更利于形成高密度且高活力細(xì)胞群體，從而為高質(zhì)高產(chǎn)的蝦青素提供細(xì)胞基礎(chǔ)。紅光下細(xì)胞粒徑與最大光合潛能（Fv/Fm）呈極其顯著的負(fù)相關(guān)。這說(shuō)明細(xì)胞粒徑越小細(xì)胞的光合潛能越大、細(xì)胞生產(chǎn)力越高。Hata等［32］在小體積培養(yǎng)（500 mL）過(guò)程中能達(dá)到6.8 cells/（mL·d）的生產(chǎn)力。Kaewpintong等［33］在氣升式光生物反應(yīng)器（3000 mL）中的生產(chǎn)力為5.52 cells/（mL·d）。本研究在紅光下添加CO2時(shí)，細(xì)胞生產(chǎn)力可達(dá)5—15 cells/（mL·d）。

在實(shí)際生產(chǎn)中，充氣是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但是充氣的強(qiáng)度控制很重要，以防止氣泡剪切力的影響。紅球藻對(duì)剪切力敏感，因此有研究者認(rèn)為氣升式光生物反應(yīng)器比機(jī)械攪動(dòng)的反應(yīng)器更利于細(xì)胞存活和增殖［34］。氣升式供氣的同時(shí)補(bǔ)充一定比例的CO2

［26］。本研究提供CO2的方式為晝開(kāi)夜關(guān)的細(xì)化的CO2，且為間歇式搖動(dòng)的靜置培養(yǎng)。在紅光下細(xì)胞能維持相對(duì)穩(wěn)定的綠色游動(dòng)細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞的均質(zhì)性好，在白天增殖pH顯著上升的情況下補(bǔ)充CO2，使細(xì)胞沒(méi)有被過(guò)分干擾的情況下均勻增殖，細(xì)胞的均質(zhì)性好。CO2的通入可使得培養(yǎng)液中的無(wú)機(jī)碳源更多的以藻類(lèi)光合作用易于吸收的自由CO2形式存在［35］，這一點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的最大光合潛能Fv/Fm得以體現(xiàn)，通氣組較不通氣組有顯著提升（P＜0.05）。同時(shí)，最大光合潛能Fv/Fm與細(xì)胞粒徑呈極其顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.01），即細(xì)胞粒徑越小細(xì)胞的光合作用效率越高。

蝦青素累積階段是營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫有利還是營(yíng)養(yǎng)鹽足夠有利，不同研究結(jié)果尚各執(zhí)一詞［13，14］。一方面是不同株造成的結(jié)果差異，另一方面也可能是還沒(méi)有抓住根本性的問(wèn)題：保持細(xì)胞的完整性與活力。氮營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏比高光強(qiáng)對(duì)蝦青素合成影響更大，因?yàn)槿钡辜?xì)胞停止分裂［36］。初始接種或規(guī)模生產(chǎn)上的細(xì)胞更新過(guò)程，都涉及到最適細(xì)胞密度與最適營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的關(guān)系問(wèn)題。雖然有高的細(xì)胞產(chǎn)出，但是過(guò)高的營(yíng)養(yǎng)鹽抑制初始增長(zhǎng)［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)低的初始密度組有高的細(xì)胞增殖能力以及高的光合能力，可能與單個(gè)細(xì)胞受光能力有關(guān)、細(xì)胞間相互遮光影響小。

綜合本研究結(jié)果顯示，在以培養(yǎng)綠色游動(dòng)細(xì)胞為目標(biāo)的培養(yǎng)階段提供紅色光照，可獲得延長(zhǎng)的平臺(tái)期，以有利于進(jìn)行半連續(xù)方式的更新培養(yǎng)，從而獲得更高活力的細(xì)胞與更高生物量。但是，部分更新培養(yǎng)數(shù)次后，細(xì)胞呈現(xiàn)變化，采用間斷式半連續(xù)培養(yǎng)方式可能更有利于提升細(xì)胞活力與產(chǎn)出。更新比例和更新次數(shù)尚有待于根據(jù)不同條件不同品系進(jìn)行針對(duì)性研究。

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EFFECTS OF CULTURE METHOD ON CELL PROLIFERATION AND CELL ACTIVITY OF HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS GROWING UNDER RED LIGHT

LUO Jie，WANG Jian-Yuan，ZHOU Cheng-Xu，YAN Xiao-Jun，XU Ji-Lin，LUO Qi-Jun，MA Bin and WU Xiao-Kai
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The current study investigated methods culturing green motile cells of Haematococcus pluvialis under red light on cell density，cell growth rate and cell activity. In red light，the stationary growth phase in batch culture maintained for long time，and the cell photosynthetic activity maintained stable high. There was no neutral lipid accumulation in the cell growth in red light. Biomass yields from a semi-continuous culture of 20% medium renew rate was 57% higher than those from the batch culture. The variation of nutrient absorption rate and chlorophyll fluorescence parameter showed that cellular stress regulation started earlier in batch culture than those in semi-continuous cultures. The cell growth rate and photosynthetic activity were negatively related to the initial cell density in a batch culture. Culture of lower initial density had higher growth rate and higher photosynthetic activity. The effects of CO2on the cultures under red light or under white light were conditionally dependent. Adding CO2increased maximum biomass by 54%. The growth rates increased as while，however，that in the red light was higher（0.223/d） than that in white light（0.198/d）. The pH values were not related with the light quality under both red light and white light，and pH decreased to the suitable level of pH 78. Chlorophyll parameter Fv/Fmsignificantly increased by red light with CO2addition while it is not mediated by white light. Cell size significantly decreased by red light with CO2addition while it was no regulated by white light. These results revealed that the method of intermittent semi-continuous culture for green motile cells of H. pluvialis had higher cell yield with high activity，which is a plausible strategy in astanxanthin industry.

Haematococcus pluvialis； green motile cell； red light； culture method

Q178.1+1

A

1000-3207（2016）05-1041-10

10.7541/2016.135

2016-03-14；

2016-06-24

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2015GA701001）； 海洋藥源生物種質(zhì)庫(kù)建設(shè)項(xiàng)目； 國(guó)家公益性行業(yè)（海洋）科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201105009）； 國(guó)家“萬(wàn)人計(jì)劃”（財(cái)教［2014］412號(hào)）資助 ［Supported by the National Spark Program of National Ministry of Science and Technology（No. 2015GA701001）； National Collection of Marine Organisms for Medicine Resources； National Marine Research Special Funds for Public Welfare Projects（No. 201105009）； National High-Level Personnel of Special Support Program（No. 2014-412）］

羅杰（1992—），男，安徽壽縣人； 碩士； 主要從事微藻生理生態(tài)研究。E-mail：luojie315@outlook.com

周成旭，副研究員； 主要從事微型藻類(lèi)的生物學(xué)、生理生態(tài)學(xué)、有害赤潮及生物質(zhì)應(yīng)用等研究。E-mail：zhouchengxu@nbu.edu.cn