基于普魯士藍(lán)-碳納米管-納米金復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建＊

冷鵬，趙媛，劉素

（1.山東城市建設(shè)職業(yè)學(xué)院，濟(jì)南 250103； 2.濟(jì)南大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，濟(jì)南 250022）

基于普魯士藍(lán)-碳納米管-納米金復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建＊

冷鵬1，趙媛2，劉素2

（1.山東城市建設(shè)職業(yè)學(xué)院，濟(jì)南 250103； 2.濟(jì)南大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，濟(jì)南 250022）

構(gòu)建一個基于普魯士藍(lán)-碳納米管-納米金復(fù)合物（PB-CNTs-CNPs）增效的新型免疫傳感器檢測大腸桿菌。普魯士藍(lán)-碳納米管-納米金復(fù)合物能夠增強(qiáng)電子的傳遞效率和電極的穩(wěn)定性。當(dāng)大腸桿菌抗存在時，辣根過氧化氫酶（HRP）標(biāo)記的大腸桿菌抗體也通過特異性作用結(jié)合到PB-CNTs-CNPs修飾的金電極表面，形成一個夾心型結(jié)構(gòu)。通過大腸桿菌抗體上標(biāo)記的HRP酶催化底夜中雙氧水的還原對大腸桿菌進(jìn)行定量。該傳感器具有很好的特異性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。在最優(yōu)條件下，大腸桿菌濃度在10～1×107cfu/mL的范圍內(nèi)與該傳感器的電流響應(yīng)I存在I=33.68 lgCE.coli+7.19的線性關(guān)系，檢出限為9.2 cfu/mL （S/N=3）。將該傳感器應(yīng)用于實(shí)際樣品中大腸桿菌的檢測，樣品加標(biāo)回收率為91.3%～103.0%，與平板計(jì)數(shù)法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較，結(jié)果具有高度一致性。

電化學(xué)免疫傳感器；普魯士藍(lán)；碳納米管；納米金；大腸桿菌檢測

大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，學(xué)名大腸希埃氏菌（E.coil），周身鞭毛，能運(yùn)動，無芽孢，在自然界中分布十分廣泛，尤其是在溫血動物的腸道和糞便中大量存在［1］。致病性大腸桿菌被嬰兒和幼畜（禽）攝入后可導(dǎo)致嚴(yán)重的腹瀉和敗血癥，如非致病性大腸桿菌進(jìn)入人體膽囊、膀胱等器官也可引起炎癥，因而對食品、藥品及飲用水中大腸桿菌菌群數(shù)進(jìn)行檢測是十分必要的［2］。傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的大腸桿菌鑒定方法是簡單的平板計(jì)數(shù)法，通常需要2～3天獲得檢測結(jié)果，費(fèi)時且不能進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)測［3］。因此一些新的技術(shù)，例如酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）［4］、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）［5］、蛋白微量分析［6］、石英晶體微天平（QCM）體系［7］、表面等離子體共振（SPR）［8］、流式細(xì)胞術(shù)（FC）［9］和化學(xué)發(fā)光（CL）用以發(fā)展快速、靈敏的大腸桿菌檢測方法，這些方法通常需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理，儀器和試劑相對昂貴，對實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)要求高。因此開發(fā)方便、高靈敏和低成本的檢測方法很有必要。

電化學(xué)方法具有超出其它分析技術(shù)的優(yōu)勢，例如高的可移植性和可負(fù)擔(dān)性、低功耗、快速的響應(yīng)和低成本，尤其基于納米材料檢測大腸桿菌的方法吸引了廣泛的關(guān)注［10］。納米材料是納米級結(jié)構(gòu)材料（nanometer material）的簡稱，大致可分為4類：納米粉末、納米纖維、納米膜和納米塊體。納米材料因其特殊的構(gòu)成而在光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)力學(xué)以及化學(xué)方面具有許多普通材料無法比擬的優(yōu)異特性［11］。碳納米管與C60同屬碳的同素異形體，內(nèi)徑可小至1 nm，外徑一般在幾納米至十幾納米之間，直徑與長度之比可達(dá)一百以上，屬于納米纖維，具有耐熱性、耐腐蝕性、導(dǎo)電性強(qiáng)等特點(diǎn)，有“未來的材料”之美稱，是典型的一維材料［12］。納米金屬與納米材料中的納米顆粒是最受關(guān)注的納米材料之一，可與多種生物大分子結(jié)合，且不影響其生物活性［13］。普魯士藍(lán)（Prussian blue）是一種深藍(lán)色的染料，具有電活性，因曾為德國前身普魯士軍隊(duì)制服的顏色而得名，別名滕氏藍(lán)、中國藍(lán)、亞鐵氰化鉀等［14］。

筆者制備了一個新型的電化學(xué)免疫傳感器，用于高靈敏高特異性的檢測大腸桿菌。該傳感器通過自組裝將抗體組裝到普魯士藍(lán)-碳納米管-納米金復(fù)合物（PB-CNTs-CNPs）修飾的電極上，在夾心識別后，大腸桿菌由抗體上修飾的HRP催化底液中化學(xué)反應(yīng)的信號進(jìn)行定量。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

高速離心機(jī)：TGL-16C型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

電化學(xué)工作站：VersaSTAT3型，美國阿美特克公司；

磁力攪拌器：MYP11-2型，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；

超凈工作臺：ZNC-1000/1500/1800型，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

電子天平：FA-B型，湖北好美佳儀器設(shè)備有限公司；

三電極系統(tǒng)：鉑絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，修飾后的玻碳電極為工作電極；

多壁碳納米管（AR，純度大于95%）、過氧化氫（AR，純度大于30%）、濃硫酸（AR，純度大于98%）、氯金酸（AR，HAuCl4溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）、乙醇（AR，純度大于99.7%）、對苯二酚（HQ）（AR，純度大于97%）、鐵氰化鉀［K3Fe（CN）6］（AR，純度大于99.9%）、三氯化鐵（AR，純度大于99.9%）、氯化鉀（AR，純度大于99.9%）、磷酸氫二鉀（AR，純度大于99.9%）、磷酸二氫鉀（AR，純度大于99.5%）、殼聚糖（黏度大于400 mPa·s）：阿拉?。ㄖ袊虾＃┯邢薰?；

大腸桿菌抗體：1 mg/mL，生工生物工程（上海）股份有限公司；

細(xì)菌學(xué)蛋白胨、細(xì)菌學(xué)瓊脂、細(xì)菌學(xué)酵母粉：青島日水生物技術(shù)有限公司；

磷酸緩沖液（PBS）：用磷酸氫二鉀（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鉀（NaH2PO4·2H2O）和NaCl配制；

牛奶：市售；

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)室用水為超純?nèi)ルx子水。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1多壁碳納米管的羧基化

稱取200 mg的多壁碳納米管（MCNTs）于燒杯中，加入160.0 mL的濃硫酸-濃硝酸混合液（3∶1）中，超聲與加熱攪拌交替進(jìn)行6 h（加熱需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行），直至混合液均勻。將制得液體倒入離心管，以10 000 r/min離心15 min后，倒去上清液加入去離子水水洗，繼續(xù)離心，直到上清液呈中性，然后置于烘箱中于70℃干燥2 h，放入冰箱中保存，備用。

1.2.2納米金的制備

將1 mL 1%的氯金酸溶液加入到100 mL去離子水中煮沸，將2.5 mL 1%的檸檬酸鈉溶液快速加入到回流的氯金酸溶液中，繼續(xù)回流0.5 h以上，直至溶液由淺黃色變?yōu)樯罴t色。液體均勻無沉淀代表制備成功，冷卻后放入冰箱中保存。

1.2.3普魯士藍(lán)-碳納米管-納米金復(fù)合物的制備

將4 mg羧基化的多壁碳納米管在超聲攪拌下分散到40.0 mL的0.01 mol/L FeCl3溶液中，加入FeCl3使其過量，邊攪拌邊將40.0 mL 0.01 mol/L的K3Fe（CN）6逐滴加入到FeCl3溶液中。將得到的溶液在10 000 r/min條件下不斷離心，倒去上清液，直到上清液呈無色狀態(tài)。沉淀物經(jīng)收集、干燥，分散到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的4.0 mL殼聚糖水溶液中，從而得到修飾PB-CNTs的氨基基團(tuán)，在10 000 r/min條件下離心去除剩余殼聚糖，將已完成氨基修飾的PB-CNTs在8.0 mL金膠體中，攪拌2 h，離心分離，把得到的納米復(fù)合材料分散到2.0 mL去離子水中，放入冰箱中保存。

1.2.4電極的預(yù)處理

將玻碳電極依次在0.10 μm和0.05 μm的Al2O3拋光布上拋光，用去離子水進(jìn)行沖洗。將其置于無水乙醇-水（1∶1）溶液中超聲清洗，去除表面沾附的顆粒；配制含0.2 mol/L KCl和5 mmol/L K3Fe（CN）6的溶液，以該溶液為底液，采用傳統(tǒng)三電極體系進(jìn)行循環(huán)伏安檢測，電位范圍：-0.2～0.6 V；掃描速率：50 mV/s；掃描圈數(shù)：3。其中3圈循環(huán)伏安曲線重合，氧化還原電位差小于85 mV，則電極處理成功。掃描后電極用水沖洗后妥善保存。

1.2.5傳感器界面的構(gòu)建

分子印跡傳感器的構(gòu)建如圖1所示。首先將新制備的普魯士藍(lán)-碳納米管-納米金復(fù)合物超聲處理50 min，然后移取10 μL復(fù)合物至處理過的電極表面，自然晾干2 h以上。向修飾第一層復(fù)合物的電極表面滴加10 μL大腸桿菌抗體，干燥1 h，滴加大腸桿菌菌液，孵育完全，滴加10 μL HRP標(biāo)記的大腸桿菌抗體，即得到目標(biāo)免疫傳感器。該傳感器產(chǎn)生信號的原理是利用抗體上標(biāo)記的HRP催化底夜中化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生信號。采用的構(gòu)建方式是夾心法，電極上大腸桿菌的量越多，則結(jié)合的HRP標(biāo)記的大腸桿菌抗體的量也越多，產(chǎn)生的信號越強(qiáng)，利用此原理對大腸桿菌進(jìn)行定量。

圖1　基于納米材料增效的大腸桿菌電化學(xué)夾心傳感器的構(gòu)建原理

1.2.6電化學(xué)測量

修飾電極的表征在含有5 mmol/L K3Fe（CN）6和0.2 mol/L KCl的水溶液中，通過循環(huán)伏安法（CV）完成。掃描速率：50 mV/s；電壓范圍：-0.2～0.6 V；其它實(shí)驗(yàn)通過差分脈沖伏安法完成，將修飾好的電極放入含3 mmol/L HQ和3 mmol/L H2O2的pH為7.5的PBS緩沖溶液中，電壓范圍：-0.17～0.17 V；掃描速率：5 mV/s。

2　結(jié)果與討論

2.1電極修飾過程的循環(huán)伏安表征

通過循環(huán)伏安法對傳感器的構(gòu)建過程進(jìn)行表征，見圖2。由圖2可知，由于普魯士藍(lán)-碳納米管-納米金可以促進(jìn)電子傳輸，曲線b的氧化還原峰電流響應(yīng)相比于曲線a裸電極的電流響應(yīng)有明顯的增加；曲線c與曲線b相比，電信號顯著下降，這是因?yàn)榇蠓肿拥鞍鬃钄嗔穗姌O表面的電子傳遞；曲線d和曲線e分別是修飾了大腸桿菌和HRP標(biāo)記抗體后的循環(huán)伏安曲線，電信號陸續(xù)下降，這是由于這些大分子物質(zhì)進(jìn)一步阻礙了電子傳遞，進(jìn)而降低了電極的電流響應(yīng)。同時這一現(xiàn)象說明有大分子物質(zhì)修飾在電極上，使得電子傳遞速率降低，表明大腸桿菌和HRP標(biāo)記的抗體成功的特異性結(jié)合到電極表面。

圖2　電極修飾上各種物質(zhì)后的循環(huán)伏安圖

2.2反應(yīng)底夜pH值對傳感器電流響應(yīng)的評估

分別配制pH值為6，6.5，7，7.5，8的PBS緩沖溶液，分別加入10 mg HQ和1 μL H2O2，超聲10 min使其混合均勻，用差分脈沖伏安法檢測，通過電流響應(yīng)的變化來觀察記錄所構(gòu)建的免疫傳感器在不同pH值下的性能，如圖3所示。

圖3　反應(yīng)底夜pH對傳感器電流響應(yīng)的影響。

由圖3可知，在pH小于7.5時，隨著PBS溶液pH的增加，電流相應(yīng)也逐漸增大，但當(dāng)pH高于7.5時，電流響應(yīng)開始下降。因此選擇7.5作為該大腸桿菌傳感器的最佳pH值。

2.3大腸桿菌孵育時間的優(yōu)化

構(gòu)建的免疫傳感器在不同孵育時間下的性能如圖4所示，實(shí)驗(yàn)過程中除孵育時間分別為10，20，30，40，50，60 min外其它條件相同。由圖4可以發(fā)現(xiàn)，電流響應(yīng)隨時間的增加而增大，一直到50 min表現(xiàn)下降趨勢。結(jié)果表明，該免疫傳感器在孵育時間為50 min時可獲得最佳性能。

圖4　大腸桿菌孵育時間對電流響應(yīng)值的影響

2.4大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

為了研究構(gòu)建的電化學(xué)傳感器的分析性能，利用差分脈沖伏安法對其線性檢測范圍和檢出限（LOD）進(jìn)行測定。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測定修飾不同濃度的大腸桿菌溶液時免疫傳感器的電化學(xué)響應(yīng)。用構(gòu)建的傳感器，大腸桿菌的濃度與響應(yīng)電流存在I=33.68 lgCE.coli+7.19的線性關(guān)系，線性范圍10～1×107cfu/mL。檢出限的計(jì)算方法：測定空白時的電流響應(yīng)為39.5 μA，加上3倍的3次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到39.65 μA，將這一數(shù)字帶入擬合的公式中，求得檢出限為9.2 cfu/mL。

2.5干擾試驗(yàn)

以大腸桿菌（1.0×104cfu/mL）溶液為對比，干擾物濃度大于大腸桿菌菌液濃度，分別為1.0×105cfu/mL的枯草桿菌、酵母菌、放線桿菌，按照相同的修飾過程構(gòu)建免疫傳感器，考察傳感器的響應(yīng)電流，結(jié)果如圖5所示。

圖5　大腸桿菌的干擾試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在遠(yuǎn)大于大腸桿菌濃度的干擾物存在時，其產(chǎn)生的電流與空白相差無幾，表明該免疫傳感器具有良好的選擇性。

2.6傳感器的再現(xiàn)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性研究

對傳感器的再現(xiàn)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。最優(yōu)條件下（pH 7.5，大腸桿菌孵育時間為50 min）組建5支傳感器，每支電極只檢測一次濃度為1.0×104cfu/mL 的大腸桿菌溶液，得到電流響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%，表明傳感器具有良好的再現(xiàn)性。組建1支電化學(xué)傳感器，該傳感器檢測1.0×104cfu/mL大腸桿菌菌液5次，得到電流響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%。結(jié)果說明構(gòu)建的傳感器可以實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌的重復(fù)性檢測。制備3支傳感器，室溫保存2周，檢測傳感器的電流響應(yīng)，得到的電流響應(yīng)為原來的92%，說明傳感器的穩(wěn)定性良好。

表1　傳感器的再現(xiàn)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7比對試驗(yàn)

使用實(shí)際樣品對夾心式電化學(xué)免疫傳感器測定大腸桿菌的可行性進(jìn)行了測試。不同濃度的大腸桿菌菌液被加入到樣本中，樣本除了用緩沖溶液稀釋外不做其它預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)用經(jīng)典的平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)了樣本中的大腸桿菌數(shù)量，并與電化學(xué)免疫傳感器所獲得的結(jié)果進(jìn)行了對比，結(jié)果見表2。

表2　實(shí)際樣品中大腸桿菌的檢測結(jié)果

從表2中可以看出，夾心式電化學(xué)免疫傳感器獲得的結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果展現(xiàn)了良好的的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了該方法的可行性。

3　結(jié)語

利用夾心式免疫傳感器與納米材料的優(yōu)良特性，構(gòu)建了一種可以靈敏檢測大腸桿菌的電化學(xué)傳感器。修飾在電極表面的普魯士藍(lán)-碳納米管-納米金復(fù)合物可以有效結(jié)合大腸桿菌抗體，增加大腸桿菌吸附量，進(jìn)而提高電流響應(yīng)，這使得所構(gòu)建的電化學(xué)傳感器的靈敏度有了大幅度的提高?；诿庖叻治鲈淼膫鞲衅鞯膴A心結(jié)構(gòu)，賦予傳感器高度的特異性。使用上述方法和材料構(gòu)建的傳感器不僅線性范圍寬、檢測限低，還具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性和高回收率，在本實(shí)驗(yàn)中已成功運(yùn)用到實(shí)際樣本的檢測中。本傳感器具有良好的可靠性，在實(shí)際檢測中具有廣闊的前景。

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“十二五”期間質(zhì)檢儀器技術(shù)攻關(guān)取得重大突破

2016年質(zhì)檢科技大會不久前在北京召開，會議提出，到2020年要實(shí)現(xiàn)國家質(zhì)量技術(shù)基礎(chǔ)總體水平與國際“并跑”、部分技術(shù)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)“領(lǐng)跑”的發(fā)展目標(biāo)。

國家質(zhì)檢總局副局長孫大偉在會上介紹，“十二五”期間我國質(zhì)量技術(shù)攻關(guān)取得重大突破：獲國際互認(rèn)的國家校準(zhǔn)和測量能力1 266項(xiàng)，位居世界第四；研制國際標(biāo)準(zhǔn)224項(xiàng)，國家標(biāo)準(zhǔn)1 299項(xiàng)；突破了碳排放和碳減排等認(rèn)證認(rèn)可技術(shù)；高等級生物安全實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到國際先進(jìn)水平；研發(fā)3 000余種快速高通量檢測鑒定技術(shù)、試劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，茶葉中653種農(nóng)藥多殘留和化學(xué)污染物檢測方法通過11個國家和地區(qū)30個實(shí)驗(yàn)室協(xié)同驗(yàn)證；大型承壓設(shè)備不停機(jī)電磁無損檢測技術(shù)達(dá)到國際領(lǐng)先水平；攻克特種設(shè)備長周期安全運(yùn)行關(guān)鍵技術(shù)260多項(xiàng)，研制儀器裝置43臺套。

“十三五”期間，質(zhì)檢科技將在“十二五”基礎(chǔ)上，圍繞建設(shè)質(zhì)量強(qiáng)國，實(shí)現(xiàn)國家質(zhì)量技術(shù)基礎(chǔ)總體水平與國際“并跑”、部分技術(shù)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)“領(lǐng)跑”的發(fā)展目標(biāo)。具體而言，要建立新一代國家計(jì)量基標(biāo)準(zhǔn)體系，部分成果達(dá)到國際領(lǐng)先水平；研制和參與制訂的國際標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量要大幅增加；重點(diǎn)領(lǐng)域認(rèn)證認(rèn)可技術(shù)方案達(dá)到國際或區(qū)域領(lǐng)先；研究一批檢驗(yàn)檢測檢疫核心關(guān)鍵技術(shù)，實(shí)現(xiàn)質(zhì)檢技術(shù)群體性國際突破。

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2016首批創(chuàng)新基金驗(yàn)收項(xiàng)目名單公布

2016年4月12日，2016年第一批科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目驗(yàn)收合格名單公布，本次共計(jì)1 584個項(xiàng)目通過驗(yàn)收。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，本次合格名單中共有57個儀器儀表、試劑耗材及相關(guān)項(xiàng)目，涉及類別有分析儀器、環(huán)境監(jiān)測儀器、物性測試儀器、醫(yī)療設(shè)備及行業(yè)專用儀器儀表等。

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Electrochemical Immunosensor Based on Prussian Blue-Carbon Nanotuves-Gold Nanoparticles Composite for E.coli Detection

Leng Peng1， Zhao Yuan2， Liu Su2
（1. Shangdong Urban Construction Vocational College， Jinan 250103， China；2. School of Resources and Environment， University of Jinan， Jinan 250022， China）

A novel E.coli immunosensor based on Prussian blue-carbon nanotuves-gold nanoparticles （PB-CNTs-CNPs） composite was developed. PB-CNTs-CNPs composites were used to enhance the electroactivity and stability of the electrode. In the presence of target E.coli，horseradish peroxidase（HRP）-labeled antibody was captured on the electrode surface to form a sandwich-type system via the specific identification. As a result，E.coli detection was realized by outputting a redox current from electro-reduction of hydrogen peroxide reaction catalyzed by HRP. This sensor also showed good specificity， repeatability and stability. Under optimal conditions， the concentration of E.coli in the range of 10-1×107cfu/mL and the current response I of the immunosensor had linear relation with the linear regression equation of I=33.68 lgCE.col+7.19， the detection limit was 9.2 cfu/mL （S/N=3）. The developed immunosensor was applied to the detection of E.coli in real samples. It was found that the recovery of the biosensor was in the range of 91.3%-103.0%. These data obtained using this biosensor strategy is in good agreement with those obtained via the plate count method.

electrochemical immunosensor； Prussian blue； carbon nanotubes； gold nanoparticles； E.coli detection

O657

A

1008-6145（2016）03-0110-05

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.03.029

*國家863項(xiàng)目（2012AA101604）

聯(lián)系人：劉素；E-mail∶ stu_lius@ujn.edu.cn

2016-03-05