陳芳+王倩

[摘要] 目的 研究脂氧素A4及其受體對大鼠急性肺損傷Na+-K+-ATP酶的影響及機制。 方法 將大鼠隨機分為7組：①對照組；②油酸（OA）組；③油酸+脂氧素A4（OA+LX）組；④OA+Alcohol組；⑤油酸+BML-111組（OA+BML-111組）；⑥油酸+脂氧素A4+BOC-2（OA+LX+BOC-2）組；⑦OA+DMSO組。機械通氣1 h后處死，取肺組織測定Na+-K+-ATP酶α1、β1亞基蛋白表達和Na+-K+-ATP酶活性。 結果 與OA組比較，OA+LX組和OA+BML-111組肺組織Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達明顯增高（P<0.05），Na+-K+-ATP酶活性明顯增強（P<0.05）；與OA+LX組比較，BOC-2抑制Na+-K+-ATP酶的活性（P<0.01）。 結論 脂氧素通過上調Na+-K+-ATP酶蛋白表達及活性減輕油酸誘導的大鼠急性肺損傷，其作用機制與脂氧素受體（ALX）相關。

[關鍵詞] Na+-K+-ATP酶；急性肺損傷；脂氧素；脂氧素受體

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）23-0021-05

[Abstract] Objective To study the effect of lipoxin A4 and its receptor on Na+-K+-ATPase in acute lung injury. Methods SD rats were divided randomly into seven groups： ①control group； ②OA group； ③OA+LX group； ④OA+Alcohol group； ⑤OA+BML-111 group； ⑥OA+LX+BOC-2 group； ⑦OA+DMSO group. After 1 h of mechanical ventilation， lung samples were harvested. The protein of lung tissue samples was isolated to measure Na+-K+-ATPase protein expression and Na+-K+-ATPase activity. Results Compared with OA group， Na+-K+-ATPase β1 subunit protein expression and Na+-K+-ATPase activity were significantly increased in OA+LX group and OA+BML-111 group. Compared with OA+LX group， the beneficial effects of lipoxinA4 were abrogated by BOC-2（P<0.01）. Conclusion Lipoxin can up-regulated Na+-K+-ATPase β1 subunit protein expression and Na+-K+-ATPase activity in acute lung injury， and its mechanism is through ALX cGMP.

[Key words] Na+-K+-ATPase； Acute lung injury； Lipoxin； Lipoxin receptor

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）是臨床常見的急危重癥，病死率高達50%[1-3]。其主要病理變化為肺組織大量炎性浸潤和肺泡-毛細血管屏障損傷引起的肺水清除障礙、肺水積聚。肺泡內水腫液的及時主動清除是治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征的關鍵措施[4]。Na+-K+-ATP酶在水腫液主動清除過程中具有至關重要的作用[5-9]。肺泡Ⅱ型上皮細胞基底膜Na+-K+-ATP酶將細胞內Na+主動轉運至肺間質，形成Na+濃度滲透梯度，進而產生肺泡腔內液體重吸收。另外，研究發(fā)現(xiàn)，Na+-K+-ATP酶參與形成和維持肺泡上皮的緊密連接，從而影響肺泡上皮細胞的屏障功能[10-13]。因此，該酶功能的變化和調節(jié)對肺水的清除起著至關重要的作用。本實驗研究促炎癥消退介質脂氧素對大鼠急性肺損傷肺組織Na+-K+-ATP酶的調控及可能機制，為治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征提供新的思路和實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物

SPF級健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠56只，體重200～250 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供（動物許可證：X1004258）。

1.2 主要試劑與儀器

脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）購自美國 Cayman，脂氧素A4受體激動劑（BML-111）和脂氧素A4受體抑制劑（BOC-2）均購自美國Biomol-Enzo Life Sciences，抗Na+-K+-ATP酶α1和β1抗體購自美國Abcam公司，油酸購自美國Sigma公司。小型動物呼吸機TKF-200c為江西麻醉呼吸設備公司，蛋白電泳系統(tǒng)為美國BioRAD，凝膠成像分析系統(tǒng)為英國的GDS 8000。

1.3 油酸損傷模型的建立

取SD雄性大鼠，戊巴比妥鈉麻醉后行氣管插管，機械通氣。經股靜脈分別注射生理鹽水或純油酸0.03 mL/kg。100%氧氣機械通氣1 h后，肺組織HE染色，透射電鏡下觀察。

1.4 動物分組及給藥

雄性SD大鼠隨機分為7組，每組8只：①空白對照組：股靜脈注入等體積的0.9%生理鹽水；②油酸組（oleic acid group，OA 組）：股靜脈注入0.03 mL/kg油酸；③油酸+脂氧素A4組（oleic acid+lipoxin group，OA+LX組）：股靜脈注入0.03 mL/kg油酸形成急性肺損傷10 min后，經股靜脈注入脂氧素A4 2 μg/kg；④溶劑對照組（OA+Alcohol組）：股靜脈注入0.03 mL/kg油酸10 min，乙醇（Alcohol，脂氧素A4的溶劑）20 μL/kg經股靜脈注入；⑤油酸+BML-111組（OA+BML-111組）：0.03 mL/kg油酸刺激10 min后，BML-111（1 mg/kg，脂氧素A4受體激動劑）股靜脈注入；⑥油酸+脂氧素A4+BOC-2組（OA+LX+BOC-2組）：股靜脈注射0.03 mL/kg油酸與2 μg/kg脂氧素A4后，BOC-2（600 ng/kg）經股靜脈注射；⑦溶劑對照組（OA+DMSO組）：股靜脈注入0.03 mL/kg油酸10 min，經股靜脈注入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（BML-111和BOC-2的溶劑）。大鼠機械通氣1 h，腹主動脈放血處死，分離肺組織置液氮中速凍，然后-80℃保存。

1.5 檢測Na+-K+-ATP酶α1、β1亞基蛋白表達

肺組織勻漿后提取蛋白并定量，加蛋白上樣緩沖液，煮沸后保存。加入SDS-PAGE膠孔中進行電泳、轉膜、封閉。最后加入抗Na+-K+-ATP酶α1和β1抗體（1∶1000），4℃過夜；第2天洗膜，加入二抗（1∶5000），室溫孵育1 h；洗滌，ECL顯影、曝光。

1.6 Na+-K+-ATP酶活性檢測

ATP酶分解ATP為ADP、AMP和Pi，通過測定Pi的量判斷ATP酶的活性。ATP酶活性單位以每小時每毫克蛋白分解ATP產生1 mmol Pi的量定義為一個ATP酶活力單位。按微量Na+-K+-ATP酶試劑盒（南京建成）說明書進行測定。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組樣本比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 油酸肺損傷模型建立

對照組肺組織結構清楚，支氣管黏膜上皮排列整齊，肺泡壁無明顯增厚，肺泡腔干凈、無明顯滲出，而油酸（OA）組肺組織充血明顯，肺泡間質有炎性浸潤，肺泡壁增寬，肺泡腔內可見出血和滲出（封三圖4）。

2.2 脂氧素A4對油酸誘導急性肺損傷大鼠Na+-K+-ATP酶的影響

與對照組比較，OA組Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達明顯增高（P<0.05）；與OA組和OA+Alcohol組比較，油酸+脂氧素組（OA+LX）Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達明顯增高（P<0.05）；OA組、OA+Alcohol組和油酸+脂氧素組（OA+LX）Na+-K+-ATP酶α1亞基蛋白表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖1A）。

與對照組比較，OA組Na+-K+-ATP酶活性增強（P<0.05）；與OA組和OA+Alcohol組比較，油酸+脂氧素組（OA+LX）Na+-K+-ATP酶活性顯著增強（P<0.01）（圖1B）。

2.3 BML-111 對油酸誘導急性肺損傷大鼠Na+-K+-ATP酶的影響

與空白對照組比較，OA組Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達明顯增高（P<0.05）；與OA組和OA+DMSO組比較，油酸+BML-111組Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達明顯增高（P<0.05）；OA組、OA+DMSO組、油酸+BML-111組Na+-K+-ATP酶α1亞基蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

與空白對照組比較，OA組Na+-K+-ATP酶活性增強（P<0.05）；與OA組和OA+DMSO組比較，油酸+BML-111組Na+-K+-ATP酶活性顯著增強（P<0.05）。

2.4 BOC-2 對油酸誘導急性肺損傷大鼠Na+-K+-ATP酶活性的影響

與OA組比較，油酸+脂氧素組Na+-K+-ATP酶活性增強（P<0.01）；與油酸+脂氧素組相比，BOC-2抑制Na+-K+-ATP酶的活性（P<0.01）。

3 討論

ALI/ARDS是一種急性呼吸衰竭綜合征，雖然醫(yī)療條件和技術不斷發(fā)展，但其病死率仍然極高[14，15]。學者們一直在探索尋找新的治療ALI/ARDS的策略和方法。肺水腫是內毒素性肺損傷并發(fā)急性呼吸功能衰竭的主要病理基礎，肺泡水腫液的及時主動清除對急性肺損傷的預后有重要影響。Na+-K+-ATP酶是主要位于細胞膜上的跨膜離子轉運蛋白，具有維持細胞內外鈉鉀濃度梯度作用，是促進肺水沿著滲透梯度重吸收的關鍵。研究發(fā)現(xiàn)，Na+-K+-ATP酶主要由α亞基和β亞基構成。α亞基為催化亞基，主要通過水解ATP提供能量完成細胞內Na+和細胞外K+交換，β亞基為調節(jié)亞基，控制酶組裝和鑲嵌到質膜[16]，并維持細胞屏障功能，在肺水腫形成和消退過程中具有重要作用。

脂氧素（lipoxins，LXs）為花生四烯酸（arachidonic acid，AA）脂加氧酶（lipoxygenase）的代謝產物，作為炎癥消退過程中產生的最重要的內源性抗炎促消退介質，脂氧素抑制中性粒細胞的趨化；調控炎癥因子的平衡；促進損傷組織的修復，防止其纖維化；促進中性粒細胞的凋亡及巨噬細胞的吞噬，因而稱為炎癥反應的“剎車信號”[15，17]。脂氧素已被多種實驗模型證實具有特異性肺保護作用，能夠減輕肺水腫，修復上皮細胞屏障功能[15，17，18]。作為重要的內源性促消退介質，脂氧素主要是與其受體（formyl peptide receptor-like 2，F(xiàn)PRL2/ALX）結合，從而對多種炎癥性疾病的預后產生影響。

我們前期的研究已經證實，在內毒素性肺泡Ⅱ型上皮細胞模型中，LXA4可以上調Na+-K+-ATP酶的mRNA表達和酶活性，并證實在肺組織存在LXA4受體ALX表達[19]。本實驗則建立肺損傷動物模型，研究LXA4及其受體激動劑和受體抑制劑對內毒素性肺損傷Na+-K+-ATP酶的影響，從而進一步探討LXA4促進肺水吸收的機制。

本實驗發(fā)現(xiàn)，在油酸誘導的急性肺損傷模型中，脂氧素受體激動劑（BLM-111）與脂氧素一樣，具有一定的肺保護作用，都能提高Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達和Na+-K+-ATP酶活性。有學者研究證實，BLM-111對出血性休克和機械損傷性肺損傷也具有促炎癥消退作用[20，21]。Tang M等[14]研究發(fā)現(xiàn)，BLM-111可以減輕內毒素性肺損傷，保護細胞屏障功能。但這一作用被脂氧素受體抑制劑（BOC-2）拮抗，提示脂氧素A4對Na+-K+-ATP酶的作用是通過脂氧素A4受體（ALX）介導的。目前發(fā)現(xiàn)的脂氧素受體主要有ALX、peptido-LT receptors（CysLTR1）和核受體AhR。ALX 是脂氧素信號通路中首先被鑒別并克隆的G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors，GPCR）。

本實驗證明脂氧素A4及其受體激動劑能夠上調油酸誘導的急性肺損傷Na+-K+-ATP酶蛋白的表達和酶活性，從而促進肺水清除；脂氧素A4 的上述作用是通過與其受體（ALX）結合發(fā)揮作用的。我們的研究進一步闡明了脂氧素A4及其受體對大鼠急性肺損傷Na+-K+-ATP酶的作用及促進肺水重吸收的機制，為治療ARDS 提供新的策略和依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Skou JC. Nobel lecture：The identification of the sodium pump[J]. Biosci Rep，1998，18：155-169.

[2] Blanco G，Mercer RW. Isozymes of the Na-K-ATPase：Heterogeneity in structure，diversity in function[J]. Am J Physiol Renal Physiol，1998，275：F633-F650.

[3] Wang CY，Calfee CS，Paul DW，et al. One-year mortality and predictors of death among hospital survivors of acute respiratory distress syndrome[J]. Intensive Care Med，2014， 40：388.

[4] Matthay MA，Clerici C，Saumon G. Invited review：Active fluid clearance from the distal air spaces of the lung[J]. J Appl Physiol，2002，93：1533-1541.

[5] Mobasheri A，Avila A，Cozar I，et al. Na，K ATPase isozyme diversity：Comparative biochemistry and physiological implications of novel functional interactions[J]. Biosci Rep，2000，20：51-91.

[6] McDonough A，Geering K，F(xiàn)arley R. The sodium pump needs its subunit[J]. FASEB J，1990，4：1598-1605.

[7] Mutlu GM，Sznajder JI. Beta（2）-agonists for treatment of pulmonary edema：Ready for clinical studies[J]. Crit Care Med，2004，32（7）：1607-1608.

[8] Dada LA，Sznajder JI. Mechanisms of pulmonary edema clearance during acute hypoxemic respiratory failure：Role of the Na，K-ATPase[J]. Crit Care Med，2003，31（4 Suppl）：S248-252.

[9] Vadász I，Raviv S，Sznajder JI. Alveolar epithelium and Na，K-ATPase in acute lung injury[J]. Intensive Care Med，2007，33（7）：1243-1251.

[10] Rajasekaran SA，Hu J，Gopal J，et al. Na，K-ATPase inhibition alters tight junction structure and permeability in human retinal pigment epithelial cells[J]. Am J Physiol Cell Physiol，2003，284：C1497-C1507.

[11] Rajasekaran AK，Rajasekaran SA. Role of Na-K-ATPase in the assembly of tight junctions[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2003，285：F388-F396.

[12] Geering K. Functional roles of Na，K-ATPase subunits[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens，2008，17（5）：526-532.

[13] Tsushima K，King LS，Aggarwal NR，et al. Acute lung injury review[J]. Intern Med，2009，48（9）：621-630.

[14] Tang M，Chen L，Li B，et al. BML-111 attenuates acute lung injury in endotoxemic mice[J]. Journal of Surgical Research，2016，（9）：619-630.

[15] Cheng X，He SQ，Yuan J，et al. Lipoxin A4 attenuates LPS-induced mouse acute lung injuryvia Nrf2-mediated E-cadherin expression inairway epithelial cells[J]. Free Radical Biologyand Medicine，2016，（1）：52-66.

[16] Chiang N，Serhan CN，Dahlen SE，et al. The lipoxin receptor ALX：Potent ligand-specific and stereoselective actions in vivo[J]. Pharmacol Rev，2006，58：463-487.

[17] Qi W，Li H，Cai XH，et al. Lipoxin A4 activates alveolar epithelial sodium channel gamma via the microRNA-21/PTEN/AKT pathway in lipopolysaccharide-induced inflammatory lung injury[J]. Laboratory Investigation，2015， 95：1258-1268.

[18] Higgins G，F(xiàn)ustero Torre C，Tyrrell J，et al. Lipoxin A4 prevents tight junction disruption and delays the colonization of cystic fibrosis bronchial epithelial cells by Pseudomonas aeruginosa[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2016，310（11）：L1053-1061.

[19] 陳芳，李茹，李林艷，等. 脂氧素A4對內毒素攻擊的肺泡Ⅱ型上皮細胞Na+-K+-ATP酶的影響[J]. 中華急診醫(yī)學雜志，2010，19（12）：1260-1274.

[20] Gong J，Guo S，Li HB，et al. BML-111，a lipoxin receptor agonist，protects haemorrhagic shockinduced acute lung injury in rats[J]. Resuscitation，2012，83：907.

[21] Li H，Wu Z，F(xiàn)eng D，et al. BML-111，a lipoxin receptor agonist，attenuates ventilator-induced lung injury in rats[J]. Shock，2014，41（4）：311-316.

（收稿日期：2016-05-28）