Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia 雜種回交后代中篩選抗黑脛病異源染色體植株初報(bào)

黨江波，梁國(guó)魯，郭啟高，向素瓊，孫海艷，何橋，楊超，陳益銀

1 西南大學(xué)，園藝園林學(xué)院，重慶市北碚區(qū)天生路2號(hào) 400716；2 中國(guó)煙草總公司重慶市公司，煙草研究所，重慶市北碚區(qū)天生路2號(hào) 400716

Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia雜種回交后代中篩選抗黑脛病異源染色體植株初報(bào)

黨江波1，梁國(guó)魯1，郭啟高1，向素瓊1，孫海艷1，何橋1，楊超2，陳益銀2

1 西南大學(xué)，園藝園林學(xué)院，重慶市北碚區(qū)天生路2號(hào) 400716；2 中國(guó)煙草總公司重慶市公司，煙草研究所，重慶市北碚區(qū)天生路2號(hào) 400716

為從Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia雜種（2n=58）回交N. tabacum的后代中篩選對(duì)黑脛病具有較強(qiáng)抗性的植株，利用離體葉片侵染法對(duì)存活的120株后代植株進(jìn)行了初步篩選。篩選分為兩次，第1次為初選，對(duì)第1次接種后不發(fā)病和發(fā)病較輕的植株第2次接種進(jìn)行復(fù)選，對(duì)經(jīng)第2次接種后葉片不發(fā)病和發(fā)病較輕的植株進(jìn)行基因組原位雜交（GISH）分析。結(jié)果顯示：第1次接種后5株植株的葉片不發(fā)病和8株植株的葉片發(fā)病較輕；第2次接種后4株植株的葉片不發(fā)病，1株植株的葉片發(fā)病較輕。GISH鑒定結(jié)果顯示：第2次接種后4株葉片不發(fā)病的植株攜帶1-4條N. plumbaginifolia染色體，葉片發(fā)病較輕植株則未見(jiàn)N. plumbaginifolia染色體，攜帶1條外源染色體植株的染色體數(shù)目為48。對(duì)這5株材料的離體葉片接種病原菌以對(duì)其離體葉片的黑脛病抗性進(jìn)行再次鑒定，結(jié)果與復(fù)選時(shí)所得結(jié)果相近。綜上所述，自Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia雜種回交一代（BC1）中篩選獲得了4株葉片對(duì)黑脛病具有較強(qiáng)抗性的異源染色體植株，其中一株可能為異源單體代換植株。

普通煙草；N. plumbaginifolia；離體葉片；黑脛病抗性；異源單體代換系

遠(yuǎn)緣雜交作為作物品種改良的重要途徑之一，在作物育種中占有極為重要的地位[1]。遠(yuǎn)緣雜交的一般程序可以歸結(jié)為：雜交獲得雙單倍體、雙單倍體經(jīng)染色體加倍獲得雙二倍體，雙二倍體回交獲得倍半二倍體、倍半二倍體回交獲得異源單體附加/代換系、異源單體附加/代換系經(jīng)誘導(dǎo)獲得異源易位系、雜交或回交獲得穩(wěn)定遺傳的異源易位系[1]。其中異源染色體植株是遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中極為重要的中間材料，在遠(yuǎn)緣雜交中常以構(gòu)建異源單體附加/代換系等為遠(yuǎn)緣雜交取得重要進(jìn)展的標(biāo)志。目前在眾多作物的遠(yuǎn)緣雜交育種中獲得了異源單體植株，其中對(duì)小麥[2]、水稻[3]、棉花[4]、油菜[5]等的報(bào)道較多。煙草遠(yuǎn)緣雜交雖然開(kāi)展較早，也取得了較多成就，但是一般多以性狀為追蹤進(jìn)行新材料的選育，而細(xì)胞遺傳學(xué)研究則較少。因此在煙草中較少有異源單體附加材料的報(bào)道，在煙草屬植物中也較少見(jiàn)報(bào)道[6-7]。

黑脛病是烤煙生產(chǎn)中具有毀滅性的重大病害之一，歷年來(lái)給煙葉生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失[8]。煙草屬中眾多野生種對(duì)黑脛病具有較強(qiáng)的抗性，其中N.plumbaginifolia為較早應(yīng)用于煙草抗黑脛病的種質(zhì)之一[9-11]。雖然利用N. plumbaginifolia育成了一些抗黑脛病材料，但在我國(guó)煙草生產(chǎn)中未見(jiàn)大規(guī)模應(yīng)用。此外，對(duì)N. plumbaginifolia及其衍生材料的相關(guān)研究有限，其眾多特性鮮見(jiàn)介紹[12-13]。尤其是對(duì)抗黑脛病育種有重要意義的異源單體附加/代換系類材料報(bào)道更少[14]。

研究小組在利用N. plumbaginifolia進(jìn)行烤煙抗黑脛病育種研究的實(shí)踐中，首先通過(guò)云煙87八倍體（2n=8x=96） 與N. plumbaginifolia（2n=2x=20） 雜交獲得了種間雜種（2n=58），并已證實(shí)其基因組中攜帶10條來(lái)自N. plumbaginifolia的染色體，經(jīng)離體接種病原菌，該雜種葉片及莖段對(duì)黑脛病均有較強(qiáng)抗性，與N. plumbaginifolia相近。該雜種與云煙87四倍體回交獲得了大量后代。經(jīng)對(duì)離體葉片接種黑脛病病原菌，于這些回交后代中篩選獲得少量葉片未見(jiàn)發(fā)病的材料，并對(duì)這些葉片不發(fā)病及發(fā)病較輕的材料進(jìn)行了離體葉片抗病能力的第2次檢測(cè)及基因組原位雜交分析，證實(shí)葉片未見(jiàn)發(fā)病的植株基因組中均攜帶來(lái)自N. plumbaginifolia的染色體。為后續(xù)對(duì)這些材料的進(jìn)一步鑒定及應(yīng)用提供重要數(shù)據(jù)，也期供煙草抗病遠(yuǎn)緣雜交育種提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料為云煙87八倍體與N. plumbaginifolia間的雜種（2n=58）與云煙87四倍體（2n=4x=48）回交所得。

病原菌：煙草黑脛病病原菌寄生疫霉煙草致病型（Phytophthora parasiticavarnicotianae）由西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院李振輪教授贈(zèng)送，分離自重慶市奉節(jié)縣。

1.2 方法

1.2.1 植物材料準(zhǔn)備

獲得的回交種子播種于細(xì)土中，保濕，萌發(fā)生長(zhǎng)至3～5葉時(shí)，移栽至7 cm×9 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，共計(jì)移栽200株，待長(zhǎng)至7葉期時(shí)開(kāi)始取葉片離體接種病原菌液。

1.2.2 病原菌培養(yǎng)及接種液制備

煙草疫霉菌采用燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)。孢子誘導(dǎo)采用KNO3溶液誘導(dǎo)的方法[15]，將培養(yǎng)2 周以上的菌絲挑入0.1%的KNO3溶液中（每個(gè)直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中的菌絲轉(zhuǎn)入20 mL KNO3溶液中），培養(yǎng)3 d后，經(jīng)4℃處理40 min后取出，組織破碎儀打斷菌絲，25℃放置20 min后加入1%葡萄糖接種。

1.2.3 離體葉片接種病原菌

接種分為3次，第1次接種為初選：選取7葉期植株葉片進(jìn)行接種。由于此時(shí)期葉片較少，為減少對(duì)植株損傷，每株選取1片葉片進(jìn)行。接種方法參考周嘉平等的[16]方法并作適當(dāng)修改：取新鮮葉片，置于鋪有濕潤(rùn)吸水紙的方形搪瓷盤中，用無(wú)菌針頭于葉片主脈一側(cè)刺穿以戳傷葉片，穿刺的位置為葉脈至葉沿中央處，每張葉片均于右側(cè)選取兩處，每處按0.5 cm見(jiàn)方穿刺4個(gè)點(diǎn)。接種量為菌液10 μL。接種完待液體稍干燥后用封口膜密封保濕，置于30℃黑暗處。分別于接種后4 ～10 d觀察。

第2次接種為復(fù)選：是對(duì)第1次接種后未見(jiàn)發(fā)病或發(fā)病較輕的植株進(jìn)行復(fù)選，在盛花期選取上部葉片進(jìn)行，由于此時(shí)期葉片較多，故每株選取3片葉片進(jìn)行，接種方法與初選時(shí)相同，但每張葉片只選取一處進(jìn)行戳傷處理。

第3次接種為葉片抗病性確認(rèn)：即復(fù)選后未見(jiàn)發(fā)病和發(fā)病較輕的植株，經(jīng)染色體鑒定后再取葉片進(jìn)行接種，接種方法與第2次相同。

每次接種均以云煙87四倍體和N. plumbaginifolia同時(shí)期相同葉位的葉片作為對(duì)照。

1.2.4 植株的GISH鑒定

取經(jīng)第2次接種后不發(fā)病及發(fā)病較輕的植株進(jìn)行GISH分析。有絲分裂中期染色體標(biāo)本制作參照陳瑞陽(yáng)等[17]的方法利用幼嫩子房進(jìn)行。GISH參照Brammer 等[18]的方法并加以改進(jìn)，以N.plumbaginifolia基因組DNA為探針，采用DIG-High Prime（羅氏）進(jìn)行標(biāo)記，探針終濃度為2.5 ng·μL-1；以云煙87基因組DNA為封阻，封阻濃度為探針濃度的10倍。以Anti-Digoxigenin- fl uorescein （羅氏）對(duì)探針進(jìn)行染色，DAPI襯染，熒光顯微鏡（Olympus，日本）進(jìn)行檢測(cè)、拍照，隨機(jī)軟件cellSens Standard 1.9 （Olympus,日本）對(duì)照片進(jìn)行處理。信號(hào)顏色模擬為紅色，背景顏色為藍(lán)色。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株的篩選

種植N. tabacum-N. plumbaginifolia雜種回交后代200株，其中存活120株，對(duì)這120株存活植株7葉期的離體葉片進(jìn)行第1次接種病原菌試驗(yàn)（初選）。結(jié)果表明，觀察時(shí)間內(nèi)（10 d）5株植株葉片沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病斑，8株葉片病斑較小，即其病斑面積未達(dá)到云煙87葉片的一半。N. plumbaginifolia葉片未見(jiàn)病斑出現(xiàn)。

第2次接種試驗(yàn)中，以第1次接種后不發(fā)病和發(fā)病較輕的植株共計(jì)13株的葉片為試驗(yàn)材料。結(jié)果顯示，在觀察時(shí)間內(nèi)（10 d），該13株材料中仍有4株沒(méi)有病斑，一株僅1片葉有病斑，其余植株均為2片以上葉有病斑。云煙87的3片葉片均呈現(xiàn)病斑，其中兩張葉片病斑較大，一張葉片病斑較小。而N.plumbaginifolia葉片仍未見(jiàn)病斑出現(xiàn)。將4株葉片無(wú)病斑的回交后代分別編號(hào)為：YPBC1-1、YPBC1-2、YPBC1-3、YPBC1-4，有1片葉片發(fā)病的植株編號(hào)為YPBC1-5。

圖1 部分回交后代第1次離體葉片人工侵染后的發(fā)病情況（4 d）Fig.1 Leaf performance of some BC1 plants 4 days after infection in the fi rst screening

2.2 部分植株的細(xì)胞學(xué)分析

以N. plumbaginifolia基因組DNA為探針，云煙87基因組DNA為封阻對(duì)上述經(jīng)第2次接種（復(fù)選）后獲得的4株葉片未見(jiàn)發(fā)病的植株和1株一片葉片發(fā)病的植株進(jìn)行了基因組原位雜交（GISH）分析。結(jié)果顯示，5株植株中，葉片不發(fā)病的4株植株均攜帶有來(lái)源于N. plumbaginifolia的染色體，葉片發(fā)病較輕的植株則未見(jiàn)來(lái)源于N. plumbaginifolia的染色體。4株攜帶有N. plumbaginifolia染色體的植株中有兩株攜帶有兩條外源染色體，這兩株植株分別為YPBC1-1和YPBC1-2，YPBC1-3僅攜帶一條外源染色體（見(jiàn)圖2 B），YPBC1-4攜帶有4條外源染色體。經(jīng)染色體計(jì)數(shù)，YPBC1-1和YPBC1-2染色體數(shù)目為52條，YPBC1-3的染色體數(shù)目為48條（圖2），YPBC1-4染色體數(shù)目為54。YPBC1-5未攜帶外源染色體，其染色體數(shù)目為53。

圖2 攜帶1條N. plumbaginifolia染色體的植株（YPBC1-3）的離體葉片接種病原菌后的表現(xiàn)（4 d）及其染色體組成的GISH鑒定（2n=48）Fig.2 Leaf performance of a BC1 plant (YPBC1-3), which had one N. plumbaginifolia chromosome, 4 days after infection and alien chromosome identi fi cation according to GISH

取該5株材料再次進(jìn)行接種試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與上述二次試驗(yàn)結(jié)果相近，不同點(diǎn)在于此次試驗(yàn)YPBC1-5發(fā)病葉片為2片，其中一片發(fā)病較早，另一葉片發(fā)病較晚。10 d后發(fā)病較晚的葉片的病斑面積不及發(fā)病較早的葉片的病斑面積的一半。

可見(jiàn)，上述4株葉片不發(fā)病植株中攜帶N.plumbaginifolia抗病基因所在染色體，且其中一株（YPBC1-3）僅攜帶一條來(lái)源于N. plumbaginifolia染色體，該染色體中所攜帶的基因可能是使該植株離體葉片經(jīng)黑脛病病原菌侵染而不發(fā)病的原因。

3 討論

離體葉片侵染法在多種植物病害的研究及植物對(duì)病害的抗性鑒定中有所應(yīng)用[19-21]。煙草黑脛病為土傳病害，雖未見(jiàn)以離體葉片侵染法對(duì)煙草的黑脛病抗性進(jìn)行鑒定的報(bào)道，但黑脛病病原菌對(duì)煙草葉片同樣會(huì)產(chǎn)生危害，形成病斑[22]。在部分對(duì)煙草黑脛病的研究及煙草抗黑脛病新材料的初步篩選中對(duì)這種方法有所應(yīng)用[16,23-24]。可見(jiàn)，這種方法雖不能對(duì)植株的黑脛病抗性進(jìn)行鑒定，但可在一定程度上反映其抗性。本次篩選采用這種方法，目的主要是對(duì)回交后代進(jìn)行初步篩選，以為后續(xù)進(jìn)一步研究提供材料。后續(xù)可通過(guò)組織培養(yǎng)建立無(wú)性系，以其它方法對(duì)篩選獲得植株的黑脛病抗性進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。

多次離體葉片接種試驗(yàn)均表明攜帶N.plumbaginifolia染色體的4株材料的葉片沒(méi)有出現(xiàn)病斑，可見(jiàn)該4株材料的葉片確對(duì)黑脛病具有較強(qiáng)抗性，其抗性至少?gòu)?qiáng)于云煙87，與N. plumbaginifolia相近，這表明該4株材料可能對(duì)黑脛病具有較強(qiáng)的抗性。尤其其中1株僅攜帶1條N. plumbaginifolia染色體，其染色體數(shù)目為48條（圖2 B），可能為異源單體代換系。后續(xù)需通過(guò)更多材料用以制片進(jìn)行觀察，并經(jīng)減數(shù)分裂期核型結(jié)合GISH方可予以確認(rèn)[25-26]。其余攜帶有N. plumbaginifolia染色體的植株由于與前述攜帶1條染色體的植株一樣，均為雜種回交后代而非自交后代。所以，這些植株中的N. plumbaginifolia染色體必以單體存在，并無(wú)成對(duì)染色體存在的可能。因此，這些材料也具有一定的價(jià)值，可通過(guò)回交或自交在其后代中較大概率篩選到僅攜帶1條外源染色體的植株或攜帶1對(duì)外源染色體的植株。

此外，由于攜帶有外源染色體且葉片接種病原菌不發(fā)病的后代植株數(shù)量有限，對(duì)其形態(tài)、育性、煙葉性狀以及其植株整體對(duì)黑脛病的抗性等特征仍不清楚，后續(xù)也需對(duì)該植株進(jìn)行無(wú)性繁殖，積累更多材料以便對(duì)其進(jìn)行更深入分析。

異源單體類植株在作物育種以及基因定位等基礎(chǔ)研究方面有重大意義。部分表現(xiàn)優(yōu)良的異源單體類植株可培育穩(wěn)定遺傳的異源二體植株以培育新品種[27]；利用異源單體類植株獲取攜帶有目的基因的異源易位系較自攜帶多條外源染色體的材料中獲取到的可能性更大，這使得異源單體類植株在遠(yuǎn)緣雜交育種中有重大的意義。本文所報(bào)道的1株攜帶1條N.plumbaginifolia染色體的植株，其葉片在離體條件下接種黑脛病病原菌無(wú)發(fā)病癥狀，這使得在普通煙草與N. plumbaginifolia的雜種后代中篩選抗黑脛病異源單體附加/代換系有一定的可能。同時(shí)也表明，利用N.plumbaginifolia進(jìn)行煙草黑脛病抗性改良具備了一定的基礎(chǔ)。此外，利用該異源單體植株可對(duì)該外源單染色體上的若干外源基因進(jìn)行物理定位和連鎖分析[28]，這將有助于對(duì)N. plumbaginifolia的進(jìn)一步研究并對(duì)其加以更多利用。

由于該異源單體植株為種間雜種回交1代中選出，這表明在回交一代中篩選異源單體類植株是可能的。后續(xù)如利用N. plumbaginifolia進(jìn)行煙草其它性狀的改良，本文的方法可以提供一定的參考。

4 結(jié)論

自N. tabacum-N. plumbaginifolia雜種回交后代中篩選獲得了4株異源染色體植株，其葉片在離體條件下對(duì)黑脛病具有較強(qiáng)抗性，其中一株僅攜帶1條N.plumbaginifolia染色體，可能為異源單體代換系。

[1]Liu Dengcai, Zhang Huaigang, Zhang Lianquan, et al.Distant hybridization: a tool for interspeci fi c manipulation of chromosomes[M]// Pratap A, Kumar J. Alien gene transfer in crop plants. New York: Springer, 2014:25-42.

[2]鐘冠昌, 穆素梅, 張正斌. 麥類遠(yuǎn)緣雜交(M). 北京: 科學(xué)出版社, 2003.ZHONG Guanchang, MU Sumei, ZHANG Zhengbin.Wheat distant hybridization(M). Beijing: Science press,2003.

[3]Multani D S, Jena K K, Brar D S, et al. Development of monosomic alien addition lines and introgression of genes fromOryza australiensisDomin. to cultivated riceO. sativaL.[J]. Theoretical & Applied Genetics, 1994, 88(1):102-109.

[4]Chen Y, Wang Y, Wang K, et al. Construction of a complete set of alien chromosome addition lines fromGossypium australeinGossypium hirsutum:morphological,cytological, and genotypic characterization[J]. Tag Theoretical & Applied Genetics, 2014, 127(5):1-17.

[5]Kang L, Du X, Zhou Y, et al. Development of a complete set of monosomic alien addition lines betweenBrassica napusandIsatis indigotica(Chinese woad)[J]. Plant Cell Reports, 2014, 33(8):1355-1364.

[6]Suen D F, Wang C K, Lin R F, et al. Assignment of dna markers to nicotiana sylvestris chromosomes using monosomic alien addition lines[J]. Theoretical & Applied Genetics, 1997, 94(3): 331-337.

[7]Budahn H, Schrader O, Peterka H. Development of a complete set of disomic rape-radish chromosome-addition lines[J]. Euphytica, 2008,162(1): 117-128.

[8] 王志愿, 姜清治, 霍沁建. 煙草黑脛病的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 26(21): 250-255.WANG Zhiyuan, JIANG Qingzhi, HUO Qinjian. Process of research on tobacco black shank[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2010, 26(21): 250-255.

[9]Li B C, Bass W T, Cornelius P L. Resistance to tobacco black shank inNicotianaspecies[J]. Crop science, 2006,46(2): 554-560.

[10]Lautz W. Resistance to black shank of 51 species ofNicotianaand of 13 interspeci fi c hybrids[J]. Plant Disease Reporter, 1957, 41: 96-98.

[11]王元英, 周健. 中美主要煙草品種親源分析與煙草育種[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào), 1995, 2(3): 11-22.WANG Yuanying, ZHOU Jian. Parentage analysis of major tobacco varieties and tobacco breeding in America and China[J]. Acta Tabacaria Sinica, 1995, 2(3): 11-22.

[12]Goins R B, Apple J L. Inheritance and phenotypic expression of a dominant factor for black shank resistance fromNicotiana plumbaginifoliain aNicotiana tabacummilieu[J]. Tobbaco Sci, 1970, 14: 7-11.

[13]Johnson E S, Wol ff M F, Wernsman E A, et al. Origin of the black shank resistance gene, Ph , in tobacco cultivar Coker 371 gold[J]. Plant Disease, 2002, 86(10): 1080-1084.

[14]Oka K, Niinomi K. Interspecifie transfer of blackshank resistance in tobacco: cytogenetical observation on pollensterility in a blackshank resistant allotrisomic plant withN. plumbaginifoliachromosome.[J]. Japanese Journal of Breeding, 1961, 11(3)：245

[15]王萬(wàn)能, 全學(xué)軍, 肖崇剛. 煙草疫霉菌的產(chǎn)孢和接種方法研究[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2005, 32(1): 18-22.WANG Wanneng, QUAN Xuejun, XIAO Chonggang.Research on the methods of producing zoosporangia and inoculation ofPhytophthora parasiticavar. nicotianae[J].Acta Phytophylacica Sinica, 2005, 32(1): 18-22.

[16]周嘉平, 周儉民, 梁思信, 等. 煙草抗黑脛病突變體的細(xì)胞篩選[J]. 遺傳學(xué)報(bào), 1990(3): 180-188.ZHOU Jiaping, ZHOU Jianmin, LIANG Sixin, et al. Cell selection of the tobacco mutant resistant to black shank disease[J]. Journal of Genetics and Genomics, 1990(3):180-188.

[17]陳瑞陽(yáng), 宋文芹, 李秀蘭. 植物染色體標(biāo)本制備的去壁-低滲法及其在細(xì)胞遺傳學(xué)中的意義[J]. 遺傳學(xué)報(bào), 1982,9(2): 151-159.CHEN Ruiyang, SONG Wenqin, LI Xiulan. Wall degradation hypotonic method of preparing chromosome samples in plant and its signi fi cance in the cytogenetics[J].Journal of Genetics and Genomics, 1982, 9(2): 151-159.

[18]Brammer S P, Vasconcelos S, Poersch L B, et al. Genomic in situ hybridization in Triticeae: a methodological approach[M]//Andersen S B. Plant breeding from laboratories to fi elds. Intech, 2013: 2-44.

[19]趙艷龍, 何衍彪, 詹儒林. 劍麻離體葉片接種劍麻莖腐病菌方法的研究[J]. 中國(guó)麻業(yè), 2005(3):142-145.ZHAO Yanlong, HE Yanbiao, ZHAN Rulin. Studies on method of inoculation with Aspergillus niger on leaves of sisalin vitro[J]. Plant Fibers and Products, 2005(3):142-145.

[20]符冬妹, 陳漢清, 郭素霞, 等. 香蕉枯萎鐮刀菌致病性快速測(cè)定方法的建立[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2015(2):408-416.FU Dongmei, CHEN Hanqing, GUO Suxia, et al. A rapid method forin vitropathogenicity test ofFusarium oxysporumf. sp.cubense[J]. Genomics and Applied Biology, 2015(2):408-416.

[21]夏德術(shù), 曹清波, 余毓君. 小麥赤霉病抗性的離體葉片接種和穗部接種相關(guān)關(guān)系的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào),1990(3):218-62.XIA Deshu, CAO Qingbo, YU Yujun. Studies on the correlation of wheat scab resistance between leaf and spickin vitroinfection[J]. Acta Phytopathologica Sinica,1990(3):218-62.

[22]Gallup C A, Sullivan M J, Shew H D. 2006. Black Shank of Tobacco[J]. The Plant Health Instructor, DOI: 10.1094/PHI-I-2006-0717-01

[23]張志宏. 體細(xì)胞無(wú)性系變異與煙草抗黑脛病細(xì)胞突變體的篩選[D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院, 1998.ZHANG Zhihong. Somatic variation and its use in selection for resistance to tobacco black shank caused byPhytophthoraparasiticavar. nicotianae[D]. Beijing:Chinese Academy of Sciences, 1998

[24]王長(zhǎng)春, 蔡新忠, 林敬州,等. 水楊酸和乙烯在煙草抗黑脛病中的作用[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2003, 30(3):295-299.WANG Changchun, CAI Xinzhong, LIN Jingzhou, et al.The role of salicylic acid and ethylene in resistance of tobacco to black shank. Acta Phytophylacica Sinica, 2003,30(3):295-299.

[25]Li Xiaofeng, Xuan Shuxin, Wang Junling, et al. Generation and identification ofBrassica alboglabra-Brassica campestrismonosomic alien addition lines[J]. Genome,2013, 56(3):171-177.

[26]Sarr D, Lacape J M, Rodier-Goud M, et al. Isolation of fi ve new monosomic alien addition lines ofGossypium australeF. Muell inG. hirsutumL. by SSR and GISH analyses[J].Plant Breeding, 2011, 130(1): 60-66.

[27]王睿輝. 小麥-冰草異源二體附加系的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2004.WANG Ruihui. Cytological and molecular characterization of a set of wheat-A. cristatum disomic addition lines[D].Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2004.

[28]譚光軒. 植物基因組研究與利用的新型工具——異源單體附加系[J]. 遺傳, 2008, 30(1): 35-45.TAN Guangxuan. Monosomic alien addition lines: a new tool for studying and using plant genomics[J]. Hereditas,2008, 30(1): 35-45.

Preliminary report on selection of black shank resistant plants with alien chromosomesfromNicotiana tabacum-N. plumbaginifoliabackcross generations

DANG Jiangbo1, LIANG Guolu1, GUO Qigao1, XIANG Suqiong1, SUN Haiyan1, HE Qiao1, YANG Chao2, CHEN Yiyin2
1 College of Horticulture and Landscape, Southwest University, Chongqing 400716, China;2 Tobacco Research Institute, Chongqing Municipal Tobacco Corporation, Chongqing 400716, China

To obtain strong black shank resistant plants with alien chromosomes inNicotiana tabacum-N. plumbaginifoliabackcross generations, 120 plants were primarily screened byin vitroleaf infection method, and plants without scabs and with smaller scabs on leaf were selected in the fi rst screening, plants without scabs and with smaller scabs on the leaves were investigated by genomicin situhybridization (GISH) in the second screening. 5 plants without scabs on leaf and 8 plants with smaller scabs on leaf were found during the fi rst screening, and 4 plants without scabs on leaf and 1 plant with smaller scabs on leaf were found in the second screening. GISH results showed that there were 1-4 chromosomes fromN. plumbaginifoliagenome in 4 plants without scabs on leaf, and noN. plumbaginifoliachromosomes in plant with smaller scabs on leaf. Leaves resistance to black shank of these 5 plants were selected to be investigated by GISH and were testedin vitroagain, presenting similar results to that of second screening. Thus, 4 tobacco plants with leaf that highly resistant to black shank, were obtained inNicotiana tabacum-N. plumbaginifoliahybrid BC1 plants, and they had 1-4 alien chromosomes,and one of them could be monosomic alien substitution plant.

N. tabacum;N. plumbaginifolia; leafin vitro; black shank resistance; monosomic alien substitution lines

中國(guó)煙草總公司重慶市公司資助項(xiàng)目（No: 2012044）

黨江波，博士研究生，主要從事煙草細(xì)胞遺傳學(xué)研究，Email：dangjiangbo@126.com

梁國(guó)魯，主要從事細(xì)胞遺傳及生物學(xué)研究，Email：lianggl@swu.edu.cn

2016-01-19

黨江波，梁國(guó)魯，郭啟高，等.Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia雜種回交后代中篩選抗黑脛病異源染色體植株初報(bào)[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2016,22（4）

:DANG Jiangbo, LIANG Guolu, GUO Qigao, et al. Preliminary report on selection of black shank resistant plants with alien chromosomesfromNicotianatabacum-N.plumbaginifoliabackcross generations [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)