趙 偉，徐向群

(浙江理工大學(xué)理學(xué)院，杭州 310018)

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樺褐孔菌子實(shí)體多酚的分離及抗氧化性的研究

趙 偉，徐向群

(浙江理工大學(xué)理學(xué)院，杭州 310018)

樺褐孔菌子實(shí)體中含有大量的活性多酚，為了對(duì)多酚進(jìn)行有效分離，采用甲醇、乙醇和水作為提取溶劑，通過測(cè)定多酚含量和DPPH自由基清除率來比較不同溶劑的提取效率，并運(yùn)用Sephadex LH-20柱色譜對(duì)多酚提取液進(jìn)行分離。結(jié)果表明：在60℃條件下，以甲醇為溶劑并結(jié)合超聲破碎得到的提取液中多酚含量和DPPH自由基清除率最高，同時(shí)Sephadex LH-20柱色譜對(duì)乙酸乙酯層和正丁醇層多酚實(shí)現(xiàn)了有效初步分離，并得出多酚的組成與抗氧化活性緊密關(guān)聯(lián)。多酚的初步分離為進(jìn)一步深入研究多酚組分提供了基礎(chǔ)。

樺褐孔菌；多酚；分離；抗氧化活性

0 引 言

樺褐孔菌，也被稱為“chaga”，是一種屬于擔(dān)子菌門繡革菌科的陸地多孔藥用真菌，主要生長在北緯45°～50°的寒冷地區(qū)，包括北美、芬蘭、波蘭、俄羅斯的西伯利亞和堪察加半島、中國黑龍江的大興安嶺和小興安嶺、吉林省的長白山以及日本的北海道等地區(qū)[1]。早在16世紀(jì)，樺褐孔菌作為一種有效且低毒性的民間藥物，被廣泛應(yīng)用于治療糖尿病、癌癥和心血管等疾病[2]。樺褐孔菌的特殊藥用價(jià)值主要是由于含有大量多糖、三萜、多酚等生物活性代謝產(chǎn)物，這些活性成分使其表現(xiàn)出了抗病毒、抗菌、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等活性[3-5]。樺褐孔菌多酚已被證明是一種天然的抗氧化劑，具有清除各種自由基的能力[6-8]。

目前對(duì)樺褐孔菌子實(shí)體的研究重點(diǎn)是多酚和多糖等物質(zhì)的分離鑒定和生物活性，其中很多文獻(xiàn)報(bào)道了多糖的提取和活性研究[9-10]，但對(duì)于多酚類物質(zhì)的研究較少，同時(shí)存在多酚的提取率低，分離鑒定困難等亟待解決的問題。從樺褐孔菌子實(shí)體中提取多酚的主要方法是溶劑提取法，比較常用的有熱水、甲醇和乙醇等溶劑，而且不同的提取溶劑，得到的多酚含量和抗氧化活性不同[11-13]。超聲破碎是用于提取生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的一種高效率的方法，它能夠通過振動(dòng)空化作用，破碎細(xì)胞壁。因此本文比較了幾種常見溶劑的提取效率，并得出了運(yùn)用溶劑提取與超聲破碎相結(jié)合來提取樺褐孔菌子實(shí)體多酚是非常有效的方法[14]。本文在篩選出最佳提取條件的基礎(chǔ)上，采用Sephadex LH-20柱色譜對(duì)多酚提取液進(jìn)行初步分離分段，比較分段洗脫物中多酚的含量和抗氧化活性，為實(shí)現(xiàn)多酚的鑒定提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

樺褐孔菌子實(shí)體，購于杭州胡慶余堂。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、福林酚試劑等，分析純，購于美國sigma公司；其它試劑均為分析純，購于杭州高晶精細(xì)化工有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樺褐孔菌子實(shí)體多酚的提取

樺褐孔菌子實(shí)體烘干至恒重后，研磨成粉末狀，并將其倒入離心管中，分別加入10倍體積的提取溶劑(甲醇、乙醇和水)進(jìn)行超聲破碎，將破碎后的勻漿液提取6 h，提取3次，離心得含有大量多酚的上清液[15]。將所得的上清液脫水后溶于一定體積的蒸餾水，再加入1/4體積氯仿，萃取3次；然后在水層中加入1/4體積乙酸乙酯，萃取3次，將乙酸乙酯層萃取液真空干燥后，即得到樺褐孔菌子實(shí)體的乙酸乙酯層多酚；繼續(xù)在萃取后的液體中加入1/4體積正丁醇，萃取3次，將正丁醇層萃取液真空干燥后，即可得到樺褐孔菌子實(shí)體的正丁醇層多酚。

1.3.2 樺褐孔菌多酚含量的測(cè)定

樺褐孔菌多酚的測(cè)定采用福林-酚法( Folin-Ciocalteu reagent method[16])，具體步驟如下：

a)多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

分別100 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中準(zhǔn)確吸取0、100、200、300、400、500、600、700、800 μL到干凈的10 mL試管中，然后加入500 μL福林酚試劑，搖勻后放置3min，接著加入500 μL 20% Na2CO3，最后分別加入一定體積的蒸餾水使其體積均為5 mL，充分搖勻后放置在暗室里反應(yīng)90 min。取出后，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度A765值。分別以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和吸光度為橫縱坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

b)多酚含量的測(cè)定

將提取到的多酚定容到10 mL，按照與1.3.2 a)相同的方法進(jìn)行測(cè)定并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚的含量。

1.3.3 樺褐孔菌多酚DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考Zhu等[15]的方法測(cè)定樺褐孔菌多酚的 DPPH自由基清除率，具體方法為：將0.8 mL DPPH甲醇溶液(0.4 mM)加入到10 mL試管中，然后加入2.4 mL多酚樣品，充分混合后，在暗室中室溫保持 30 min，在波長為517 nm下，測(cè)得Ax值。對(duì)照組用蒸餾水代替多酚樣品，在波長為517 nm下，測(cè)得A0值。用甲醇溶液代替 DPPH 甲醇溶液，多酚樣品的加入量為2.4 mL，在波長為517nm下，測(cè)其Ax0值。計(jì)算公式如下：

(1)

1.3.4 樺褐孔菌多酚的分段分離鑒定

稱取25 g Sephadex LH-20干粉于一定體積蒸餾水中，充分溶脹，將其填充在玻璃柱中(470 mm×15 mm)，濕法上樣后，以甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，流速為1.4 mL/min，結(jié)束后，繼續(xù)用2～3倍柱體積的甲醇沖洗使柱子再生。

用紫外分光光度計(jì)在280 nm波長下，測(cè)定洗脫物的吸光度，根據(jù)色譜圖中吸光度的變化，將得到的分段洗脫物合并成幾個(gè)主要部分進(jìn)行分析，并測(cè)定其中的多酚的含量及抗氧化性[17-18]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

本文中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3組平行，運(yùn)用 SPSS 19.0( USA)和 Origin 7.5軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取溶劑對(duì)樺褐孔菌多酚含量的影響

多酚主要分為酚酸、黃酮類和大分子多酚類物質(zhì)，采用幾種常見的溶劑提取樺褐孔菌子實(shí)體中的多酚，然后用乙酸乙酯萃取，可以使更多的小極性多酚進(jìn)入乙酸乙酯層，極性較大的多酚則更容易被萃取到正丁醇層。每組實(shí)驗(yàn)平行3次，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

從圖1可以看出，采用不同的溶劑提取，得到的乙酸乙酯和正丁醇萃取層多酚含量是不同的。通過對(duì)顯著性差異的分析得出，乙酸乙酯層多酚含量由高到低為：甲醇*>甲醇>乙醇>水*>水，其中，甲醇*代表在60℃條件下以甲醇為提取溶劑，水*代表在100℃條件下以水為提取溶劑，其余均為室溫條件；正丁醇層多酚含量由高到低：甲醇*>水*>水>乙醇>甲醇。以水為溶劑時(shí)，得到較多的強(qiáng)極性酚類物質(zhì)，使得乙酸乙酯層多酚的含量最低，而正丁醇層多酚含量相對(duì)較高。通過比較分析得到，在60℃條件下，采用甲醇提取子實(shí)體中多酚的效果是最好的，提取液的乙酸乙酯層和正丁醇層多酚含量明顯高于其他條件(P<0.05)。

圖1 不同提取溶劑對(duì)多酚萃取物中多酚含量的影響注：甲醇*：60 ℃條件，水*：100 ℃條件，其余均為室溫條件。圖中乙酸乙酯層和正丁醇層多酚含量的顯著性差異分別用小寫字母和大寫字母表示，不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 不同提取溶劑對(duì)樺褐孔菌多酚抗氧化活性的影響

多酚的抗氧化活性研究非常重要，多酚DPPH自由基清除率經(jīng)常被用來衡量抗氧化活性的高低。本實(shí)驗(yàn)在研究了多酚含量的基礎(chǔ)上，比較不同提取溶劑的乙酸乙酯層和正丁醇層多酚萃取物在同一濃度下(100 mg GAE/L)的DPPH自由基清除率，同樣每組實(shí)驗(yàn)平行3次，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

如圖2所示，除水的乙酸乙酯層多酚以外，其余多酚的DPPH自由基清除率均在30%左右。相比較而言，在60℃條件下，甲醇提取液的乙酸乙酯層多酚和正丁醇層多酚的DPPH自由基清除率顯著性地高于其它提取液(P<0.05)，分別達(dá)到了40.01%和39.10%。綜合考慮乙酸乙酯層和正丁醇層多酚的含量和DPPH自由基清除率，確定在60 ℃條件下，采用甲醇提取樺褐孔菌子實(shí)體中的多酚。

圖2 不同提取溶劑對(duì)多酚萃取物的DPPH自由基清除率的影響注：甲醇*：60 ℃條件，水*：100 ℃條件，其余均為室溫條件。圖中乙酸乙酯層和正丁醇層多酚DPPH自由基清除率的顯著性差異分別用小寫字母和大寫字母表示，不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 不同萃取層多酚Sephadex LH-20柱色譜流出曲線

在波長為280 nm下，測(cè)定每個(gè)試管中乙酸乙酯層和正丁醇層多酚柱色譜洗脫物的吸光度，制成色譜圖，根據(jù)色譜圖中吸光度的變化，將得到的洗脫物合并成幾個(gè)主要部分進(jìn)行分析，由于乙酸乙酯層和正丁醇層多酚的極性和組成的差異，其得到的柱色譜流出曲線不同，隨著洗脫的進(jìn)行，乙酸乙酯層多酚逐漸被洗脫出來，與乙酸乙酯層相比，正丁醇層多酚較易被洗脫出來，F(xiàn)2中洗脫液的吸光度最高，含有較多的多酚，具體結(jié)果如圖3所示。

圖3 樺褐孔菌子實(shí)體多酚柱色譜流出曲線

2.4 不同萃取層多酚分段分離的多酚含量

將得到的洗脫物進(jìn)行根據(jù)流出曲線進(jìn)行合并后，測(cè)定了各個(gè)部分的多酚含量。從圖4(a)中可以

圖4 樺褐孔菌子實(shí)體多酚分段分離多酚含量注：圖中多酚含量的顯著性差異用小寫字母表示，不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

看出乙酸乙酯層分段洗脫物中多酚含量由高到低為：Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅰ>Ⅴ，第Ⅱ部分的多酚含量明顯高于其他組分(P<0.05)，第Ⅴ部分的多酚含量最低；如圖4(b)，對(duì)于正丁醇層分段洗脫物，同樣是第Ⅱ部分的多酚含量最高，其余部分均要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于第Ⅱ部分，第Ⅱ和Ⅴ部分沒有顯著性差異(P<0.05)。由于正丁醇極性大于乙酸乙酯，在正丁醇層中含有更多的強(qiáng)極性多酚。

2.5 不同萃取層多酚分段分離的多酚抗氧化活性

抗氧化活性是多酚的一個(gè)重要生物學(xué)活性，因此比較分段多酚的抗氧化活性的不同是十分重要的。如圖5(a)，乙酸乙酯層分段洗脫物的DPPH清除率由高到低為：Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ>Ⅰ，其中第Ⅱ部分中不僅含有最多的多酚，其對(duì)應(yīng)的DPPH清除率也是最高的，達(dá)到了65.61%；第Ⅳ和Ⅴ部分的多酚含量雖然較低，但其DPPH自由基清除率較高，分別達(dá)到了54.80%和51.50%，這說明該部分含有更多的高活性多酚；正丁醇層分段洗脫物中，除第Ⅰ部分以外，其余部分的DPPH自由基清除率均在40%

圖5 樺褐孔菌子實(shí)體多酚分段分離多酚DPPH自由基清除率注：圖中多酚DPPH自由基清除率的顯著性差異用小寫字母表示，不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

以上，第Ⅱ部分的抗氧化活性最高，達(dá)到了50.70%，說明這幾部分中含有的多酚活性較高(P<0.05)，具體結(jié)果如圖5(b)。同時(shí)通過比較發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯層多酚的DPPH自由基清除率總體上高于正丁醇層，具有較高的抗氧化活性(P<0.05)。

3 結(jié) 論

樺褐孔菌作為一種天然藥用真菌，其子實(shí)體中含有大量的生物活性成分，其中多酚類物質(zhì)在抗氧化活性方面發(fā)揮著重要的作用。通過對(duì)幾種溶劑提取液中多酚含量和抗氧化活性的研究發(fā)現(xiàn)：a)在60 ℃條件下，采用甲醇溶劑對(duì)樺褐孔菌子實(shí)體中多酚的提取效果是最有效的；b)Sephadex LH-20柱色譜可以對(duì)不同萃取層多酚初步進(jìn)行有效分離，對(duì)多酚含量和抗氧化活性的比較后，從而得出抗氧化活性不僅與多酚含量有關(guān)，更重要的是受多酚組成的影響。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)多酚的進(jìn)一步分離鑒定提供了前提，可以嘗試在此基礎(chǔ)上選擇活性較高的部分進(jìn)行組分研究。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Study on Separation of Polyphenol from Fruit Body ofInonotusobliquusand Its Antioxidant Activity

ZHAOWei,XUXiangqun

(School of Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

The fruit body ofInonotusobliquuscontains abundant active polyphenols. In order to separate the polyphenols, methanol, ethanol and water were used as the extraction solvents, and the extraction efficiency of different solvents was compared through determining content and DPPH radical scavenging activity of polyphenol. Meanwhile, Sephadex LH-20 column chromatography was applied to separate the polyphenol extract. The study results show that under the condition of 60 ℃ , the content and DPPH radical scavenging activity of polyphenol in extract reach the maximum when methanol as the solvent is combined with ultrasonication. Besides, good preliminary separation of polyphenol at ethyl acetate layer and n-butyl alcohol layer is achieved by using Sephadex LH-20 column chromatography. The result indicates that polyphenol composition is closely related to antioxidant activity. Preliminary separation of polyphenol lays a foudnaiton for further study of polyphenol components.

Inonotusobliquus; polyphenol; separation; antioxidant activity

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.11.022

2016-03-12

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY16B020013)

趙 偉(1990-)，女，山東青島人，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)和生物分析化學(xué)方面研究。

徐向群，E-mail：xuxiangqun@zstu.edu.cn

Q936

A

1673- 3851 (2016) 06- 0928- 05 引用頁碼： 110706