8種血液病患者人巨細(xì)胞病毒感染情況分析

徐 爽，呂曉麗，鄒菊賢，楊文青，李銳成，沈建軍，張惠中

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)科，西安 710038)

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·臨床研究·

8種血液病患者人巨細(xì)胞病毒感染情況分析

徐 爽，呂曉麗，鄒菊賢，楊文青，李銳成，沈建軍，張惠中△

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)科，西安 710038)

目的 探討不同血液病患者人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染情況。方法 選取該院8種血液病患者共274例，采用實(shí)時熒光定量PCR法對患者血液或尿液進(jìn)行HCMV DNA檢測。結(jié)果 血液病患者感染率由高到低依次為急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL，39.47%)、急性混合型白血病(AL，28.57%)、急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL，26.15%)、再生障礙性貧血(AA，20.34%)、骨髓異常增生綜合征(MDS，14.29%)、慢性粒細(xì)胞白血病(CML，13.64%)、三系血細(xì)胞減少(0.40%)，19例非霍奇金淋巴瘤(NHL)未檢出HCMV感染。274例患者總陽性率達(dá)13.87%，其中AL陽性率最高(23.02%)。腫瘤患者HCMV感染率高于非腫瘤患者，感染率分別為24.85%和13.76%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.339，P<0.05)。8種血液病患者HCMV DNA載量均值為 5.00×103IU/mL，最高達(dá)1.29×106IU/mL。結(jié)論 8種血液病患者存在不同程度的HCMV感染，且腫瘤患者較非腫瘤患者感染率更高。

血液??； 人巨細(xì)胞病毒； 實(shí)時熒光定量PCR

人巨細(xì)胞病毒(HCMV)屬β皰疹病毒亞科，屬廣泛傳播的機(jī)會致病病毒，在人群中血漿免疫球蛋白G(IgG)抗體陽性率為40%～100%[1]。免疫功能正常者初次感染后無癥狀，大部分病毒被免疫系統(tǒng)清除，少部分呈潛伏狀態(tài)，但當(dāng)?shù)挚沽ο陆?，潛伏病毒被重新激活，引起活動性感染甚至致死性損傷，其中血液系統(tǒng)是其感染的主要受累部位之一[2-3]。HCMV干擾造血功能，使造血細(xì)胞增殖和分化，導(dǎo)致間質(zhì)性肺炎病死率高達(dá)80%以上[4-5]。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為病毒感染診斷開辟了新途徑，其中實(shí)時熒光定量PCR法因其靈敏、特異、光譜技術(shù)敏感及精確定量的特點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。該技術(shù)全程全封閉反應(yīng)，從根本上解決PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染問題，具有較高的靈敏度、特異度、精確性，高效率、污染小等特點(diǎn)，為臨床及科研提供及時、準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)[6]?，F(xiàn)應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR法檢測8種血液病患者HCMV DNA，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2015年12月該院住院血液系統(tǒng)疾病患者274例，其中急性混合型白血病(AL)21例，慢性粒細(xì)胞白血病(CML)22例，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)38例，急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)65例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)19例，三系血細(xì)胞減少36例，骨髓異常增生綜合征(MDS)14例，再生障礙性貧血(AA)59例。

1.2 儀器與試劑 儀器為美國ABI-7500型實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增儀，人巨細(xì)胞病毒核酸檢測試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法 (1)血液標(biāo)本：抽取患者血液3 mL，4 000 r/min離心5 min，吸取血清100 μL置于0.5 mL無菌Eppendorf管內(nèi)，加入等量DNA提取液振蕩混勻，100 ℃恒溫處理10 min，12 000 r/min離心5 min，上清液備用。(2)尿液標(biāo)本：囑患者用無菌生理鹽水或潔凈清水沖洗外陰部后留取初尿液(晨尿)于無菌尿杯中。(3)非血性尿標(biāo)本：將尿液倒入無菌干燥管，14 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加無菌生理鹽水，振蕩混勻，14 000 r/min離心5 min，棄上清液留沉淀。(4)血性尿標(biāo)本：將尿液倒入無菌干燥管，14 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀中加無菌去離子水振蕩混勻，14 000 r/min離心5 min，棄上清液留沉淀，重復(fù)洗滌直至上清液清亮(去除紅細(xì)胞)后留沉淀。向沉淀中加50 μL DNA提取液振蕩混勻，100 ℃恒溫處理10 min，12 000 r/min離心5 min，上清液備用。

1.4 基因擴(kuò)增與結(jié)果判讀 分別吸取樣品DNA、質(zhì)控品DNA和陽性定量參考品各2 μL于擴(kuò)增管中，8 000 r/min離心1 min后上機(jī)擴(kuò)增，每次擴(kuò)增均設(shè)陽性、陰性對照和空白對照。擴(kuò)增參數(shù)為93 ℃預(yù)變性120 s；93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s,10個循環(huán)；93 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s,30個循環(huán)，55 ℃時采集熒光。根據(jù)陽性定量參考品擴(kuò)增結(jié)果分析并調(diào)節(jié)基線和閾值，線性相關(guān)系數(shù)(r)>0.98。若增長曲線不呈S型或CT值等于30，則判定檢測結(jié)果為陰性，若增長曲線呈S型且CT值小于30，結(jié)果為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 8種不同血液病患者HCMV DNA檢測結(jié)果比較 274例患者HCMV感染56例，感染率20.44%。其中ALL患者感染率最高(39.47%)，其次為AL和ANLL(28.57%和26.15%)。274例患者共檢測1 233例次，總陽性率達(dá)13.87%，其中AL、ALL、ANLL占陽性總例數(shù)的比例較高，分別為23.02%、17.80%、14.40%。

2.2 腫瘤患者和非腫瘤患者陽性率結(jié)果比較 CML、ALL、ANLL、AL、NHL共165例，HCMV感染41例，感染率24.85%；非腫瘤性血液病患者感染率為13.76%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.962，P<0.05)。見表1。

2.3 5種血液病患者HCMV DNA載量分析 同一疾病患者之間病毒載量差異較大，最高可達(dá)1.29×106IU/mL，5種血液病患者HCMV DNA載量不同，但均值為5.00×103IU/mL。見表2。

表1 腫瘤患者和非腫瘤患者陽性率結(jié)果比較

表2 5種血液病患者的HCMV DNA載量分析

3 討 論

HCMV屬于皰疹病毒科，是特異性DNA病毒，自首次分離后被證實(shí)是一種在人群中廣泛存在的感染因子[7]。因HCMV在體內(nèi)可感染T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞及單核細(xì)胞，進(jìn)一步造成免疫抑制，因此免疫功能低下者較健康者更易感染。隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，造血干細(xì)胞移植取得長足進(jìn)步，尤其是在血液惡性疾病的危險分期和分層治療中得到廣泛應(yīng)用，較大改善疾病預(yù)后，但移植后細(xì)胞免疫和體液免疫功能下降，致使患者易發(fā)生病毒(單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒)感染，其中HCMV感染發(fā)生率較高[8]。目前，國內(nèi)外對HCMV致病的研究多集中于新生兒及器官移植患者，實(shí)際上多數(shù)血液病同樣會對機(jī)體免疫系統(tǒng)造成損害，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，從而誘發(fā)HCMV 再次活化[9]。

本研究結(jié)果顯示，274例患者HCMV感染者56例，感染率20.44%，其中ALL患者感染率最高，達(dá)39.47%，其次為AL，占28.57%，可能與HCMV在體內(nèi)易感染T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞，造成免疫抑制有關(guān)。本組AA患者HCMV感染率達(dá)21.53%，在8種疾病的陽性總例數(shù)中占20.34%。桂敏等[10]研究表明，HCMV活動性感染可使造血干細(xì)胞明顯減少，引起造血衰竭，但因骨髓HCMV活動性感染導(dǎo)致部分再生障礙性白血病的發(fā)生，還是骨髓 HCMV活動性感染加重再生障礙性白血病，有待于進(jìn)一步研究。本組274例患者共檢測1 233例次，總陽性率達(dá)13.87%，其中ANLL所占比例最高，其次為AA和ALL，這一結(jié)果除了與HCMV易感免疫細(xì)胞造成免疫抑制有關(guān)，還可能與疾病的狀態(tài)和監(jiān)測時間間隔有關(guān)，提示合理的病毒檢測策略對感染的控制至關(guān)重要。

Tabata等[11]研究表明，HCMV感染能刺激腫瘤細(xì)胞TGF-β1的產(chǎn)生和激活，逃避宿主的免疫應(yīng)答，且在HCMV感染的不同組織中發(fā)現(xiàn)HCMV增加內(nèi)皮細(xì)胞中整合蛋白αvβ6 的表達(dá)，從而進(jìn)一步激活TGF-β1分泌，抑制宿主的免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果說明，腫瘤患者HCMV感染率(24.85%)高于非腫瘤患者(13.76%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.962，P<0.05)，提示除與上述機(jī)制有關(guān)外，腫瘤患者免疫狀態(tài)低于非腫瘤患者，因而更易誘發(fā)HCMV感染及其他機(jī)會病原體感染。此外，免疫功能低下者白血病發(fā)病率明顯升高，一旦發(fā)病可使機(jī)體免疫功能進(jìn)一步受損，減弱免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和抗感染能力，致使病毒活化和激活，進(jìn)一步加重病情。

本研究結(jié)果顯示，同一疾病患者之間病毒載量差異較大，最高數(shù)值可達(dá)1.29×106IU/mL，5種血液病患者HCMV DNA的載量不同，但均值多集中在5.00×103IU/mL。目前尚無明確定義合適的病毒載量判斷感染的輕重。國外研究顯示大于5.00×103IU/mL 具有較高的患HCMV風(fēng)險[12]。國內(nèi)也有研究顯示HCMV DNA大于5.00×103IU/mL時病情轉(zhuǎn)歸均較差[13]。所以，及時監(jiān)測并準(zhǔn)確定量血液病患者HCMV DNA載量，可幫助臨床及早治療，縮短治療時間，并為評估治療方案的成功與否和耐藥性的出現(xiàn)提供重要依據(jù)。

綜上所述，不同血液病患者存在不同程度HCMV感染，且腫瘤患者較非腫瘤患者感染率更高，實(shí)時定量PCR法檢測HCMV DNA具有快速、高靈敏度和特異度，有重要的臨床應(yīng)用價值。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.049

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1673-4130(2016)20-2915-03

2016-02-16

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△通訊作者，E-mail：zhz328@ffmmu.edu.cn。