快速高效的半邊蓮組織培養(yǎng)體系研究

劉柏玲　李守潔　張凱　郭志軍　張香蕊　王康滿　侯元同

摘要：為保護(hù)和利用半邊蓮種質(zhì)資源，建立快速高效的組織培養(yǎng)體系，本研究以野外采集的半邊蓮頂芽和莖段為外植體，利用Ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA和NAA，研究半邊蓮合適的芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)基。結(jié)果表明，半邊蓮的最適芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)基分別為Ms+2.0mg/L6-BA和Ms+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，其芽誘導(dǎo)率和生根率分另0為97.0%和95.5%，組培苗長勢好，移栽成活率達(dá)100%。本研究建立了半邊蓮快速高效的組織培養(yǎng)體系，為其資源的保存和利用提供了技術(shù)保障。

關(guān)鍵詞：半邊蓮；組織培養(yǎng)；芽誘導(dǎo)率；生根率

中圖分類號：S567.23⁺9+Q813.1⁺2 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0018-03

半邊蓮Lobelia chinensis是桔?？艭ampanu-laceae半邊蓮屬Lobelia多年生草本植物，具利尿消腫、清熱解毒之功效，常用于治療癰腫疔瘡、臌脹水腫、濕熱黃疸、濕疹濕瘡、蛇蟲咬傷等，民間有“識得半邊蓮，不怕同蛇眠”之說，是《中國藥典》2010年版收錄的常用中藥品種。半邊蓮又因其植株低矮、分枝多、葉密集、花形獨(dú)特、色澤艷麗、觀賞價值高而成為花壇、園林鑲邊、組合盆栽和觀賞草坪的常用植物。半邊蓮在《山東植物志》和《山東植物精要》中的記錄分布地區(qū)僅在肥城、臨沂和棗莊，通過微山縣的藥用植物調(diào)查發(fā)現(xiàn)濟(jì)寧為半邊蓮的新分布區(qū)域。由此可見，半邊蓮在山東省內(nèi)分布較稀少，值得對其進(jìn)行原地或遷地保護(hù)。半邊蓮的應(yīng)用價值被逐漸發(fā)掘，而其生長環(huán)境人為破壞嚴(yán)重致使野生資源匱乏，因此利用組織培養(yǎng)技術(shù)研究半邊蓮的離體繁殖和種質(zhì)保存就顯得尤為重要。近年來，有人對半邊蓮組織培養(yǎng)進(jìn)行了相關(guān)的研究，如阮淑明對半邊蓮頂芽和莖段進(jìn)行培養(yǎng)；譚興等利用TDZ誘導(dǎo)半邊蓮進(jìn)行離體快速繁殖；王廣軍以半邊蓮的莖段和葉片誘導(dǎo)愈傷得到再生植株。本試驗在前人研究基礎(chǔ)上簡化其培養(yǎng)過程，利用半邊蓮的頂芽和莖段在添加6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中成功培養(yǎng)后再移栽，建立了簡單、快速、高效的半邊蓮組織培養(yǎng)體系，可為工廠化大量繁殖半邊蓮植株提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

半邊蓮于2014年4月采自于微山縣薛河大橋東北側(cè)，并成功種植在曲阜師范大學(xué)植物學(xué)實(shí)驗室。選取長勢良好的半邊蓮頂芽和帶腋芽的莖段作為試驗材料。

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加3%的蔗糖、0.6%的瓊脂，pH值用1mol/L的NaOH調(diào)至5.8～6.0，高壓滅菌（1.1MPa、121℃）20min。培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照12h/d。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料消 毒取半邊蓮頂芽和帶腋芽的莖段，加適量洗潔精清洗后流水沖洗15min，置于超凈工作臺；70%乙醇消毒10s后無菌水沖洗2次，再用0.1%的升汞（HgCl₂）溶液消毒1min，期間不斷搖勻；最后用無菌水沖洗3～5次，每次2～3min，無菌濾紙吸干外植體表面的水分，頂芽切掉基部、莖段切成1.0cm左右備用。

1.2.2 初代和芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 經(jīng)消毒的外植體接種到MS初代培養(yǎng)基中，30d后接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30d后統(tǒng)計芽誘導(dǎo)率，芽誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100。每處理培養(yǎng)10瓶，每瓶4個外植體，重復(fù)3次，試驗結(jié)果為3次重復(fù)的平均值（下同）。

1.2.3 生根培養(yǎng) 將2～3cm左右的芽切下，移至生根培養(yǎng)基中，30d后統(tǒng)計生根率、根數(shù)量和根長。生根率（%）=（生根的芽數(shù)量/接種芽數(shù)量）×100。

1.2.4 馴化移栽 移栽前打開瓶蓋進(jìn)行煉苗，瓶內(nèi)加入少量自來水，在培養(yǎng)室內(nèi)放置2d。然后取出組培苗，洗凈根部的培養(yǎng)基，定植于含腐殖土的小容器中，適當(dāng)遮蔭保濕。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析和Duncans檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 半邊蓮的初代培養(yǎng)

在本研究中，半邊蓮?fù)庵搀w在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)即能使頂芽和腋芽萌發(fā)，10d左右外植體基部開始形成根系，30d左右即能形成4～5cm長的小苗。

2.2 6-BA對半邊蓮芽誘導(dǎo)的影響

為繁殖大量的組培苗，將半邊蓮初代培養(yǎng)的莖段接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表1）中，30d后統(tǒng)計誘導(dǎo)率。結(jié)果表明：三種培養(yǎng)基的芽誘導(dǎo)率都較高，并且都能使試管苗長高、增粗。MS+2.0mg/L6-BA培養(yǎng)基中的芽誘導(dǎo)率和試管苗高度顯著高于其它處理，芽誘導(dǎo)率達(dá)97.0%，平均苗長為4.7cm，并且能形成少量的根系（圖1A）。

2.3 生根培養(yǎng)

為得到根系生長良好的組培苗，在MS+2.0mg/L6-BA培養(yǎng)基中再添加不同濃度NAA使組培苗進(jìn)一步生根（表2），2周后統(tǒng)計根的生長狀態(tài)。結(jié)果表明：三種培養(yǎng)基的生根率都在90%以上，并且都能使根伸長。試管苗在MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA培養(yǎng)基中生根明顯優(yōu)于其它兩個處理，根的總體生長狀態(tài)最好，生根數(shù)量多，平均根長最長，達(dá)4.8cm（圖1B）。

2.4 移栽

在生根培養(yǎng)15d以后，每株試管苗都形成良好的根系，并且有白色的根毛，達(dá)到移栽標(biāo)準(zhǔn)。煉苗2d后，將試管苗基部的瓊脂清洗干凈再進(jìn)行移栽，適當(dāng)保濕和遮蔭，移栽成活率可達(dá)100%（圖1C）。

3 討論與結(jié)論

本研究采用半邊蓮的頂芽作為外植體時，更易于誘導(dǎo)產(chǎn)生組培苗，并且長勢更好，這可能是頂芽組織幼嫩、不含毒素、生長速度更快的原因。在園藝植物組培進(jìn)行脫毒苗的生產(chǎn)時大多利用植物的頂芽或莖尖作為外植體。

半邊蓮在MS基本培養(yǎng)基中能形成組培苗，說明半邊蓮在離體培養(yǎng)下較易成活，但在培養(yǎng)基中添加植物激素后，生長速度更快，組培苗長勢更好，提高了其繁殖效率。植物激素是植物組織器官分化的關(guān)鍵因素，形成器官的類型是由培養(yǎng)基中不同激素的相對濃度控制，而不是絕對濃度。6-BA是細(xì)胞分裂素，誘導(dǎo)芽的分化；NAA是生長素，促進(jìn)生根。前人研究結(jié)果表明，6-BA/NAA的比值高時有利于不定芽的分化，而比值低時有利于不定根的形成，本研究結(jié)果和前人結(jié)論相似，最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L6-BA，最佳生根培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。

半邊蓮的試管苗從無菌、營養(yǎng)好、光照和溫度適宜的條件轉(zhuǎn)移到自然條件下需經(jīng)歷一個煉苗的過程，使它們逐漸適應(yīng)外界環(huán)境，從而保證移栽的成活率。在保證空氣濕度以及適當(dāng)遮蔭條件下，成活率達(dá)100%。

本研究建立了半邊蓮快速高效的組織培養(yǎng)體系，從外植體到移栽成活整個周期為6周左右，繁殖速度快、繁殖系數(shù)高。半邊蓮組織培養(yǎng)體系的建立為其資源的保存和利用提供了技術(shù)保障，從而可以規(guī)模化地利用這一觀賞和藥用價值兼具的濕地植物。